L-异亮氨酸

摘要： 旨在选育L-异亮氨酸高产大肠杆菌。以大肠杆菌K12(Met^(-))为出发菌株,经常温常压等离子体(ARTP)诱变,通过微生物高通量液滴培养系统(MMC)筛选,以α-氨基丁酸(α-AB)抗性为筛选标记,得到一株高产L-异亮氨酸的突变菌株大肠杆菌NXU12,并对其遗传稳定性进行了研究。结果表明,出发菌株大肠杆菌K12(Met^(-))经过ARTP诱变处理180 s后,通过单因素多水平实验、适应性进化实验、发酵培养复筛、遗传稳定性验证等选育出一株高产L-异亮氨酸诱变大肠杆菌NXU12。该菌株在发酵培养40 h后,L-异亮氨酸产量达到17.462 8 g/L,比原始菌株10.830 9 g/L提高61.23%,且遗传性状稳定。

摘要： L‑异亮氨酸属于三大支链氨基酸,是人体8种必需氨基酸之一,广泛应用于食品、药品、保健品、化妆品等领域。目前,微生物发酵法是工业生产L‑异亮氨酸的主要方法,其中谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)是发酵生产L‑异亮氨酸的优势菌株,然而随机诱变会使产量的提高能力达到饱和,难以得到更加高产的菌株,因此针对诱变菌株进行理性改造已成为进一步提高产量的主要方式;且随着遗传操作技术在谷氨酸棒杆菌中的应用与优化,代谢工程育种已逐渐取代传统的诱变育种。综述了谷氨酸棒杆菌中L‑异亮氨酸的生物合成途径、代谢调控机制和理性改造L‑异亮氨酸生产菌株的策略,并对辅助因子工程应用于理性改造及对谷氨酸棒杆菌基因组整合策略进行了系统阐述,以期为工业水平稳定生产L‑异亮氨酸高产菌株的基因组整合策略提供参考依据。

摘要： L-异亮氨酸属于分支链氨基酸,是一种生糖兼生酮氨基酸,为人体8种必需氨基酸之一,广泛应用于医药、化妆品、食品等诸多领域.工业化生产L-异亮氨酸主要采用谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌发酵法合成.该文分析比较了谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌L-异亮氨酸的生物合成途径及代谢调控机制;尽管二者代谢途径相同,但关键酶多样性及其调控方式存在差异;在此基础上,从解除关键酶反馈抑制作用、切断或弱化支路代谢途径、修饰转运系统以及增强辅助因子的供应4个层面综述了L-异亮氨酸及衍生物代谢工程改造策略,旨在为其生产菌株的选育提供参考.

摘要： 为解决谷氨酸棒杆菌发酵产异亮氨酸适应期较长,菌体细胞膜通透性差,异亮氨酸分泌速率慢的问题,实验通过在发酵罐内安装超声棒,探究超声对谷氨酸棒杆菌整个发酵过程中生物量及产酸的影响.研究从超声周期、超声功率、超声频率、超声时间和超声模式5个方面,探究了菌体生物量及产酸的最优条件.结果 表明,使用80 W/L、18 kHz的超声波,在菌体适应期、对数生长期及平稳期分别超声2、6、1 h,超声模式设置为开10 s、停30 s,菌体发酵适应阶段缩短至2 h以内,菌体快速进入对数生长期,且对数生长期从2 h延续到24 h,直至40 h结束菌体活力依旧很强,最终菌体干重达到了41.0 g/L,比未超声提高了74.5％;L-异亮氨酸产量达到了39.0 g/L,比未超声产酸量提升了69.6％.超声产生的微扰动有利于细胞增殖,同时产生的机械剪切作用增加了细胞膜的通透性,提高了产酸能力.

摘要： 在谷氨酸棒杆菌发酵产L-异亮氨酸的过程中,发酵后期菌体活力变弱,副产物增多,是限制L-异亮氨酸产业化的主要因素.研究通过3个阶段全营养流加策略探究最适发酵条件.首先,为解决L-异亮氨酸发酵中后期菌种活力下降的问题,实验通过利用发酵中后期全营养培养基流加策略,使得L-异亮氨酸达到了33.0 g/L.其次,为了解决初始发酵培养基高营养抑制问题,采用低浓度初始发酵培养基偶联发酵过程流加全营养控制策略,L-异亮氨酸达到了36.8 g/L.最后,由于玉米浆的高用量造成发酵染菌、起泡过多及后提取困难等产生的问题,通过清洁氮源丝肽粉等比例替换玉米浆全营养流加实验,使得副产物缬氨酸(valine,Val),亮氨酸(leucine,Leu),丙氨酸(alanine,Ala)分别降低到1.4、0.8、0.5 g/L,比初始降低了82.5％、86.7％和88.9％.通过上述3个阶段全营养流加策略,使得L-异亮氨酸产量提升的同时,副产物生成也得到有效的抑制.

