水牛奶特征肽及水牛奶鉴定方法

摘要

本发明公开了一种水牛奶特征肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示；利用水牛奶特征肽鉴定水牛奶的方法，包括：在待测物中加入蛋白质沉淀剂，超声、离心，取上清液超滤，得到分子量小于10KDa的超滤液，对超滤液进行脱盐处理，得到脱盐溶液，对脱盐溶液进行液质分析，采集多肽指纹图谱；判断多肽指纹图谱是否含有水牛奶特征肽的离子信号；若多肽指纹图谱含有水牛奶特征肽的离子信号，则测定待测物中水牛奶特征肽的峰面积，记为X；测定与待测物同重量份数的纯水牛奶中水牛奶特征肽的峰面积，记为Y，则待测物中含有的纯水牛奶比例为Y与X的比值。本发明可检测出待测物中水牛奶的比例，使用方便、快捷。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域。更具体地说，本发明涉及一种水牛奶特征肽及水牛奶鉴定方法。

背景技术

水牛奶被誉为“奶中之王”，具有很高的营养价值，其中的蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和矿物质等都是人体必须的营养元素，蛋白质和氨基酸种类含量丰富，符合我国居民的健康饮食需求。研究表明，水牛奶的干物质、乳蛋白、乳脂肪、维生素、矿物质等主要营养成分均高于普通奶，水牛奶的总固形物质分别是牛奶、人奶的1.67倍和1.64 倍，脂肪含量分别是牛奶、人奶的2倍以上。水牛奶蛋白是全价蛋白，主要由酪蛋白、乳清蛋白和少量的脂肪球膜蛋白组成，含有人体所需的必须氨基酸，氨基酸含量比牛奶高 31.6％，是营养丰富、高质量的天然动物蛋白食品。水牛奶蛋白胶团直径大，容易形成弹性胶体状态和蛋白网络结构，在乳品加工上更具优势，特别利于干酪的生产。其他营养物质、微量元素和维生素等含量均高于荷斯坦牛，是最接近于人乳的天然食品，素有“白色血液”之称。

水牛奶因其营养价值高，逐渐受到消费者青睐。然而，由于水牛奶产量低，奶水牛种群数量少等因素影响，导致其奶源成本偏高，受经济利润驱使，奶源造假事件层出不穷，不法商家利用其他动物奶源冒充水牛奶销售，从而牟取高额利润。这种掺假行为不仅损害消费者的合法权益，还会对牛奶过敏的消费者身体健康造成威胁。

近年来，乳品虚假宣传被曝出，水牛奶源真实性的问题被社会重点关注。目前，水牛奶源真实性检测缺乏有效的检测方法，仅仅依靠蛋白质含量测定、PCR检测和液相色谱法，但这些方法存在准确度低、检测周期长，操作复杂等缺点，例如，已公开的检测畜类源性成分的多重荧光定量PCR试剂盒和检测方法，主要通过提取样品的DNA，实现对绵羊、山羊、牛、牦牛和水牛等6种畜禽的准确检测。此方法具有较好的特异性，具有快速的特点，但这种方法也存在自身的缺陷，由于检测的目标物是畜禽奶中的游离细胞的DNA，其含量受动物品种、生理状态和健康条件的影响，环境微生物也会造成干扰。两种或两种以上的奶源掺杂时，PCR方法均能检测到，对于奶源的真实来源判断和掺杂比例缺乏更为有效的定量分析。高效液相色谱法能够通过检测水牛奶中的蛋白质成分角度分析奶源来源，但不同物种的奶源蛋白质相似性较高，且大分子蛋白质在样品处理中易降解，加之液相色谱法灵敏度低于液质联用法，对于掺假识别带来较大的阻碍。因此，发明一种快速、高效、高灵敏度的定性定量检测方法是有必要的。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供一种水牛奶特征肽及水牛奶鉴定方法，利用水牛奶特征肽可鉴定出待测水牛奶中是否含有纯水牛奶以及含有的纯水牛奶的比例，使用方便、快捷。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种水牛奶特征肽，所述水牛奶特征肽的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。

利用所述水牛奶特征肽鉴定水牛奶的方法，包括以下步骤：

S1、在待测物中加入蛋白质沉淀剂，超声、离心，取上清液超滤，得到分子量小于10KDa的超滤液，对所述超滤液进行脱盐处理，得到脱盐溶液，对所述脱盐溶液进行液质分析，采集多肽指纹图谱；

S2、判断S1中的多肽指纹图谱是否含有水牛奶特征肽的离子信号：若含有水牛奶特征肽的离子信号，则说明待测物中含有水牛奶，若不含有水牛奶特征肽的离子信号，则说明待测物中不含有水牛奶。

