一种昆仑雪菊抗炎活性成分的分离方法

摘要

本发明属于植物提取物分离技术领域，具体涉及一种昆仑雪菊抗炎活性成分的分离方法。昆仑雪菊中黄酮含量高，但目前发现的昆仑雪菊中黄酮类化合物种类还比较少，有待进一步开发。本发明从昆仑雪菊中分离出了化合物gossypetin‑5‑(6”‑(E)‑caffeoyl)‑β‑D‑glucoside，具体技术方案为：1)昆仑雪菊醇提物，经石油醚、乙酸乙酯分级萃取，收集乙酸乙酯萃取液，除去溶剂，得乙酸乙酯部位浸膏；2)采用大孔树脂柱对乙酸乙酯部位浸膏进行梯度洗脱，梯度的溶剂为0％～40％的乙醇溶液；取40％乙醇洗脱部位得活性部位Fr2；活性部位Fr2静置，析出沉淀，得活性部位Fr2‑1；活性部位Fr2‑1经半制备液相色谱得活性部位Fr2‑1‑2；活性部位Fr2‑1‑2经半制备液相色谱得化合物gossypetin‑5‑(6”‑(E)‑caffeoyl)‑β‑D‑glucoside。本发明为雪菊药物资源的未来开发研究提供可靠的理论和实验依据。

说明书

技术领域

本发明属于植物提取物分离技术领域，具体涉及一种昆仑雪菊抗炎活性成分的分离方法。

背景技术

昆仑雪菊，学名两色金鸡菊(Coreopsis tinctoriaNutt.)。又名蛇目菊、高山寒菊，为菊科(Compositae)金鸡菊属(Coreopsis)多年生草本植物，主要分布于我国新疆和田地区和云南部分地区。晒干后的花蕊、花瓣保存了完整的有机成分，具有很高的营养和药用价值。现代药理学研究表明，昆仑雪菊具有降血糖、抗氧化、抗炎、抗心血管疾病、神经保护、抗肿瘤等多种活性。

Li等从雪菊干燥花序中分离得到酚酸类、查尔酮类、黄酮类、黄酮醇类等多种酚类化合物，将所得化合物作用于LPS诱导的N9细胞，发现这些酚酸类物质可显著抑制N9细胞NO的产生。Zhang等从雪菊头状花序中鉴定出4个新的C14-多乙炔糖苷，命名为核苷A-D，发现各化合物在1×10

另外有文献报道，现已发现雪菊中含有37种黄酮。可见雪菊中黄酮数量丰富，尽管如此，雪菊黄酮类化合物还有待进一步开发，因此有必要对雪菊中黄酮类化合物进行分离鉴定，为雪菊药物资源的未来开发研究提供可靠的理论和实验依据。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种昆仑雪菊黄抗炎活性成分的分离方法，并研究了这些抗炎活性成分的具体作用机制。

经本发明的实验方案对雪菊中的黄酮类化合物进行分离后，首次从昆仑雪菊中发现了化合物5(gossypetin-5-(6”-(E)-caffeoyl)-β-D-glucoside)，其及结构式如下：

具体地，本发明由以下技术方案实现：

一种昆仑雪菊抗炎活性成分的分离方法，包括以下内容：

1)昆仑雪菊醇提物，经石油醚、乙酸乙酯分级萃取，收集乙酸乙酯萃取液，除去溶剂，得乙酸乙酯部位浸膏；

2)采用大孔树脂柱对乙酸乙酯部位浸膏进行梯度洗脱，梯度的溶剂为0％～40％的乙醇溶液；取40％乙醇洗脱部位得活性部位Fr2；活性部位Fr2静置，析出沉淀，得活性部位Fr2-1；

3)活性部位Fr2-1经制备色谱得活性部位Fr2-1-2；

其中，流动相A为:甲醇，流动相B为:水；洗脱条件为：30％～80％A；时间：50min；

4)活性部位Fr2-1-2经制备色谱得化合物5；

其中，流动相A为:甲醇，流动相B为:水；洗脱条件为40％～41％A；时间：60min；Fr2-1-2部位在半制备色谱上的保留时间为7.5～12.5min，化合物5在半制备色谱中的保留时间为12.5min。

本发明中，昆仑雪菊醇提物为昆仑雪菊经加热提取、常温提取、浸取或热回流等常规提取方法提取的醇提物，所用醇为甲醇、乙醇中的一种或两种组合，在本发明的具体实验方案中，所用醇为80％乙醇。

