一种具有促进脊髓损伤后结构和功能恢复活性的多肽及其应用

摘要

本发明提供了一种具有促进脊髓损伤后结构和功能恢复活性的多肽及其应用。所述多肽命名为VD11，其氨基酸序列为VDELWPPWLPC。所述多肽的应用为在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。本发明提供了一种新的多肽VD11，其对脊髓损伤后结构和功能的恢复具有显著的活性，且毒性低，具有开发成治疗脊髓损伤药物的前景。本发明多肽可以采用化学合成的方法制备得到，具有纯度高、分子量小、安全可靠等优势。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有促进脊髓损伤后结构和功能的恢复活性的多肽及其应用。

背景技术

脊髓损伤（Spinal cord injury, SCI）是一种严重中枢神经系统（Centralnervous system, CNS）损伤，具有高发病率、高致残率和高死亡率的特征。不仅会造成相当大的生理和心理伤害，还会给患者、家庭和社会带来严重的经济负担。

目前对SCI有效的治疗方法很少。唯一被美国食品药品监督管理局（Food andDrug Administration, FDA）批准的临床中治疗SCI药物是甲基强的松龙（methylprednisolone，MPED），其疗效确切、应用方便。它通过抑制免疫系统，降低炎症反应来改善预后。但是，作为皮质类固醇类药物，MPED可引起骨质疏松、高血糖、消化道溃疡、电解质紊乱、呼吸系统并发症及感染等严重并发症。此外，虽然基因治疗和干细胞移植等新技术在治疗SCI方面显示出前景，在将这些疗法用于临床治疗之前，需要解决许多技术挑战。因此，探索安全、有效、方便的治疗脊髓损伤的药物仍是当务之急。

多肽药物因其高选择性、高生物活性和低抗原性而越来越受到药物研究和开发的关注。来自两栖动物的小分子多肽是该类多肽的优良天然来源，部分多肽被报道在受损组织中具有显著的促修复和再生活性。两栖动物的脊髓再生能力很强，例如，四足蝾螈可以在其一生中再生脊髓，而蟾蜍和青蛙在变态前就表现出脊髓再生。但很少有研究探讨两栖动物脊髓来源的多肽对SCI的影响。

本发明旨在提供一种来源于两栖动物花臭蛙（

发明内容

本发明的第一目的是提供一种具有促进脊髓损伤后结构和功能恢复活性的多肽VD11，本发明的另一目的是提供所述多肽VD11的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，一种多肽VD11，其氨基酸序列为VDELWPPWLPC。

本发明的另一目的是这样实现的，所述多肽VD11的应用为在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。

本发明的有益效果为：本发明提供了一种新的多肽VD11，其对脊髓损伤后结构和功能的恢复具有显著的活性，且毒性低，具有开发成治疗脊髓损伤药物的前景。本发明多肽可以采用化学合成的方法制备得到，具有纯度高、分子量小、安全可靠等优势。

附图说明

图1为多肽VD11的一级结构图；

图2为本发明多肽VD11的体内和体外BV2细胞中NGF和BDNF分泌水平的影响作用图；图2A为VD11对BV2细胞中NGF mRNA转录的影响，图2B为VD11对BV2细胞中BDNF mRNA的转录的影响；NGF和BDNF的表达水平归一化至β-actin。图2C为酶联免疫吸附法测定NGF的分泌情况；图2D为酶联免疫吸附法测定BDNF的分泌情况；图2E和图2F 分别为多肽VD11对大鼠脊髓损伤后BDNF (n = 4)和NGF (n = 3)的分泌影响的Western blot实验结果图，对照组设为1，数据以三次独立实验的平均值±标准差表示。*、**、***和****分别表示p<0.05，0.01，0.001，0.0001 （t-检验）；

图3为本发明多肽VD11对PC12细胞增殖和轴突突起长度的影响结果图，图3A为VD11对PC12细胞活力的影响，归一化到对照组设为1(n = 9)；图3B为在PC12细胞中，OGD/R和多肽VD11对细胞存活和轴突生长影响的代表性免疫荧光图（比例尺:20 μm），其中，DAPI标记细胞核，Tau-FITC标记轴突；图3C为PC12细胞中细胞数量的变化情况图；图3D为PC12细胞中轴突长度变化图，每组重复3个，每个值代表3个随机10×/0.25视野中的平均细胞数(n= 3)。数据以mean ± SD表示，*、**分别表示

图4为本发明多肽VD11对大鼠脊髓损伤后后肢功能恢复的影响结果图，图4A为动物治疗和幸存者数量随时间的变化图；图4B为Vehicle（SCI +生理盐水）、MPED （SCI +MPED）、VD11 （SCI + VD11）组大鼠不同时间点BBB运动功能评分的变化图，数据是三名独立观察员的分数平均值。数据以平均值±标准差表示。*， **， ***， ****分别表示

图5为本发明多肽VD11对大鼠脊髓损伤后脊髓组织瘢痕长度的影响作用图；图5A和图5B为分别脊髓损伤后30天脊髓背侧和腹侧的代表性照片；图5C和图5D为术后30天大鼠脊髓背侧和腹侧的瘢痕长度（单位:mm）。数据以均值±SD表示（n=3）， *、**分别表示