优选的是，还包括以下步骤：

S3、若S1中的多肽指纹图谱含有水牛奶特征肽的离子信号，则测定待测物中水牛奶特征肽的峰面积，记为X；

S4、测定与待测物同重量份数的纯水牛奶中水牛奶特征肽的峰面积，记为Y，则待测物中含有的纯水牛奶比例为Y与X的比值。

优选的是，S1中在待测物中加入蛋白质沉淀剂后超声的具体操作为：向待测物中加入酸性沉淀剂，调节pH至4.0后加入硫酸铵，得混合液，室温超声波萃取10min；其中，所述待测物与所述酸性沉淀剂的体积比为1:2，所述硫酸铵的浓度为1mol/L，所述酸性沉淀剂包括重量比为1:8:1的三氯乙酸、三氯甲烷、丙酮。

优选的是，S1中超滤的具体操作为，将S1中的上清液转移至截留分子量为30KDa的超滤管内，10000g离心10min，得到一级超滤液；将所述一级超滤液转移至截留分子量为10KDa的超滤管内，10000g离心10min，得到分子量小于10KDa的超滤液。

优选的是，S1中采用ZipTip C18脱盐柱进行脱盐处理。

优选的是，S1中液质分析时采用的流动相A为：2％乙腈，0.1％甲酸，97.9％水；流动相B为：98％乙腈，0.1％甲酸，1.9％水；梯度洗脱条件：0～5min，流动相B为 2％～12％；5～30min，流动相B为12％～20％；30～43min，流动相B为20％～32％；48～58min，流动相B为98％，体系流速300nL/min。

本发明至少包括以下有益效果：

第一、本发明公开了一种水牛奶特征肽及水牛奶鉴定方法，利用水牛奶特征肽可鉴别待测物中是否含有纯水牛奶以及待测物中含有的纯水牛奶的比例，可用于检测水牛奶是否掺假以及掺假比例，使用方便，检测快速。

第二、本发明中采用酸性沉淀剂和盐析沉淀剂相结合去除蛋白质的方法，大大提高了干扰蛋白质的去除效率，以内源多肽作为检测指标，相较常规的酶解方法，去除了繁琐的酶切步骤，结合超声萃取，提高了水牛奶中多肽的提取效率和操作时间，仅需60分钟即可完成样品制备和纯化。

第三、本发明采用高分辨液质联用仪作为检测手段，只需要取样微量的待测水牛奶样品，即可达到有效检测目的，nmol级(10

第四、本发明利用超高压纳升液相色谱分离，采用的色谱柱为Acclaim PepMapRSLC C

第五、本发明建立了完善的水牛奶内源多肽的分离方法及质谱检测方法，通过质谱技术精确地识别水牛奶中所有的多肽信息，筛选了水牛奶特征多肽作为生物标志物，为水牛奶的质量检测提供了可靠的依据，保障了消费者的健康和权益。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为纯水牛奶的质谱图；

图2为普通牛奶样品的质谱图；

图3为本发明所述的水牛奶特征肽的二级质谱图；

图4为本发明所述的水牛奶特征肽的二级碎裂的重复性比较展示图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

<水牛奶特征肽的鉴定>

1、纯水牛奶和普通牛奶的质谱图测定

采用的仪器和试剂如下：

高分辨率质谱仪(HRMS，Q-Exactive，Thermo Scientific，美国)、纳升液相色谱仪(NanoLC，Easy-nLC 1000，Thermo Scientific，美国)、冷冻离心机(5430R，Eppendrof，德国)、离心机(Plus，Eppendorf，德国)、真空浓缩仪(SPD2010，Thermo Scientific，美国)、超纯水系统(A10，Millipore，美国)、超声波清洗器(江苏昆山超声波仪器有限公司)。另配备液质联用仪(NanoLCMS)的预柱：Acclaim

实验步骤：

S1、在1mL样品中加入2mL酸性沉淀剂，酸性沉淀剂的组成为：三氯乙酸/三氯甲烷/丙酮按1：8：1混合，调节pH至4.0后加入硫酸铵，使硫酸铵终浓度为1mol/L，得混合液，将所述混合液室温超声波萃取10分钟；

S2、将S1中超声萃取后的溶液于4℃，3000g离心10分钟，取上清液；

S3、将S2中所得的上清液转移至amicon ultra 30kD超滤管(截留分子量为30kD)中，超滤管装入套管内，于4℃，10000g离心10分钟，分子量超过30kD的蛋白质将被截留，收集套管内过滤后的溶液，得到分子量低于30kD的一级超滤液；

S4、将S3所得的一级超滤液转移至amicon ultra 10kD超滤管(截留分子量为10kD) 中，超滤管装入套管内，于4℃，10000g离心10分钟，分子量超过10kD的蛋白质将被截留，收集套管内过滤后的溶液，得到分子量低于10kD的二级超滤液；