在本发明的技术方案中步骤2)所用大孔树脂柱为AB-8大孔树脂柱。

在本发明的具体技术方案中，步骤2)对乙酸乙酯部位进行梯度洗脱时先用10VB水除去杂质，再用15VB 20％乙醇洗脱得活性部位Fr1，然后再用10BV 40％乙醇洗脱得活性部位Fr2。

在本发明的技术方法中，Fr2为活性部位Fr1静置后析出的沉淀物，通过过滤得到。本发明Fr2活性部位还可通过离心、过滤等常规分离方法得到。

在本发明的技术方案中，步骤3)中制备色谱条件还包括以下i～v项中的任意一项或多项：

i流速：10～20mL/min

ii柱温：25～30℃

iii进样量：100～500μL

iv检测波长：280～360nm；

v色谱柱：C18色谱柱

进一步地，步骤3)中制备色谱条件还包括以下i～v项中的任意一项或多项：

i流速：15mL/min

ii柱温：25℃

iii进样量：500μL

iv检测波长：280nm～360nm

v色谱柱：KromasilC18色谱柱，规格为21.2×250mm，5μm。

在本发明的技术方案中，步骤4)中制备色谱条件还包括以下i～v项中的任意一项或多项：

i流速：10～20mL/min

ii柱温：25～30℃

iii进样量：100～300μL

iv检测波长：280～360nm；

v色谱柱：C18色谱柱

进一步地，步骤4)中制备色谱条件还包括以下i～v项中的任意一项或多项：

i流速：15mL/min

ii柱温：25℃

iii进样量：300μL

iv检测波长：280nm～360nm

v色谱柱：KromasilC18色谱柱，规格为21.2×250mm，5μm。

在本发明的实验方案中，乙醇含量为体积百分含量。

本发明还提供一种由上述方法从昆仑雪菊中提取出的活性部位Fr2、Fr2-1、Fr2-1-2或化合物5在抗炎产品中的应用，所述产品为药物、保健品、食品中的至少一种，具体是将昆仑雪菊活性部位Fr2、Fr2-1、Fr2-1-2、化合物5中的任意一种或多种作为有效成分，按药学上可接受的任何载体制成各类剂型药品，或按食品科学上可接受的任何载体制成各类食品或保健食品。

本发明的有益效果在于：

1、首次从昆仑雪菊中分离出了黄酮类化合物5，经抗炎活性研究表明，化合物5具有一定的抗炎活性，为雪菊药物资源未来的开发研究提供可靠的理论和实验依据。

2、本发明的实验方案还从昆仑雪菊中分离出了化合物1～4及化合物6～12，其中化合物1为异奥卡宁-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；化合物1为异奥卡宁-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；化合物2为原儿茶酸；化合物3为紫铆黄素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；化合物4为栎草亭-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；化合物6为栎草亭；化合物7为紫铆因-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；化合物8为奥卡宁；化合物9为异奥卡宁；化合物10为槲皮素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；化合物11为奥卡宁-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；化合物12为5，7，3’，5’-四羟基二氢黄酮醇。

抗炎活性研究表明化合物3、4、6、8、9、11、12均具有一定的抗炎活性作用。这为以后昆仑雪菊黄酮类化合物抗炎机制进一步研究以及开发具有抗炎保健作用的食品、药品提供了理论基础。

说明书附图

图1为昆仑雪菊乙酸乙酯部位分离技术方案图；

图2为化合物1分析与制备图谱；

图3为Fr1-2分析与制备图谱；

图4为Fr1-2-1分析与制备图谱；

图5为Fr1-2-3分析与制备图谱；

图6为Fr2-1分析与制备图谱；

图7为Fr2-1-2分析与制备图谱；

图8为Fr2-2分析与制备图谱；

图9为Fr2-2-3分析与制备图谱；

图10为Fr2-2-4分析与制备图谱；

图11为Fr3分析与制备图谱；

图12为Fr3-2分析与制备图谱；

图13为化合物1-12HPLC色谱分析图

图14为黄酮类单体化合物对RAW264.7细胞活力影响图；

图15为RAW264.7细胞上清液NO含量图；

图16为RAW264.7细胞的TNF-α、IL-6含量图；

图17为RAW264.7细胞的COX-2相对蛋白表达水平图；

图18为RAW264.7巨噬细胞的TLR-4相对蛋白表达水平图；

图19为RAW264.7巨噬细胞的NF-κB相对蛋白表达水平图；

图20为RAW264.7巨噬细胞的IκBα相对蛋白表达水平图。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