摘要： L-异亮氨酸作为必需氨基酸具有多种生理功能,对人体和动物健康有重要的调节作用.微生物发酵是工业生产L-异亮氨酸的主要方式,而谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)是L-异亮氨酸发酵生产的主要菌株,主要通过筛选和随机诱变得到,其遗传背景不明且很难通过诱变进一步提高产量,因而通过代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸成为近年来研究热点.该文综述了近年来代谢工程改造谷氨酸棒杆菌促进L-异亮氨酸生物合成的相关研究,主要涉及代谢通量调控、解除反馈抑制、强化还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)水平以及提高产物分泌能力等方面,对进一步改造菌株和促进L-异亮氨酸发酵合成具有一定的参考意义.

摘要： 过去氨基酸分析必须应用价格昂贵的专一的氨基酸分析仪,近几年来越来越多的人应用高效液相进行氨基酸定量分析。建立一种测定酮酸制备过程中,5种氨基酸原料L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-蛋氨酸的液相分析方法。以乙腈-磷酸氬二胺水溶液为流动相,采用HPLC对氨基酸进行含量测定。当乙睛~50Mm磷酸氣二胺水溶液(pH=2.6)=73:27,最适检测波长205nm。经验证,本方法的线性关系良好,其中L-亮氨酸R^(2)=1.L-缬氨酸R^(2)=1.L-异亮氨酸R^(2)=1、L-苯丙氨酸R^(2)=0.9997.L-蛋氨酸R^(2)=0.9996。本方法具有操作便捷、结果准确的特点,且重复性好,适用于氨基酸的快速定量测定。

摘要： 过去氨基酸分析必须应用价格昂贵的专一的氨基酸分析仪,近几年来越来越多的人应用高效液相进行氨基酸定量分析.建立一种测定酮酸制备过程中,5种氨基酸原料L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-蛋氨酸的液相分析方法.以乙腈-磷酸氢二胺水溶液为流动相,采用HPLC对氨基酸进行含量测定.当乙腈-50Mm磷酸氢二胺水溶液(pH=2.6)=73:27,最适检测波长205nm.经验证,本方法的线性关系良好,其中L-亮氨酸R2=1、L-缬氨酸R2=1、L-异亮氨酸R2=1、L-苯丙氨酸R2=0.9997、L-蛋氨酸R2=0.9996.本方法具有操作便捷、结果准确的特点,且重复性好,适用于氨基酸的快速定量测定.

摘要： 通过动态调节葡萄糖对谷氨酸棒杆菌的供应速率,解决菌种在发酵产L-异亮氨酸不同时期对葡萄糖消耗能力差异的问题.实验结果表明,以谷氨酸棒杆菌YILM1504为供试菌株,在发酵初始葡萄糖添加量80 g/L、90％最大补糖速率的亚适量补糖工艺下,得到动态补糖速率为0(0～8 h)、5.40～7.47(8～14 h)、7.47～7.00(16～24 h)、7.00～5.20 g/(L·h)(24～40 h),L-异亮氨酸达到44.32 g/L,糖酸转化率为 19.63％.经代谢流对比分析发现,葡萄糖经戊糖磷酸途径和糖酵解途径代谢流之比为0.56,进入Ile的代谢流增强了 18.92％,进入缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸的代谢流减弱了67.12％、72.21％、30.23％,该方法针对谷氨酸棒杆菌在细胞生长阶段与产酸阶段不同的耗糖能力,提供了精细的补糖速率策略,产酸高峰期明显延长,副产物积累比例得到降低,原料利用率大幅提升.

摘要： 4-羟基异亮氨酸(4-HIL)是一种很有前景的药物,它具有促进胰岛素分泌、改善外周组织对胰岛素的抵抗性和调节血脂异常等作用,而L-异亮氨酸羟化酶(IDO)常用于4-HIL的生产.首先,克隆了苏云金芽孢杆菌来源的L-异亮氨酸羟化酶,实现了其在E.coli BL21 (DE3)中的异源表达.其次,通过同源建模和蛋白质结构分析,本着将与底物氨基酸侧链结合的氨基酸残基从亲水性或长链疏水性结构突变成丙氨酸Ala的原则,对I156位点进行了定点突变,以增大底物结合口袋,扩宽底物通道进而提高4-HIL的产量.最后,对野生酶及突变酶的酶学性质、突变酶的羟基化反应体系进行研究,在最优催化条件下,分批补料转化底物进行4-HIL的生产.酶学性质结果显示,野生酶及突变酶I156A的最适温度均为25°C,最适pH均为7.0;突变酶I156A比酶活比野生酶提高了1.9倍,L-ILe转化率提高了28％.羟基化反应体系的最优转化条件为:20 mmol/L L-ILe,20 mmol/L α-酮戊二酸,8 mmol/L Fe2+,30 mmol/L抗坏血酸和HEPES(50 mmol/L,pH 7.0)缓冲液.在最优转化条件下,重组菌F.coli BL21/pET28a-idonI156A进行分批补料转化底物,时间间隔为4h,32 h后得到77.3 mmol/L 4-HIL,底物最高转化率98.35％.

