针刺调节下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴稳定的分子机制研究

摘要

作为神经、内分泌调控部位的下丘脑是对应激信号和针刺信号发生反应的重要部位。大量的研究发现，持续应激能够严重影响人类的身心健康，诱发和加重疾病，其机制主要与下丘脑-垂体-肾上腺轴的活动亢进有关，而针刺对应激诱发糖皮质激素增高的下调作用也与其调节HPA轴有关。足三里穴是四大总穴之首，历代针灸学家研究的最多。针刺足三里对机体能够产生多种良性的双向的调节作用，这种调节作用是通过针刺信号激活神经内分泌系统后而产生的一系列生物变化。然而，针刺足三里是怎样对HPA轴调节的、其调节的分子机制是什么并不清楚。 鉴于下丘脑是HPA轴活动的最终共同通路，针刺信号和应激信号均能够引起下丘脑内促肾上腺激素释放激素(CRH)、精氨酸加压素(AVP)等神经肽类的改变。而CRH等基因的表达可以受到下丘脑室旁核内c-fos、c-jun即刻基因表达的调控。c-fos的转录激活又与丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)有关，所以应激过程中下丘脑p38MAPK的磷酸化程度以及c-fos蛋白的表达可能均会影响下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)的活动，参与针刺对HPA轴的调节作用。另一方面，海马是调节HPA轴的高级中枢之一，海马和下丘脑内GC的浓度直接影响到HPA轴的负反馈调节，海马和下丘脑局部GC的浓度受到神经细胞内糖皮质激素代谢酶11β-羟基类固醇脱氢酶1(11β-HSD1)的调节。所以，本试验针对HPA轴的调节过程中，以针刺足三里穴作为刺激信号，重点观察了(1)针刺对下丘脑内磷酸化p38MAPK的调节；(2)针刺对下丘脑内c-fos蛋白表达的调节；(3)针刺对海马、下丘脑11β-HSD1的调节。通过这些研究旨在探讨针刺调控HPA轴的分子机制，为针刺防治疾病提供更为有利的基础机制，为进一步研究开发防治应激性损伤的药物提供理论依据。 主要方法 1、采用激光共聚焦免疫荧光法，观察了下丘脑内p38MAPK与CRH的共存情况。 2、采用Western印迹杂交方法，观察了①空白对照组、束缚应激组、束缚应激加针刺足三里穴组下丘脑磷酸化p38MAPK的变化；②以上三组下丘脑内标志神经元激活的c-fos蛋白表达的变化情况。③下丘脑、海马内11β-HSD1蛋白表达的变化。 3、采用放射免疫法，观察了血浆内皮质酮的改变情况。 4、实验动物为Wistar大鼠，购于第二军医大学动物实验中心。 主要结果 1、针刺对束缚应激大鼠血浆内皮质酮浓度的影响 束缚应激结束后0、1h大鼠血浆内皮质酮浓度分别为49.1±9.3ng/ml、38.9±9.7ng/ml；与非应激对照组大鼠的(23.9±6.7ng/ml)相比，其差异具有显著性意义(p＜0.05)。针刺结束后0、1h其血浆皮质酮浓度分别为33.6±8.7ng/ml、27.5±7.8ng/ml，与应激组相比，0h的差异具有显著的统计学意义(α=0.10，p＜0.10)，1h的相比无统计学意义。 2、针刺对束缚应激大鼠下丘脑磷酸化p38MAPK的影响 Western印迹杂交结果显示束缚应激后下丘脑内磷酸化的p38MAPK明显增加，与对照组相比差别具有极显著性意义(p＜0.01)，应激解除后3h磷酸化的p38MAPK仍然保持较高的水平(p＜0.05)。针刺足三里穴并不导致下丘脑p38MAPK磷酸化的进一步增加，而是对其磷酸化产生下调作用，针刺结束后的各个时间点(0h、1h、3h)下丘脑内磷酸化p38MAPK均比束缚应激组显著下降(p＜0.05)。 3、下丘脑内p38MAPK与CRH的共存情况 免疫组织化学染色发现，大鼠束缚应激后，下丘脑神经元内，不仅有染成红色的磷酸化p38MAPK免疫反应物质表达，还有染成绿色的CRF免疫反应物质存在，而且磷酸化p38MAPK与CRF共存于同一个神经元的胞浆内。 4、针刺对束缚应激大鼠下丘脑c-fos蛋白表达的影响 束缚应激大鼠下丘脑内c-fos蛋白表达水平明显高于对照组(p＜0.01)。