图6为本发明多肽VD11对大鼠组织结构修复作用情况，图6A和图6B分别为脊髓损伤后30天大鼠脊髓组织H&E 和Nissl 染色的代表性图像；其中，图6B的第二行图像是第一行图像中红色框的放大图。第三行图像为损伤中心直径为5mm的神经元高倍放大代表图像；红色箭头表示组织空腔，黑色箭头表示神经元；图6C和图6D分别为术后30天大鼠脊髓组织H&E染色空腔面积及Nissl染色神经元数量(D)的统计分析，数据以均值±SD表示（n=3），*、**分别表示p<0.05、0.01（t-检验）；

图7为本发明多肽VD11对大鼠SCI后神经组织再生作用情况，图7A为脊髓损伤后30天脊髓免疫荧光染色的代表性照片，其中，DAPI表示细胞核，GFAP表示星形胶质细胞，Tau表示神经元轴突；图7B和图7C分别为 GFAP和Tau染色空腔面积统计分析，数据以均值±SD表示（n=3）， *、**分别表示

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明一种多肽VD11，其氨基酸序列为VDELWPPWLPC，如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了所述多肽VD11在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。

本发明进一步提供了一种药物组合物，其包含所述多肽VD11以及药学上可接受的赋形剂。

实施例1 多肽VD11的筛选及合成

用去离子水清洗花臭蛙（

多肽VD11的氨基酸序列为VDELWPPWLPC，由武汉Bioyeargene生物科技有限公司（中国武汉）人工合成，分子量为1357 Da，纯度＞95%。

实施例2 多肽VD11活性检测

本实施例中实验使用了两种类型的细胞：

BV

本实施例中实验建立了两种模型：

脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）诱导的炎症模型：将BV

氧葡萄糖剥夺/复氧（OGD/R）模型：将PC12细胞加入无血清和无葡萄糖培养基中，在三气培养箱（37℃，90% N

本实施例中实验中数据以均数±标准差（SD）表示。结果采用GraphPad Prism 8.0软件（California, USA）进行分析。BBB运动评分采用多因素方差分析（ANOVA）进行分析。其余数据采用

一、多肽VD11对体内外BV

1、qPCR检测LPS刺激以及VD11处理后的BV

用总RNA提取试剂盒（天根生物科技，北京，中国）从BV

2

1）计算ΔCt：ΔCt = 待测基因Ct - 内参基因Ct

2）计算ΔΔCt：ΔΔCt = 待测基因ΔCt - Control组的ΔCt

3）计算2

结果：如图2A和图2B所示，这些变化在VD11浓度为100 nM时最为明显。正常BV

2、ELISA法检测VD11处理后NGF和BDNF水平的变化

BV

结果：如图2C和图2D所示，正常BV2细胞中，VD11（100 nM）组NGF的表达量是对照组的1.13倍（n=9，

3、免疫蛋白印迹法检测VD11对体内BDNF和NGF分泌的促进作用

实验方法：在正常SD大鼠和SCI后30天大鼠使用生理盐水进行灌注，取脊髓组织液氮研磨后放入离心管，将预冷的RIPA和苯甲磺酰氟（PMSF，美伦生物科技，大连，中国）的裂解缓冲液加入离心管中，冰上静置30min。在4℃下12,000×g离心15 min。使用BCA法进行蛋白定量后，将蛋白上清与2 X loading buffer等比例混合，于95 ℃煮沸变性15min，煮好的蛋白自然冷却并保存于-20℃。

提取蛋白后采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫蛋白印迹（western blotting，WB）验证VD11对蛋白表达的影响。

结果：如图2E和图2F显示，正常组大鼠的NGF/β-actin比值为0.53±0.08（n=3）；

SCI组为0.73±0.09（n=3），显著高于正常组（

以上结果说明，VD11在体内外均可促进NGF和BDNF的分泌。

二、VD11对PC12细胞及OGD/R建模后的细胞的影响

1、MTS法评估VD11对PC12细胞的活力的影响

PC12细胞是由大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤产生的，其膜含有NGF受体。PC12细胞在生理NGF刺激下停止分裂，轴突萌发，分化为具有交感神经元特性的细胞，常用于神经系统疾病的体外研究。本发明为了研究VD11对PC12细胞及OGD/R建模后的细胞的影响或毒性，采用MTS法评估PC12细胞的活力,即在OGD/R模型中，通过引入N

结果：如图3所示，细胞活力随药物浓度的增加而增加。将Control组设为100%，与Control组相比，1、10和100 nM VD11组的细胞活力显著增高，其细胞活力分别为111.97%±5.07% （

2、免疫荧光染色法评价VD11对PC12细胞轴突长度的影响

结果：OGD/R造模后，PC12细胞的细胞数量和轴突长度减少，而VD11挽救了由OGD/R刺激引起的生存能力下降的PC12细胞（图3B-D）。荧光染色后镜下观察，与正常培养的细胞（Control组，每10×/0.25视野中细胞数为231.67±34.02，轴突长度设置为100%）相比，OGD/R后48 h（Model组）细胞数和（65.33±12.50/10×/0.25视野；n=3，