摘要： 本研究对奇异变形杆菌Proteus mirabilis中的L-氨基酸脱氨酶进行定向进化,利用易错PCR技术向基因中引入随机突变,建立突变文库来筛选可获得较高α-酮-β-甲基正戊酸产量的突变株.突变株7/23-6最适全细胞转化反应条件是以pH8.5Tris-HCl为缓冲液,用900mM L-异亮氨酸在30°C下进行催化反应,其α-酮-β-甲基正戊酸产量可以达到102g/L,底物转化率达到87％.与对照菌相比,其α-酮-β-甲基正戊酸产量和底物转化率均提高了13％,热稳定性提高了36.7％.

摘要： 本研究对奇异变形杆菌Proteus mirabilis中的L-氨基酸脱氨酶进行定向进化,利用易错PCR技术向基因中引入随机突变,建立突变文库来筛选可获得较高α-酮-β-甲基正戊酸产量的突变株.突变株7/23-6最适全细胞转化反应条件是以pH8.5Tris-HCl为缓冲液,用900mM L-异亮氨酸在30°C下进行催化反应,其α-酮-β-甲基正戊酸产量可以达到102g/L,底物转化率达到87％.与对照菌相比,其α-酮-β-甲基正戊酸产量和底物转化率均提高了13％,热稳定性提高了36.7％.

摘要： 本研究对奇异变形杆菌Proteus mirabilis中的L-氨基酸脱氨酶进行定向进化,利用易错PCR技术向基因中引入随机突变,建立突变文库来筛选可获得较高α-酮-β-甲基正戊酸产量的突变株.突变株7/23-6最适全细胞转化反应条件是以pH8.5Tris-HCl为缓冲液,用900mM L-异亮氨酸在30°C下进行催化反应,其α-酮-β-甲基正戊酸产量可以达到102g/L,底物转化率达到87％.与对照菌相比,其α-酮-β-甲基正戊酸产量和底物转化率均提高了13％,热稳定性提高了36.7％.

摘要： 本研究对奇异变形杆菌Proteus mirabilis中的L-氨基酸脱氨酶进行定向进化,利用易错PCR技术向基因中引入随机突变,建立突变文库来筛选可获得较高α-酮-β-甲基正戊酸产量的突变株.突变株7/23-6最适全细胞转化反应条件是以pH8.5Tris-HCl为缓冲液,用900mM L-异亮氨酸在30°C下进行催化反应,其α-酮-β-甲基正戊酸产量可以达到102g/L,底物转化率达到87％.与对照菌相比,其α-酮-β-甲基正戊酸产量和底物转化率均提高了13％,热稳定性提高了36.7％.

摘要： 本研究对奇异变形杆菌Proteus mirabilis中的L-氨基酸脱氨酶进行定向进化,利用易错PCR技术向基因中引入随机突变,建立突变文库来筛选可获得较高α-酮-β-甲基正戊酸产量的突变株.突变株7/23-6最适全细胞转化反应条件是以pH8.5Tris-HCl为缓冲液,用900mM L-异亮氨酸在30°C下进行催化反应,其α-酮-β-甲基正戊酸产量可以达到102g/L,底物转化率达到87％.与对照菌相比,其α-酮-β-甲基正戊酸产量和底物转化率均提高了13％,热稳定性提高了36.7％.

摘要： 本研究对奇异变形杆菌Proteus mirabilis中的L-氨基酸脱氨酶进行定向进化,利用易错PCR技术向基因中引入随机突变,建立突变文库来筛选可获得较高α-酮-β-甲基正戊酸产量的突变株.突变株7/23-6最适全细胞转化反应条件是以pH8.5Tris-HCl为缓冲液,用900mM L-异亮氨酸在30°C下进行催化反应,其α-酮-β-甲基正戊酸产量可以达到102g/L,底物转化率达到87％.与对照菌相比,其α-酮-β-甲基正戊酸产量和底物转化率均提高了13％,热稳定性提高了36.7％.