束缚应激大鼠经针刺足三里穴后下丘脑内c-fos蛋白与应激组相比明显回落，在针刺结束后的各个时间点(Oh、1h、3h)下丘脑内c-fos蛋白均比应激组有所下降，其差异均具有显著性意义(p＜0.05)。 5、针刺对束缚应激大鼠下丘脑、海马11β-HSD1蛋白表达的影响 束缚应激大鼠海马内11β-HSD1表达水平明显高于对照组(p＜0.05)，下丘脑内无明显变化。束缚应激大鼠经针刺足三里穴后下丘脑内11β-HSD1比应激组有增加趋势，在海马内11β-HSD1比应激组进一步增加，而且可以持续到针刺结束后1h(p＜0.05)。 结论 束缚应激能够引起大鼠血浆皮质酮浓度增加，针刺足三里穴可以下调应激引起的血浆皮质酮浓度的增加。针刺调节应激后下丘脑-垂体-肾上腺轴活动的分子机制一方面可能与其调节HPA轴的启动部位下丘脑内p38MAPK磷酸化和c-fos蛋白的表达有关；另一方面也与调节HPA轴的负反馈部位内下丘脑和海马内11β-HSD1蛋白的表达有关。尽管针刺对不同部位、不同物质的调节作用有所不同，但是其最终的调节功能和方向是一致的。 第一部分：应激后大鼠下丘脑p38MAPK的变化及电针足三里穴的调节作用 目的:观察应激对大鼠下丘脑p38MAPK的影响及电针足三里穴的调节作用。方法:将大鼠随机分为对照组、束缚应激组、束缚应激加针刺组，用Western印迹杂交法观察三组大鼠下丘脑内磷酸化p38MAPK的变化。结果:大鼠束缚应激血浆皮质酮增加，针刺后有所下降，束缚应激时下丘脑内p38MAPK磷酸化水平明显高于对照组，且在束缚应激解除后3小时仍保持较高水平，应激大鼠经针刺足三里穴后下丘脑内磷酸化p38MAPK与应激组相比明显回落，针刺的这种调节作用也可持续到针刺结束后3小时。结论:束缚应激能够引起下丘脑应激信号转导系统p38MAPK磷酸化的增加，磷酸化的p38MAPK可能是应激活动过程中的重要事件之一。针刺足三里穴对下丘脑内磷酸化p38MAPK的调节作用可能与调节下丘脑-垂体-肾上腺轴的活动有关。 第二部分：电针对束缚应激大鼠下丘脑神经元活化的调节作用 目的:观察应激大鼠下丘脑神经元的活化程度，以及电针足三里穴对它的调节作用。方法:将大鼠随机分为对照组、束缚应激组、束缚应激加针刺组，以标志神经元活化的c-fos蛋白作为检测指标，用Western印迹杂交法观察三组大鼠下丘脑内c-fos蛋白的变化。结果:束缚应激大鼠下丘脑内c-fos蛋白表达水平明显高于对照组(p＜0.01=。束缚应激大鼠经针刺足三里穴后下丘脑内c-fos蛋白与应激组相比明显回落，在针刺结束后的各个时间点(Oh、1h、3h)下丘脑内c-fos蛋白均比应激组有所下降，其差异均具有显著性意义(p＜0.05)。结论:束缚应激能够引起下丘脑c-fos蛋白的表达增加，针刺足三里穴能够下调下丘脑c-fos蛋白的表达水平，针刺可能在预防应激性疾病中具有重要作用。 第三部分：针刺对应激后大鼠下丘脑和海马11β-羟基类固醇脱氢酶1的调节 目的:观察应激大鼠海马、下丘脑11β-羟基类固醇脱氢酶1(11β-HSD1)的表达变化，以及电针足三里穴对它的调节作用。方法:将大鼠随机分为对照组、束缚应激组、束缚应激加针刺组，用Western印迹杂交法观察三组大鼠海马、下丘脑内11β-HSD1的变化。结果:束缚应激大鼠海马内11β-HSD1表达水平明显高于对照组(p＜0.05)，下丘脑内无明显变化。束缚应激大鼠经针刺足三里穴后下丘脑内11β-HSD1比应激组有增加趋势，在海马内11β-HSD1比应激组进一步增加，而且可以持续到针刺结束后1h(p＜0.05)。结论:针刺足三里穴能够促进海马、下丘脑11β-HSD1的表达，其表达增加可能与HPA轴的负反馈调节有关。

目录

ABBREVIATIONS

摘要

主要试剂配制和仪器

研究背景

第一部分：应激后大鼠下丘脑p38MAPK的变化及电针足三里穴的调节作用

第二部分：电针对束缚应激大鼠下丘脑神经元活化的调节作用

第三部分：针刺对应激后大鼠下丘脑和海马11β-羟基类固醇脱氢酶1的调节

综述：针刺对神经内分泌轴调节的研究进展

致 谢

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