一种改善幽门螺杆菌感染模型小鼠胃黏膜病理变化的方法

摘要

本发明公开了一种改善幽门螺杆菌感染模型小鼠胃黏膜病理变化的方法，涉及多巴胺在治疗幽门螺杆菌感染相关胃炎及癌前病变药物中的应用；给模型小鼠饮用水中浓度为大于0.125小于等于0.25mg/mL的盐酸多巴胺，可以明显提高幽门螺杆菌感染小鼠胃黏膜多巴胺含量，遏制解痉多肽表达化生现象的发生，使胃窦G细胞数量和血清胃泌素水平接近正常水平，因此可以遏制疾病进展。有望减少幽门螺杆菌感染导致的胃癌发生。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种多巴胺的药物新用途。

背景技术

幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori,

小鼠动物模型药物治疗方法是人类疾病治疗方法的研究基础。找到改善幽门螺杆菌感染模型小鼠胃黏膜病理变化的方法，就离找到人类相关疾病治疗方法一步之遥了。

本发明的目的就是提供一种改善幽门螺杆菌感染模型小鼠胃黏膜病理变化的方法。

发明内容

一种改善幽门螺杆菌感染模型小鼠胃黏膜病理变化的方法，是给模型小鼠口服含多巴胺的药物。

进一步，所述胃黏膜病理变化为幽门螺杆菌感染导致的胃炎、胃溃疡、肠化生、异型增生以及胃癌。

进一步，所述含多巴胺的药物为在模型小鼠饮用水中浓度为大于0.125小于等于0.25mg/mL的盐酸多巴胺。

所述多巴胺，CAS No.:51-61-6。

幽门螺杆菌感染小鼠胃黏膜解痉多肽表达化生现象的进展、胃窦G细胞数量和血清胃泌素水平的异常是胃癌发展的危险指标。口服多巴胺安全无毒，副作用小，可以明显提高幽门螺杆菌感染小鼠胃体黏膜多巴胺含量，遏制解痉多肽表达化生现象的发生，使胃窦G细胞数量和血清胃泌素水平接近正常水平，因此可以遏制疾病进展。有望减少幽门螺杆菌感染导致的胃癌发生。

附图说明

图1为多巴胺对幽门螺杆菌感染小鼠胃体黏膜多巴胺含量的作用图。

图2为多巴胺对幽门螺杆菌感染小鼠胃体黏膜主细胞解痉多肽表达化生现象的作用图。

图3为多巴胺对幽门螺杆菌感染小鼠胃窦黏膜G细胞数量的作用图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的多巴胺为盐酸多巴胺。生产商Sigma，货号：H8502。

下述实施例中使用的幽门螺杆菌感染小鼠模型构建方法如下：采用幽门螺杆菌的PMSS1菌株通过灌胃方式构建感染小鼠模型。小鼠选用SPF级6-8周龄C57BL/6小鼠，体重在25g左右。所有动物实验均经过首都医科大学动物福利委员会许可，并严格按照实验动物福利的原则进行相关实验。动物所在饲养环境为12小时光暗交替且自由饮水饮食，环境温度为22℃左右，每笼5只小鼠。灌胃前禁食12h，禁水4h，按0.01mL/g的剂量灌胃幽门螺杆菌，浓度为1×10

下列实施例中使用的山羊抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附的二级抗体为Invitrogen公司生产的货号为A32740、商品名称为Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594的二抗。

下列实施例中使用的Anti-Pepsin C（胃蛋白酶原C）为Santa cruz公司生产的货号为 sc-374044、商品名称为Pepsin C (E-9): sc-374044的一抗。

下列实施例中使用的GSII（加纳单叶豆凝集素II，以下简称凝集素II）为Vector公司生产的货号为FL-1211、商品名称为Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia LectinII (GSL II，BSL II)的一抗。

下列实施例中使用的Anti-Gastrin（胃泌素）为Sigma公司生产的货号为SAB4501048、商品名称为Anti-Gastrin antibody produced in rabbit的一抗。

实施例1

1、多巴胺能够提高幽门螺杆菌感染小鼠胃体黏膜多巴胺的含量

(1) 实验分组和处理

实验设置对照组小鼠、幽门螺杆菌感染10周给予普通饮用水组小鼠（简称感染组小鼠）、幽门螺杆菌感染10周给予低剂量多巴胺（0.125mg/mL）饮用水组小鼠（简称低剂量组小鼠）、幽门螺杆菌感染10周给予高剂量多巴胺（0.25mg/mL）饮用水组小鼠（简称高剂量组小鼠）及幽门螺杆菌感染10周给予酪氨酸（1.5mg/mL）饮用水组小鼠（简称酪氨酸组小鼠），其中含药饮用水组小鼠在幽门螺杆菌感染后第4周开始每日夜间避光给药，所有小鼠在感染后第10周进行取材。