以上结果表明VD11能促进缺氧损伤后PC12细胞的增殖和轴突延伸。

三、VD11对大鼠脊髓损伤后后肢功能恢复、组织修复及神经组织再生的作用

实验方法：将雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为3组：Vehicle组、MPED组和VD11组，戊巴比妥钠麻醉进行T10全脊髓横切：在T10为中心做切口，暴露至肌层后进行T10椎板切除术，然后使用眼科剪将脊髓完全离断，置皮下导管至硬脊膜下，以方便之后椎管内给药，然后分层次缝合。麻醉苏醒前，所有大鼠皮下注射酮洛芬0.4mL （10mg/mL）镇痛，置于加热垫上，直至麻醉完全苏醒。术后7天内给予青霉素（20万单位/100g，每日2次肌肉注射）抗感染。Vehicle、MPED和VD11组大鼠分别给予0.9%生理盐水、MPED （30mg/kg）和VD11肽（0.1mg/kg）椎管内注射，每日2次。人工辅助排尿，每日3次。所有大鼠术前后肢功能正常（21.00±0.00），术后后肢瘫痪，术后3天后肢功能评分最低。

1、VD11对大鼠脊髓损伤后后肢功能的恢复作用

根据BBB评分测量术后4周运动功能恢复情况。

结果：脊髓损伤后28天，VD11组评分升高至15.15±0.31 （n= 9，

2、VD11对大鼠脊髓损伤后组织的修复作用

术后30天，麻醉下灌注0.9%生理盐水大鼠心脏，整根脊柱取出，4%多聚甲醛过夜固定。小心地将脊髓从脊柱中取出，注意保持组织结构完整并拍照。

结果：如图5所示，脊髓腹侧和背侧瘢痕的存在表明横切成功（图5A-B）。脊髓背侧组织瘢痕长度VD11组（2.33±0.58，n= 3）明显短于对照组（6.83±1.04，n=3，

如图6所示，基于H&E染色的脊髓组织，与对照组相比，VD11组脊髓组织空洞明显减少（图6A）。Nissl染色显示（0.10±0.04，n=3）脊髓组织空洞比Vehicle组（设为1，1.00±0.29，n=3，

3、VD11对大鼠脊髓损伤后神经组织再生的作用

采用GFAP和Tau分别对星形胶质细胞和神经元轴突进行免疫荧光标记，测定大鼠脊髓损伤部位神经组织再生情况：将脊髓组织依次用10%、20%、30%蔗糖脱水。OCT包埋剂包埋后，用冷冻切片机（德国莱卡）将脊髓切成8μm厚的组织切片。组织切片用PBS洗3次，用0.3% triton-100-PBS（PBST）打孔，之后用含5%正常山羊血清和PBST的封闭缓冲液在室温下处理1h，进行免疫荧光染色和标记。然后，组织切片与以下一抗4℃孵育过夜:兔抗tau（1:200, Genetex公司）标记神经元轴突和小鼠抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP;1:20,CellSignaling Inc.）来标记星形胶质细胞。PBS冲洗后，与以下第二抗体室温避光孵育1h:Cy3-山羊抗兔（1:200,Proyrintech）使Tau呈红色，FITC-山羊抗大鼠（1:200,Proyrintech公司）使GFAP呈绿色。PBS再次冲洗切片，染色后在避光条件下用DAPI（使细胞核呈蓝色）封片。另外，在荧光染色实验中，PC12细胞也被Tau标记。Tau阳性区域表示轴突生长，对照组数据值归一化设置为100%。数据以视野内10×/0.25个单元表示。

结果：如图7A所示，SCI后30天，VD11组病变部位可见典型的GFAP阳性星形胶质细胞和Tau阳性神经元轴突，星形胶质细胞再生和轴突延伸的发生明显多于vehicle和MPED组。特别是在病灶中心可见较大的空腔，vehicle组和MPED组几乎未见GFAP

总结：MPED在治疗急性SCI的临床应用历史悠久，它可以通过抑制免疫系统、降低炎症反应、降低继发感染的频率来改善SCI患者的预后。虽然MPED的使用目前存在争议，一些动物试验对其神经保护作用提出了质疑，使用局部MPED或特定载体传递的MPED可以通过减少糖皮质激素的副作用来大大增强SCI后的运动功能。因此，MPED在一些SCI实验中仍被用作阳性对照药物。本发明中在阳性对照组的椎管中使用了低剂量的MPED，结果表明这种治疗增强了脊髓损伤后大鼠的运动功能。脊髓损伤后28天，VD11组的BBB运动评分明显高于对照组和MPED组，VD11组的死亡率和体重减轻低于MPED组。此外，与MPED相比，VD11对脊髓损伤后运动功能恢复有更积极的作用，毒副作用更少。随后的组织学检查也显示，VD11组在肉眼和显微镜上观察到瘢痕和空腔形成较少。此外，MPED的使用剂量是VD11的300倍，说明VD11在低剂量下具有更优越的活性，因此具有更高的效率。