实施例1昆仑雪菊活性成分富集及萃取

3kg昆仑雪菊原料经过80％乙醇渗漉提取，减压浓缩后得到乙醇提取物浸膏786.4g，提取率约为26.2％。乙醇提取物经分级萃取，减压浓缩后，得到石油醚部位浸膏94.0g，乙酸乙酯部位浸膏89.2g，正丁醇部位浸膏197.8g，水部位浸膏406.4g。

实施例2昆仑雪菊黄酮类单体化合物的制备

一、实验仪器

本发明使用的相关仪器设备如表1所示。

表1仪器与设备

在本发明的分离制备环节中，样品分析均采用Agilent 1260高效液相色谱仪；制备均采用汉邦N7010半制备液相；最终所用分析色谱柱均为Kromasil C18，4.6mm×250mm，5μm；制备色谱柱均为Kromasil C18，21.2×250mm，5μm；分析流速均为1mL/min；制备流速均为15mL/min；分析检测波长均为254nm、280nm、360nm；制备检测波长为280nm、360nm。

于玻璃层析柱中加入活化后的AB-8大孔树脂3000mL，对大孔树脂床进行预处理后，取实施例1中的乙酸乙酯部位70.0g溶于200ml去离子水中，用玻璃滴管缓慢转圈滴至树脂床表面后，静态吸附24h。吸附完毕后以10BV去离子水冲洗树脂床，除去糖类等水溶性杂质。依次用20％(15BV)、40％(10BV)、60％(8BV)、80％(6BV)乙醇溶液进行洗脱。合并各浓度洗脱液，减压浓缩，得20％乙醇洗脱部(Fr1)14.34g(其中包括析出沉淀质量4.70g)，40％乙醇洗脱部位(Fr2)14.89g(包括析出沉淀质量4.27g)，60％乙醇洗脱部位(Fr3)3.20g，80％乙醇洗脱部位(Fr4)1.53g。

将20％乙醇洗脱部(Fr1)静置，得析出物Fr1-1，取Fr1-1部位0.05g溶于2mL甲醇并加200μLDMSO助溶，进行HPLC分析，色谱条件为：色谱柱：Kromasil C18，4.6mm×250mm，5μm；进样量：5μL；流速：1mL/min；流动相：乙腈(A)-0.1％甲酸水；洗脱条件：10％～60％A；时间：60min；波长：254nm、280nm、360nm。将4.50g样品与20.00g C18粉末拌样，装预柱上样，制备条件：色谱柱：Kromasil C18，21.2×250mm，5μm；上样量：每次约0.5g拌样C18粉末；流速：15mL/min；流动相：甲醇(A)-水(B)；洗脱条件：25％～60％A；时间：60min；波长：254nm、280nm，分析和制备图谱如图2。得到化合物Fr1-1-1(化合物1：126.2mg，保留时间为：12.3min)。

将20％乙醇洗脱部(Fr1)静置，得上层清液Fr1-1，取Fr1-2部位4.52g溶于200mL甲醇，配成浓度为22mg/mL溶液，进行HPLC分析，色谱条件为：进样量：5μL；流动相：乙腈(A)-0.1％三氟乙酸水(B)；洗脱条件：10％～35％A；时间：40min。制备条件：进样量：300μL；流动相：乙腈(A)-水(B)；洗脱条件：10％～35％A；时间：40min。分段接峰，得Fr1-2-1、Fr1-2-2、Fr1-2-3、Fr1-2-4，分析和制备图谱如图3。

取Fr1-2-1部位溶于10mL甲醇，进行HPLC分析，色谱条件为：色谱柱：进样量：5μL；流动相：甲醇(A)-0.1％三氟乙酸水(B)；洗脱条件：20％～22％A；时间：40min。制备条件：进样量：300μL；流动相：甲醇(A)-水(B)；洗脱条件：18％～19％A；时间：60min。得化合物Fr1-2-1-1(化合物2：27.2mg，保留时间为：7.6min)，分析和制备图谱如图4。

取Fr1-2-3部位溶于20mL甲醇，进行HPLC分析，色谱条件为：进样量：5μL；流动相：甲醇(A)-0.1％三氟乙酸水(B)；洗脱条件：30％～36％A；时间：40min。制备条件：进样量：300μL；流动相：甲醇(A)-水(B)；洗脱条件：30％～34％A；时间：40min。得化合物Fr1-2-3-1(化合物3：121.5mg，保留时间为：10.6min)、Fr1-2-3-2(化合物4：25.1mg，保留时间为：11.1min)，分析和制备图谱如图5。