(2) 实验方法

小鼠脱颈处死后，取出胃，去除胃底及胃窦后，在体视显微镜下剥离胃体黏膜和肌层。将胃体黏膜组织称重，取约30mg组织于1.5mL Ep管中，加入150uL A液（0.4M 高氯酸）后剪碎组织并匀浆，之后置于冰上超声，条件为0.5Hz，间隔1s，反复4-5次。于冰上避光静置1h后，在4℃，12000rpm的条件下，离心20min后取上清100uL，加入50uL B液（20mM 柠檬酸钾+300mM 磷酸氢二钾+2mM EDTA·2Na），混匀并于冰上静置1h后，在4℃，12000rpm的条件下，离心20min后取上清，之后将上清加入测量瓶内管底部，置于高效液相色谱仪内检测。

(3) 结果

实验结果如图1所示。由图1可知，各组小鼠胃体黏膜多巴胺含量的分析结果显示，对照组胃体黏膜多巴胺含量为（29.69±8.26）ng/g，感染组为（14.89±7.51） ng/g，低剂量组为（12.26±3.69）ng/g，高剂量组为（49.48±9.94）ng/g，酪氨酸组为（13.26±6.69）ng/g。提示幽门螺杆菌感染会导致胃体黏膜多巴胺含量降低，口服补充多巴胺浓度大于0.125mg/mL 小于等于0.25mg/mL时可以升高胃体黏膜多巴胺含量。Mean±SD; ** P＜0.01。

2、多巴胺能够遏制幽门螺杆菌感染小鼠胃黏膜主细胞解痉多肽表达化生现象的出现

(1) 实验分组和处理

考虑到高剂量多巴胺（0.25mg/mL）可以明显提升幽门螺杆菌感染小鼠胃黏膜多巴胺的含量，因此设置了对照组、幽门螺杆菌感染10周组（以下简称感染组）以及高剂量多巴胺治疗组（以下简称治疗组）进行后续实验。

(2) 实验方法

小鼠脱颈处死后，取出胃，去除胃底及胃窦后将胃体沿胃小弯剪开，去除食糜后置于OCT中包埋切片。新鲜组织冰冻切片后，使用4% PFA（多聚甲醛）固定半小时，使用柠檬酸盐进行抗原修复，PBS洗片3次，PBST洗片15min，用10%的山羊血清封闭1h后，加一抗：Anti-Pepsin C（胃蛋白酶原C）（1:200，Santa，sc-374044）特异性标记主细胞，4℃过夜，用PBS洗片3次后，加二抗：山羊抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附的二级抗体（1:1000，Invitrogen，A32740），室温摇90min，之后甩掉二抗，加入荧光标记的GSII（加纳单叶豆凝集素II，简称凝集素II）（1:800，Vector，FL-1211）15min，以特异性标记黏蛋白6，之后用DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染细胞核5min，用PBS洗3次，用50%甘油/PBS封片。用共聚焦显微镜拍照。

(3) 结果

实验结果如图2所示。由图2可知，在对照组，凝集素II主要分布在距离腺体基底部100到300µm的胃黏膜腺体中部；在感染组，凝集素II主要分布在距离腺体基底部0到200µm的胃黏膜腺体基底部；在治疗组，凝集素II主要分布在距离腺体基底部100到300µm的胃黏膜腺体中部。分泌胃蛋白酶原C的主细胞仅存在于腺体的基底部，因此各组胃蛋白酶原C的荧光信号自基底部（0µm）就可以观察到。荧光标记的凝集素II可以特异性地与黏蛋白6结合，从而显示黏蛋白6所在的位置。正常情况下，胃黏膜上皮细胞中仅有颈黏液细胞表达黏蛋白6，因此凝集素II阳性信号仅分布在胃黏膜腺体中部；幽门螺杆菌感染10周时胃黏膜主细胞在分泌胃蛋白酶原C的同时也表达黏蛋白6，因此在胃黏膜腺体基底部可以观察到凝集素II的荧光信号，称其为解痉多肽表达化生现象；而补充多巴胺后仅在幽门螺杆菌感染小鼠胃黏膜腺体中部观察到了凝集素II的荧光信号，说明主细胞没有表达黏蛋白6。提示口服多巴胺能够遏制幽门螺杆菌感染小鼠胃黏膜主细胞解痉多肽表达化生现象的出现。染色结果来源于3只小鼠，每只小鼠任取3张切片，每张切片随机选取了3个视野进行拍照。

