刺参（Apostichopus japonicus）感染两种病原菌前后体内凝集素的分离纯化与性质研究

摘要

凝集素(lectin)是一类具有糖专一性，可促使细胞凝集的蛋白质或糖蛋白，其研究历史已有一百多年。凝集素可与生物体内大量功能各异的糖复合物结合，形成一系列生物学功能。在动物和植物体内，凝集素又有一些不同的功能。凝集素的独特的生物学功能为其应用开辟了广阔的前景。早期对凝集素的研究多集中于高等植物。2001年，Yeaton在103种无脊椎动物体内发现了凝集素的存在，并推断在所有无脊椎动物体内可能都有凝集素。凝集素除了存在于甲壳动物、软体动物等无脊椎动物的血清中，也常常吸附在血细胞的细胞膜上。 刺参(Apostichopus japonicus)属于棘皮动物门(Echinodermata)海参纲(Holothuroidea)楯手目(Aspidochirota)刺参科(Stichopodidae)仿刺参属(Apostichopus)。刺参为温带种，在我国主要分布于辽宁、河北、山东和江苏等沿海省份。刺参营养丰富，体壁含有丰富的胶原成分和蛋白聚糖，还含有大量的黏蛋白及多种氨基酸。最近有研究证明刺参含有防衰老的酸性粘多糖(硫酸软骨素)，具有较广的抗肿瘤及抗凝血的作用，并具有增强机体免疫功能的作用，是一种药用价值极高的海洋生物。 刺参作为一种无脊椎动物，一般认为缺少适应性免疫，其“非己”识别免疫功能存在于某些特性的、可溶的或与细胞膜结合的模式识别受体(pattem recognition receptors，PRRs)，也成为模式识别蛋白(pattern recognition proteins，PRPs)或模式识别分子(pattern recognition molecules，PRMs)，这种模式识别受体就包含凝集素。因此，凝集素在刺参体内起着重要的免疫功能。当刺参受到病原及其它外界条件影响时，体内产生免疫反应，因此其体内凝集素的量必将与正常状况下有所不同。 20世纪80年以来，我国的海水养殖业逐渐振兴并发展迅速，鱼类、海珍品类的增养殖进入快速发展时期。刺参人工育苗，年产量猛增数千万头，刺参增养殖在山东、辽宁等地初具规模。随着国内刺参养殖业的迅速发展，养殖面积的迅速扩张以及集约化养殖方式下的不规范操作，养殖过程中相继出现一系列病害问题，给刺参养殖业带来了巨大的损失。 刺参“烂皮病”因其高传染性、高死亡率成为刺参养殖病害研究的重点。其发病特征一般为：感染初期刺参口部先出现感染症状，表现为围口膜松弛，触手对外界刺激反应迟钝，继而出现排脏现象；感染中期刺参身体收缩、僵直，口腹部出现小面积溃疡，形成蓝白色小斑点，逐渐丧失摄食能力；感染末期刺参的病灶变大，溃疡处增多，表皮腐烂面积变大，最后导致刺参死亡，溶化成鼻涕状胶体。 本文利用本实验室已分离出的两种刺参烂皮病病原菌(Tenacibaculum属和Vibrionales属)对健康个体进行感染，分别分离纯化其凝集素，利用动物的红细胞对对其凝集素的凝集活性分别进行检测，并进行分子量、含糖量、最适pH、耐热性等性质的研究，以期为刺参的免疫机制研究及药用研究提供科学的数据参考。 研究方法及结果为：刺参经磷酸盐缓冲溶液抽提，20％～75％硫酸铵分级沉淀，DEAE-Sepharose F.F.和Sephadex G-100柱层析，得到刺参凝集素(AJL)。经SDS-PAGE显示单一条带，亚基相对其分子量为31000。分别提取感染Tenacibaculum属和Vibrionales属病原菌的刺参凝集素，感染Tenacibaculum属病菌刺参的凝集素产量较大，但凝集兔红细胞的作用均不被D-果糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、棉子糖所抑制，而仅被牛甲状腺球蛋白所抑制，其中，感染Tenacibaculum属病菌刺参的凝集素更易受到牛甲状腺球蛋白的抑制。凝集兔红细胞的作用均不被二价金属离子Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+及EDTA所抑制。在pH 4.0～10.14系列缓冲液中均有活性，其中在pH 4.4～7.5范围内血凝性最高。该凝集活性在90℃加热30min后仍然对红细胞有凝集活性，显示出较高的热稳定性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1凝集素研究现状

1.1凝集素简介

1.2凝集素的分布

1.3凝集素的结构

1.4凝集素的分类

1.5凝集素的特性

1.6凝集素在生物学研究中的应用

2刺参研究现状

2.1海参简介

2.2刺参简介

2.3刺参养殖业及其对生态环境的影响

2.4刺参养殖业病害问题

3研究目的和意义

第二章致病菌感染实验

1实验材料与方法

1.1实验材料

1.2实验仪器设备

1.3实验药品

1.4培养基配方

1.5制备菌悬液

1.6准备致病菌感染场所

1.7刺参的前处理

1.8加入菌悬液

1.9观察记录

2实验结果及讨论

2.1致病菌感染健康刺参

2.2讨论

3小结

第三章刺参凝集素(AJL)的分离纯化与性质鉴定

1实验材料与方法

1.1实验材料

1.2实验仪器设备

1.3实验药品

1.4可溶性蛋白质浓度测定

1.5凝集素活力测定方法

1.6凝集素纯化鉴定路线

1.7凝集素分离纯化

1.8凝集素性质鉴定

2实验结果及讨论

2.1实验结果

2.2凝集素纯化方法讨论

2.3关于凝集素性质鉴定

2.4制备红细胞悬液的注意事项

3小结

ChapterⅠ Literature Review

Chapter ⅡInfect Apostichopus japonica by two pathogens

Chapter Ⅲ Isolation，purification and properties of lectins from Apostichopus japonicus

参考文献

附录 本文所用缩写词

致谢

攻读硕士学位期间发表学术论文