将40％乙醇洗脱部(Fr2)静置，得析出物Fr2-1，取Fr2-1部位2.08g溶于100mL甲醇中，配成浓度为20mg/mL溶液，进行HPLC分析，色谱条件为：进样量：5μL；流动相：乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)；洗脱条件：20％～35％A；时间：40min。制备条件：进样量：500μL；流动相：甲醇(A)-水(B)；洗脱条件：30％～80％A；时间：50min。分析和制备图谱如图6。

取Fr2-1-2部位(其在半制备色谱上的保留时间为7.5～12.5min)1.21g溶于20mL甲醇，得到浓度约为60mg/mL溶液，过0.22μm滤膜，进行HPLC分析，色谱条件为：进样量：3μL；流动相：甲醇(A)-0.1％三氟乙酸水(B)；洗脱条件：40％～41％A；时间：40min。制备条件：进样量：300μL；流速：15mL/min；流动相：甲醇(A)-水(B)；洗脱条件：40％～41％A；时间：60min。接峰尖，得化合物Fr2-1-2-1(化合物5：8.2mg，保留时间为：12.7min)，Fr2-1-2-2(化合物6：10.6mg，保留时间为：13.2min)，Fr2-1-2-3(化合物7：21.7mg，保留时间为：15.0min)，Fr2-1-2-4(化合物8：820.0mg，保留时间为：18.0min)，分析和制备图谱如图7。

将40％乙醇洗脱部(Fr2)静置，得上层清液Fr2-2，取Fr2-2部位10.02g，溶于200mL甲醇，配成浓度约50mg/mL溶液，进行HPLC分析，色谱条件为：流动相：甲醇(A)-0.1％三氟乙酸水(B)；洗脱条件：20％～50％A；时间：40min。制备条件：进样量：250μL；流动相：甲醇(A)-水(B)；洗脱条件：20％～50％A；时间：40min。得Fr2-2-1、Fr2-2-2、Fr2-2-3、Fr2-2-4，分析和制备图谱如图8。

取Fr2-2-3部位1.96g，溶于40mL甲醇，得到浓度约为50mg/mL溶液，过0.22μm滤膜，进行HPLC分析，色谱条件为：进样量：3μL；流动相：甲醇(A)-0.1％三氟乙酸水(B)；洗脱条件：36％～37％A；时间：40min。制备条件：进样量：500μL；流动相：甲醇(A)-水(B)；洗脱条件：32％～33％A；时间：60min。得单体化合物Fr2-2-3-1(化合物9：73.5mg，保留时间为：19.7min)，Fr2-2-3-3(化合物10：25.9mg，保留时间为：22.6min)。分析和制备图谱如图9。

取Fr2-2-4部位1.26g溶于60mL甲醇，得到浓度约为20mg/mL溶液，过0.22μm滤膜，进行HPLC分析，色谱条件为：进样量：3μL；流动相：甲醇(A)-0.1％三氟乙酸水(B)；洗脱条件：35％～42％A；时间：40min。制备条件：进样量：500μL；流动相：甲醇(A)-水(B)；洗脱条件：35％～40％A；时间：60min。得单体化合物Fr2-2-4-1(化合物11：25.9mg，保留时间为：11.2min)。分析和制备图谱如图10。

取Fr3部位1.0g溶于40mL甲醇，得到浓度约为25mg/mL溶液，过0.22μm滤膜，进行HPLC分析，色谱条件为：进样量：3μL；流动相：乙腈(A)-0.1％三氟乙酸水(B)；洗脱条件：20％～45％A；时间：40min。制备条件：进样量：400μL；流动相：乙腈(A)-水(B)；洗脱条件：20％～45％A；时间：40min。分析和制备图谱如图11。

取Fr3-2部位0.5g溶于20mL甲醇，得到浓度约为25mg/mL溶液，过0.22μm滤膜，进行HPLC分析，色谱条件为：进样量：3μL；流动相：乙腈(A)-0.1％三氟乙酸水；洗脱条件：40％～70％A；时间：40min。制备条件：进样量：300μL；流动相：乙腈(A)-水(B)；洗脱条件：47％～53％A；时间：40min；得单体化合物Fr3-2-1(化合物12：27.1mg，保留时间为：12.5min)。分析和制备图谱如图12。