摘要： 研究了表面活性剂Tween-60和Tween-80对谷氨酸棒状杆菌生长和L-异亮氨酸发酵的影响,在此基础上,进一步研究了5L发酵罐中Tween-80的添加对L-异亮氨酸发酵的影响.研究结果表明:摇瓶分批发酵时,当Tween-60和Tween-80初始浓度分别高于1.5g/L、2.0g/L时,对菌体生长抑制明显,发酵对数期中后期(18 h)添加Tween-80单位细胞产酸的能力提高13.3％. 5L发酵罐结果表明,Tween-80的添加利于提高单位细胞产酸能力;18h添加可使L-异亮氨酸产量提高到26.43g/L,增加了10.6％.本研究结果为进一步提高发酵法生产分支链氨基酸提供了一定的借鉴.

摘要： 研究了表面活性剂Tween-60和Tween-80对谷氨酸棒状杆菌生长和L-异亮氨酸发酵的影响,在此基础上,进一步研究了5L发酵罐中Tween-80的添加对L-异亮氨酸发酵的影响.研究结果表明:摇瓶分批发酵时,当Tween-60和Tween-80初始浓度分别高于1.5g/L、2.0g/L时,对菌体生长抑制明显,发酵对数期中后期(18 h)添加Tween-80单位细胞产酸的能力提高13.3％. 5L发酵罐结果表明,Tween-80的添加利于提高单位细胞产酸能力;18h添加可使L-异亮氨酸产量提高到26.43g/L,增加了10.6％.本研究结果为进一步提高发酵法生产分支链氨基酸提供了一定的借鉴.

摘要： 研究了表面活性剂Tween-60和Tween-80对谷氨酸棒状杆菌生长和L-异亮氨酸发酵的影响,在此基础上,进一步研究了5L发酵罐中Tween-80的添加对L-异亮氨酸发酵的影响.研究结果表明:摇瓶分批发酵时,当Tween-60和Tween-80初始浓度分别高于1.5g/L、2.0g/L时,对菌体生长抑制明显,发酵对数期中后期(18 h)添加Tween-80单位细胞产酸的能力提高13.3％. 5L发酵罐结果表明,Tween-80的添加利于提高单位细胞产酸能力;18h添加可使L-异亮氨酸产量提高到26.43g/L,增加了10.6％.本研究结果为进一步提高发酵法生产分支链氨基酸提供了一定的借鉴.

摘要： 研究了表面活性剂Tween-60和Tween-80对谷氨酸棒状杆菌生长和L-异亮氨酸发酵的影响,在此基础上,进一步研究了5L发酵罐中Tween-80的添加对L-异亮氨酸发酵的影响.研究结果表明:摇瓶分批发酵时,当Tween-60和Tween-80初始浓度分别高于1.5g/L、2.0g/L时,对菌体生长抑制明显,发酵对数期中后期(18 h)添加Tween-80单位细胞产酸的能力提高13.3％. 5L发酵罐结果表明,Tween-80的添加利于提高单位细胞产酸能力;18h添加可使L-异亮氨酸产量提高到26.43g/L,增加了10.6％.本研究结果为进一步提高发酵法生产分支链氨基酸提供了一定的借鉴.

摘要： 本发明涉及一种4‑羟基异亮氨酸的合成方法，该方法筛选出异亮氨酸羟基化酶基因，并构建重组表达质粒，表达具有氨基酸脱氨酶跨膜区和异亮氨酸羟基化酶融合蛋白，使得异亮氨酸羟基化酶锚定在细胞表面，然后使用完整细胞催化工艺替代冻融破碎细胞工艺，免去细胞冷冻工艺从而无需冷冻处理设备，同时避免因细胞破碎后其内含物扩散至反应液中导致的产物分离困难，简化生产程序并大幅度降低能耗和物耗以及生产成本，利用本方法生产4‑羟基异亮氨酸转化率高达99.0％以上，更加利于工业化生产。

摘要： 本发明公开了一种异亮氨酸双加氧酶及其突变体，编码所述异亮氨酸双加氧酶的基因，含有该基因的重组表达质粒和重组表达转化体，异亮氨酸双加氧酶及其突变体的制备方法，以及利用异亮氨酸双加氧酶合成4‑羟基异亮氨酸的方法。与合成4‑羟基异亮氨酸的其它方法相比，使用本发明的异亮氨酸双加氧酶催化制备4‑羟基异亮氨酸的工艺，不仅底物浓度大、转化率高，而且反应条件温和，操作简便，易于放大，具有工业应用价值。