S5、将S4所得二级超滤液真空浓缩至干粉状，加水复溶至30微升，使用ZipTip C18脱盐柱处理样品，去除多肽样品中的多余盐分和杂质；脱盐步骤为：(1)活化：ZipTip C18枪头在100％乙腈吸打3～5次；(2)润洗：ZipTip C18枪头在Milli-Q水中润洗3～5次； (3)吸附：ZipTip C18枪头在多肽样品中吸打8～10次，使多肽充分吸附在填料上；(4) 脱盐：吸附多肽后的ZipTip C18枪头在Milli-Q水中润洗3～5次，使残留盐分充分洗脱； (5)洗脱：吸取50％乙腈水溶液，缓慢洗脱至新EP管；脱盐后的水牛奶内源多肽经真空浓缩抽干；

S6、将S5得到的脱盐后多肽用于Q-Exactive高分辨液质联用仪分析，质谱分析的液相和质谱参数分析条件为：进样体积1μL，色谱柱为：Acclaim PepMap 100,C

S7、质谱选择ESI正离子扫描模式，质荷比(m/z)445.12003的离子作为仪器校正内标，电喷雾电压1.9kV；一级MS扫描范围为300-1800m/z，分辨率70000FWHM；采用数据依赖采集(DDA)方式进行二级MS/MS分析，将MS的母离子按照响应信号由强到弱进行排序，选取排在前20的母离子进行高能碰撞解离(HCD)碎裂，归一化碰撞能量(NCE)为30，MS/MS分辨率17500，动态排除时间30s；

S8、使用Proteome Discoverer软件分析质谱图。

表1液质联用分离的洗脱梯度

实验样品：取5份不同个体的纯水牛奶样品(摩拉水牛)和5份普通牛奶样品(荷斯坦奶牛)进行测定，具体结果见图1和图2。

质谱图结果分析：

如图1和图2所示，在水牛奶多肽的液质联用分析中，在保留时间(RT)14min时，获得了质荷比(m/z)为1129.09的质谱信号，在普通牛奶多肽中未检测到该质谱信号，该质谱信号来源于水牛奶特异性多肽，在普通牛奶中不存在该信号；

2、质荷比(m/z)为1129.09的质谱信号的氨基酸序列鉴定

通过PEAK studio质谱数据分析软件分析，使用水牛蛋白质数据库，将质谱采集谱图与蛋白质数据库的理论谱图比对，通过一系列计算打分筛选出高置信度的蛋白质；搜库检索参数设置为：无酶切，MS母离子质量偏差范围±15ppm，MS/MS碎片离子的质量偏差范围±0.02Da；设定每条肽段2种修饰类型，即1种动态修饰：甲硫氨酸(M)氧化 (+15.995Da)；1种固定修饰：半胱氨酸(C)乙酰胺化(+57.021Da)；设置肽段置信度≥99％的高置信度，错配率(FDR)<0.01；分析得到质荷比(m/z)1129.09对应的多肽序列为QKKGDKTPGANLKDDRS，具体见SEQ ID NO1，该肽段仅出现在水牛奶样品中，属于水牛奶的特征肽，如图3所示。

<利用水牛奶特征肽鉴定水牛奶>

为实现目标多肽的相对定量分析，精确判断掺假水牛奶比例，采用质谱平行反应监测 (Parallel Reaction Monitoring,PRM)技术分析目标多肽(m/z1129.09)在不同样本中的相对含量。PRM是一种基于高分辨质谱的离子监视技术，能够对目标肽段进行选择性检测，实现对目标肽段定量的目的。首先利用四级杆质量分析器的选择检测能力，在一级质谱中选择性地检测目标肽段的母离子信息(m/z1129.09)。随后对母离子进行碎裂，利用高分辨分析器在二级质谱中检测所选择的母离子窗口内的所有碎片的信息。

1、PRM方法的建立

采用的仪器和试剂如下：

高分辨率质谱仪(HRMS，Q-Exactive，Thermo Scientific，美国)、纳升液相色谱仪(NanoLC，Easy-nLC 1000，Thermo Scientific，美国)、冷冻离心机(5430R，Eppendrof，德国)、离心机(Plus，Eppendorf，德国)、真空浓缩仪(SPD2010，Thermo Scientific，美国)、超纯水系统(A10，Millipore，美国)、超声波清洗器(江苏昆山超声波仪器有限公司)。另配备液质联用仪(NanoLC-MS)的预柱：Acclaim

实验步骤：

S1、在1mL样品中加入2mL酸性沉淀剂，酸性沉淀剂的组成为：三氯乙酸/三氯甲烷/丙酮按1：8：1混合，调节pH至4.0后加入硫酸铵，使硫酸铵终浓度为1mol/L，得混合液，将所述混合液室温超声波萃取10分钟；

