逆转录病毒载体介导的IL-1Ra和TGF-β1联合基因转染治疗兔膝骨关节炎的研究

摘要

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种退行性关节疾病，多发于老年人群，严重影响了人们的生活质量，且需消耗大量的个人及社会财力。国内的统计资料表明，我国患有OA的人数占总人口的3％，其中大部分为膝OA，55岁以上人群X线有膝OA表现者约60％，65岁以上老年人OA的发病率可达85％，75岁以上的老年人中每人都有至少一个关节有OA变化。目前，传统的药物治疗和外科手段对OA的疗效有限，且无法阻止OA的进一步发展，近年来基因治疗为OA的防治开辟了一条新途径，受到越来越多的重视。将功能基因片段整合到基因载体内，再将基因载体转染入靶细胞中或转染入关节腔内，通过转基因的靶细胞持续大量分泌功能基因产物，在一个较长的时期保持局部治疗浓度，由于OA病变主要累及少数负重关节，因此适合应用关节内局部基因治疗。在临床应用基因治疗OA之前，我们有必要在细胞实验和动物实验中确证哪些基因或基因的组合会对OA产生更好的治疗效果，目前已有许多研究以表明基因疗法对OA的有效性，并且多基因联合治疗OA效果好于单基因，在本实验中，我们利用重组人IL-1Ra(一种很重要的拮抗基因)和TGF—β1(一种很重要的保护基因)基因从促进软骨基质合成和抑制软骨基质降解两个层面联合转染治疗OA。 第一部分联合基因转染兔膝软骨细胞及对其增值代谢的影响 目的:观察以逆转录病毒为载体，介导白介素-1受体拮抗蛋白(IL-1Ra)基因与转化生长因子—β1(TGF—β1)基因共转染兔膝软骨细胞后的表达，及对其增殖代谢的影响。 方法:将体外培养的软骨细胞分为空白转染组、空载体转染组、IL-1Ra单基因转染组、TGF—β1单基因转染组及IL-1Ra和TGF—β1双基因转染组。酶联免疫吸附分析法(ELISA)进行瞬时基因表达(细胞转染后48h)及稳定基因表达(筛选第4w)的检测；免疫组织化学染色法检测各组IL-1Ra、TGF—β1及Ⅱ型胶原的表达；流式细胞仪检测各组细胞生长周期比例。 结果:空白组与PLNCX2空载体转染组的上述指标差异无显著性(P＞0.05)；ELISA检测显示基因转染组有明显基因表达；与空白组及PLNCX2空载体转染组相比，双基因转染组IL-1Ra、TGF—β1、Ⅱ型胶原含量明显提高(P＜0.05)，IL-1Ra单基因转染组IL-1Ra含量提高明显，TGF—β1单基因转染组TGF—β1、Ⅱ型胶原含量提高明显；基因转染组软骨细胞位于S期的比例增高明显，与空白组比较差异有显著性(P＜0.05)。 结论:基因转染软骨细胞后可获得稳定表达，IL-1Ra+TGF—β1双基因转染的软骨细胞生物学活性优于两者中的任一单基因转染，为基因治疗骨关节炎的研究提供实验基础。 第二部分联合基因转染治疗兔膝骨关节炎的研究 目的:观察白细胞介素-1受体拮抗蛋白(IL-1Ra)与转化生长因子—β1(TGF—β1)双基因转染在关节中的表达及对骨关节炎的治疗效果。 方法:以逆转录病毒为载体，体外转染同种异体原代软骨细胞，将转染了外源基因的软骨细胞注射入兔膝关节腔。前交叉韧带切断法(ACLT)制成新西兰白兔膝关节OA模型，共30只，随机分为5组，Ⅰ组为空白对照组，Ⅱ组为手术对照组，Ⅲ组为IL-1Ra转染组，Ⅳ组为TGF—β1转染组，Ⅴ组为IL-1Ra和TGF—β1双基因转染组。外源基因注射后第4周与第8周，用PBS灌洗兔膝关节，ELISA分析转基因表达，硝酸还原法检测膝关节液中NO含量，取关节标本进行Mankin’s评分，阿尔辛蓝—过碘酸雪夫试剂(AB—PAS)染色，TGF—β1、IL-1Ra及Ⅱ型胶原免疫组化、原位杂交检测。 结果：ELISA检测显示在第4周基因转染组有明显的基因表达，第8周基因表达减弱；手术对照组软骨损伤程度最大，Mankin’s评分明显高于其他组；TGF—β1、IL-1Ra及Ⅱ型胶原免疫组化染色，手术对照组灰度值低于其他组，单基因转染组灰度值低于双基因转染组，8周时各对应组灰度值较4周有明显下降。 结论:以逆转录病毒为载体将转染了外源基因的软骨细胞转入骨关节炎关节内，可获得稳定的外源基因表达，TGF—β1和IL-1Ra可有效阻止OA的进一步发展，且联合基因治疗OA效果优于两者中任一单基因，外源基因表达具有时效性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文对照简表

声明

第一部分 联合基因转染兔膝软骨细胞及对其增值代谢的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附图、表

第二部分 联合基因转染治疗兔膝骨关节炎的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附图、表

综述 关节软骨损伤与修复

致谢