摘要： 本发明涉及具有生产L‑异亮氨酸的增强能力的微生物和使用该微生物生产L‑异亮氨酸的方法。更具体地，本发明涉及谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)突变菌株，其耐受L‑异亮氨酸和L‑苏氨酸衍生物并具有生产L‑异亮氨酸的增强的能力，并且涉及使用突变菌株生产L‑异亮氨酸的方法。

摘要： 本发明涉及异亮氨酸羟化酶突变体及在(2S,3R,4S)‑4‑羟基异亮氨酸合成中的应用。该异亮氨酸羟化酶突变体是将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第38位、56位、88位、123位、135位、138位、155位、162位、176位、179位、182位、196位、205位、226位、228位、234位和236位氨基酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其它氨基酸残基所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质。与野生型异亮氨酸羟化酶相比，本发明所述异亮氨酸羟化酶突变体对底物异亮氨酸的活力有大幅度提高，所述异亮氨酸羟化酶突变体可用于高效制备糖尿病治疗药物(2S,3R,4S)‑4‑羟基异亮氨酸，具有很好的工业应用前景。

摘要： 本发明公开了一种异亮氨酸双加氧酶及其突变体，编码所述异亮氨酸双加氧酶的基因，含有该基因的重组表达质粒和重组表达转化体，异亮氨酸双加氧酶及其突变体的制备方法，以及利用异亮氨酸双加氧酶合成4‑羟基异亮氨酸的方法。与合成4‑羟基异亮氨酸的其它方法相比，使用本发明的异亮氨酸双加氧酶催化制备4‑羟基异亮氨酸的工艺，不仅底物浓度大、转化率高，而且反应条件温和，操作简便，易于放大，具有工业应用价值。

摘要： 本申请涉及具有L‑异亮氨酸生产能力和包含具有柠苹酸合成酶活性的蛋白质的棒状杆菌属某种微生物，和通过使用其生产L‑异亮氨酸的方法。

摘要： 本发明涉及一种4‑羟基异亮氨酸的合成方法，该方法筛选出异亮氨酸羟基化酶基因，并构建重组表达质粒，表达具有氨基酸脱氨酶跨膜区和异亮氨酸羟基化酶融合蛋白，使得异亮氨酸羟基化酶锚定在细胞表面，然后使用完整细胞催化工艺替代冻融破碎细胞工艺，免去细胞冷冻工艺从而无需冷冻处理设备，同时避免因细胞破碎后其内含物扩散至反应液中导致的产物分离困难，简化生产程序并大幅度降低能耗和物耗以及生产成本，利用本方法生产4‑羟基异亮氨酸转化率高达99.0％以上，更加利于工业化生产。

摘要： 本发明涉及具有生产L-异亮氨酸的增强能力的微生物和使用该微生物生产L-异亮氨酸的方法。更具体地，本发明涉及谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium？glutamicum)突变菌株，其耐受L-异亮氨酸和L-苏氨酸衍生物并具有生产L-异亮氨酸的增强的能力，并且涉及使用突变菌株生产L-异亮氨酸的方法。

摘要： 一种从异亮氨酸液中分离提纯异亮氨酸的方法，属于模拟移动床分离技术领域。本发明先合成用于专门吸附分离异亮氨酸的两种特种树脂：金属离子型螯合树脂和酸根离子型螯合树脂；再采用装有上述特种树脂中的一种的固定床使用模拟移动床技术，从异亮氨酸液中分离提纯，获得纯净的异亮氨酸产品；本发明采用移动床连续色谱分离基本实现异亮氨酸与蛋白质、糖、色素、无机盐、杂氨基酸之间的完全分离；树脂利用率高；生产过程全自动化，劳动强度低，生产场地小；生产成本低，分离每立方米异亮氨酸液，仅需要1～2m3水和少量电；生产过程中不使用任何化学品，没有任何污染产生。

摘要： 本发明提供了同时检测血液中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸含量的方法，该方法包括：利用高效液相串联质谱仪和PFP色谱柱分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，各标准溶液中均含有浓度已知的各支链氨基酸的标准品及内标物；根据各个标准溶液的色谱图拟合得到各支链氨基酸的标准曲线方程；将混合内标工作液添加到经处理至少0.2mL待检测血液而得到的血液样本中，加沉淀蛋白试剂，涡旋混合，离心取上清液，稀释上清液，再次涡旋混合后取上清液得到待测样本；同样检测待测样本得到其色谱图；根据待测样本的色谱图和各个标准曲线方程，计算血液样本中亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸的含量。本发明中的样本前处理简单、省时、快速。