S2、将S1中超声萃取后的溶液于4℃，3000g离心10分钟，取上清液；

S3、将S2中所得的上清液转移至amicon ultra 30kD超滤管(截留分子量为30kD)中，超滤管装入套管内，于4℃，10000g离心10分钟，分子量超过30kD的蛋白质将被截留，收集套管内过滤后的溶液，得到分子量低于30kD的一级超滤液；

S4、将S3所得的一级超滤液转移至amicon ultra 10kD超滤管(截留分子量为10kD) 中，超滤管装入套管内，于4℃，10000g离心10分钟，分子量超过10kD的蛋白质将被截留，收集套管内过滤后的溶液，得到分子量低于10kD的二级超滤液；

S5、将S4所得二级超滤液真空浓缩至干粉状，加水复溶至30微升，使用ZipTip C18脱盐柱处理样品，去除多肽样品中的多余盐分和杂质；脱盐步骤为：(1)活化：ZipTip C18枪头在100％乙腈吸打3～5次；(2)润洗：ZipTip C18枪头在Milli-Q水中润洗3～5次； (3)吸附：ZipTip C18枪头在多肽样品中吸打8～10次，使多肽充分吸附在填料上；(4) 脱盐：吸附多肽后的ZipTip C18枪头在Milli-Q水中润洗3～5次，使残留盐分充分洗脱； (5)洗脱：吸取50％乙腈水溶液，缓慢洗脱至新EP管；脱盐后的水牛奶内源多肽经真空浓缩抽干。

S6、将S5得到的脱盐后多肽用于Q-Exactive高分辨液质联用仪分析，质谱分析的液相和质谱参数分析条件为：进样体积1μL，色谱柱为：Acclaim PepMap 100，C

S7、PRM方法的建立；质谱选择ESI正离子扫描模式，质荷比(m/z)445.12003的离子作为仪器校正内标，电喷雾电压1.9kV。一级MS扫描范围为300-1800m/z，分辨率20000FWHM，AGC target 2×10

S8、PRM方法的验证；采用Full-MS+PRM扫描方式，多肽经过碰撞诱导裂解后，产生了b离子和y离子等多个峰，为确保特异性和专属性，实验重复6次，碎片离子高度相似，重复性高，水牛奶的特征肽QKKGDKTPGANLKDDRS序列的dotp值均大于0.9，表示PRM 获得碎片丰度比与标准谱库相似，适合做定量分析，如图4所示；

实验样品：取纯水牛奶进行测定，实验重复六次，具体实验结果见图4。

2、利用PRM方法检测水牛奶中纯水牛奶的比例

实验步骤：与PRM方法的建立中的实验步骤一致；

取实验样品进行PRM测定，直到谱图信号的母离子峰消失，计算得出水牛奶特征肽(m/z 1129.09)的检出限为10mg/L，回收率93.1％(n＝6)；成功地对水牛奶样品、荷斯坦牛奶样品、水牛奶/荷斯坦牛奶混合样品的水牛奶特征肽进行定量分析；

实验样品：纯水牛奶样品5份(摩拉水牛)、普通牛奶样品5份(荷斯坦奶牛)、不同比例混合的纯水牛奶与普通牛奶样品；纯水牛奶：普通牛奶的比例依次为99:1、90:10、75:25、50:50、33.3：66.7、20:80、10：90；计算每组实验样品的峰面积与标准品(纯水牛奶)的峰面积比值，即可得出样品中水牛奶的含量(比值)，每组实验重复6次，取平均值，具体结果见表2。

表2不同比例混合的纯水牛奶与普通牛奶中水牛奶特征肽定量分析结果

注：“+”指在样品中发现了(m/z1129.09)的水牛奶特征肽；“－”指在样品中未发现水牛奶特征肽

从表2中可以看出，纯水牛奶样品6次重复均检测到水牛奶特征肽(m/z 1129.09)，且峰面积差异不显著，普通牛奶(荷斯坦牛奶)6次重复未检测到水牛奶特征肽(m/z1129.09)，与预期相符；不同比例混合的纯水牛奶和普通牛奶的混合样品中水牛奶特征肽的峰面积与标准品(纯水牛奶)的峰面积比值，与预期的混合比例非常接近或一致，证明PRM定量检测方法能够通过水牛奶特征肽(m/z 1129.09)的峰面积来计算待测水牛奶中是否含有纯水牛奶以及含有的纯水牛奶的比例，进而可实现对待测水牛奶的掺假识别；PRM方法稳定可靠，为水牛奶的奶源鉴定和掺假识别提供了一种稳定、灵敏、可靠的检测技术。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西大学

<120> 水牛奶特征肽及水牛奶鉴定方法

<130> 20210514

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> Bubalus arnee

<400> 1

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1 5 10 15

Ser