3、多巴胺能够使幽门螺杆菌感染小鼠胃黏膜G细胞数量接近正常水平

(1) 实验分组和处理

同样设置对照组、幽门螺杆菌感染10周组（以下简称感染组）以及高剂量多巴胺治疗组（以下简称治疗组）进行实验。

(2) 实验方法

小鼠脱颈处死后，取出胃，去除胃底及胃体后，将胃窦食糜小心除去，之后浸入4%PFA固定。固定好的组织经石蜡包埋、石蜡切片后经二甲苯、酒精依次脱蜡。之后用柠檬酸盐进行抗原修复，PBS洗片3次，PBST洗片15min，用10%的山羊血清封闭1h后，加一抗：Anti-Gastrin（胃泌素）（1:200，Sigma，SAB4501048）特异性标记G细胞，4℃过夜，用PBS洗片3次后，加二抗：山羊抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附的二级抗体（1:1000，Invitrogen，A32740），室温摇90min，之后甩掉二抗，加DAPI染细胞核5min，用PBS洗3次，用50%甘油/PBS封片。用共聚焦显微镜拍照。

(3) 结果

实验结果如图3所示。由图3可知，对照组小鼠的胃窦黏膜中，每20个腺体内约有25个G细胞；感染组小鼠的胃窦黏膜中，每20个腺体内约有30个G细胞；治疗组小鼠的胃窦黏膜中，每20个腺体内约有27个G细胞。提示口服多巴胺可以使幽门螺杆菌感染小鼠胃窦黏膜G细胞数量接近正常水平。染色结果来源于3只小鼠，每只小鼠任取3张切片，每张切片随机选取了3个视野进行拍照。Mean±SD; * P＜0.05；*** P＜0.001。

4、多巴胺能够使幽门螺杆菌感染小鼠血清中胃泌素含量接近正常水平

(1) 实验分组和处理

同样设置对照组、幽门螺杆菌感染10周组（以下简称感染组）以及高剂量多巴胺治疗组（以下简称治疗组）进行实验。

(2) 实验方法

小鼠经异氟烷麻醉后摘眼球取血，静置30min后，在4℃，12000rpm的条件下离心，取上清。之后使用ELISA Kit for Gastrin（胃泌素）试剂盒（CLOUD-CLONE，CEB224Mu）对血清中胃泌素的含量进行测定。

具体实验方法为：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔5孔，依次加入50μL不同浓度的标准品。空白孔加50μL标准品稀释液，余孔加待测样品50μL，然后立即每孔加检测溶液A工作液50μL，轻轻振动，混匀，注意不要有气泡，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，在吸水纸上轻拍酶标板来移除孔内所有液体。重复洗板3次。最后一次洗涤后，吸取或倒出剩余的洗涤缓冲液，将酶标板倒扣在吸水纸上，将残留在孔内的液体全部吸干。每孔加检测溶液B工作液100μL，加上覆膜，37℃温育30分钟。弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同前。每孔加底物溶液 90μL，酶标板加上覆膜，37℃避光显色20分钟。每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm 波长下测量各孔的光密度（O.D.值）。

(3) 结果

实验结果如表1所示。

表1 补充多巴胺对幽门螺杆菌感染小鼠血清胃泌素水平的作用

a)感染组与对照组相比P＜0 .05；b) 治疗组与感染组相比P＜0 .05；n＝8

表1的数据表明，幽门螺杆菌感染会使得血清胃泌素水平升高，而口服多巴胺可以使幽门螺杆菌感染小鼠血清胃泌素含量接近正常水平。

5、结论

口服多巴胺能够提高幽门螺杆菌感染小鼠胃黏膜多巴胺的含量，遏制胃黏膜主细胞解痉多肽表达化生现象的出现，使胃黏膜G细胞数量和血清胃泌素含量接近正常水平。这其中，解痉多肽表达化生现象不仅是胃黏膜主细胞对急性损伤的生理愈合反应，在幽门螺杆菌感染所致的胃黏膜持续性损伤和免疫应答失调的情况下，解痉多肽表达化生现象也会进展至肠化生甚至胃癌。胃泌素主要由胃窦的G细胞产生，在生理状态下通过与生长抑素相互抑制，协调控制壁细胞分泌胃酸。除此之外，胃泌素也是一种营养激素，可以通过血液循环作用于胃黏膜上皮细胞，对其生长和分化过程发挥重要的调节作用。在幽门螺杆菌的慢性炎症时期，胃黏膜腺体萎缩，壁细胞泌酸减少，导致G细胞的数量及其所分泌的胃泌素代偿性增多。过多的胃泌素长期刺激会导致胃黏膜肠嗜铬样细胞增生和癌变，最终发展为类癌甚至胃神经内分泌瘤。口服多巴胺可以阻断或逆转上述病理改变，从而遏制疾病进展。