本发明个化合物的具体分离方法如图1所示。

实施例3昆仑雪菊黄酮类单体化合物的分析鉴定

由Agilent 1260高效液相色谱仪对制备得到的各单体纯度进行分析，最终纯度由峰面积和UV光谱共同确定。各单体化合物通过MS、

1、纯度检测

使用高效液相色谱仪检测了12种黄酮类化合物，UV280nm，见图13。

根据面积归一化法计算出各化合物纯度，结果见表2。

表2黄酮类化合物的纯度

Table 4.3Thepurity offlavonoids

2、结构鉴定

通过柱色谱法对昆仑雪菊中黄酮类化合物进行富集，后结合半制备液相色谱法从目标粗提物中分离制备出单体化合物，对得到的化合物进行表征，便于深入探讨化合物结构与其抗炎活性的关系，为后续的活性实验提供物质基础和化合物结构导向。

大量昆仑雪菊中的活性成分已在过往研究中被分离得到，如聚炔类、黄酮类、多糖类、生物碱类等。基于前人对昆仑雪菊的基础研究，对昆仑雪菊的化学成分进行了系统的分离纯化，除去部分重复分离的化合物，共得到12个单体化合物。通过MS、

化合物1：异奥卡宁-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(黄诺玛苷)，白色粉末，分子式为C

化合物2：原儿茶酸，白色至褐色结晶性粉末，分子式为C

化合物3：紫铆黄素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，淡黄色粉末，分子式为C

化合物4：栎草亭-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，淡黄色粉末，分子式为C

化合物5：gossypetin-5-(6″-(E)-caffeoyl)-β-D-glucoside，淡黄色粉末，分子式为C

化合物6：栎草亭(槲皮万寿菊素)，淡黄色粉末，分子式为C

化合物7：紫铆因-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，橙黄色无定形粉末，分子式为C

化合物8：奥卡宁，橙黄色粉末，分子量288，分子式C

化合物9：异奥卡宁，淡黄色晶体，分子式为C

化合物10：槲皮素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，淡黄色粉末，分子量：464，分子式：C

化合物11：奥卡宁-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(马里苷)，黄色粉末，分子式为C

对比文献，确定化合物11为奥卡宁-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(马里苷)。

化合物12：5，7，3’，5’-四羟基二氢黄酮醇，淡黄色粉末，分子式为C

本发明采用柱色谱法和高效液相色谱法对昆仑雪菊乙酸乙酯部位进行系统的分离纯化，共分离得到12个单体化合物，利用MS、

实施例4黄酮类化合物抗LPS诱导的巨噬细胞炎症损伤作用

研究表明，昆仑雪菊中含有多种生物活性成分，其中黄酮类化合物作为雪菊的主要成分，具有多种药理活性。现有对昆仑雪菊抗炎活性的研究中多采用粗提物，且对炎症因子或相关蛋白的验证较为单一，缺乏系统性和全面性。

发明通过建立RAW264.7细胞炎症模型对分离得到的12个单体化合物的抗炎活性进行考察，通过MTT实验筛选单体化合物的最适作用浓度；通过Griess实验检测细胞上清液中NO含量，筛选抗炎效果显著的化合物；对筛选出的8个化合物进行ELISA实验，检测细胞中IL-6、TNF-α表达水平，并利用Western Blot检测其炎症相关蛋白COX-2、TLR-4、NF-κB、IκBα的表达水平。本发明对雪菊黄酮类化合物的炎症保护作用及其机制进行了较为系统的探讨，旨在为开发雪菊相关的抗炎食品、保健品及药物提供理论依据。

一、实验材料、试剂与仪器

(一)、受试样品来源

通过实施例2分离提取得到了12个黄酮类化合物，它们分别是：原儿茶酸(化合物1)、黄诺玛苷(化合物2)、紫铆黄素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物3)、栎草亭-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物4)、gossypetin-5-(6”-(E)-caffeoyl)-β-D-glucoside(化合物5)、栎草亭(化合物6)、紫铆因-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物7)、奥卡宁(化合物8)、异奥卡宁(化合物9)、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷(化合物10)、马里苷(化合物11)、5，7，3’，5’-四羟基二氢黄酮(化合物12)。

(二)、试剂与材料

本实验使用的相关材料和试剂如表3所示。

表3材料与试剂

(三)、仪器与设备

本实验使用的相关仪器与设备如表4所示。

表4仪器与设备

二、试剂配制

(一)、单体化合物储备液配制

分别称取适量上述12个黄酮类单体化合物，用相应量的DMSO溶解，均配置成浓度100mM的储备液，储存于-20℃冰箱，使用时依据实验用量取用稀释。

(二)5mg/mLMTT配置

将MTT粉末按比例充分溶解于PBS(磷酸缓冲液)中，微孔滤膜除菌并分装后，-20℃避光保存。注意：MTT易见光分解，实验和储存过程均须避光；配制过程应避免染菌；现取现用，不可反复冷冻溶解。

(三)、LPS母液配置

精密称定LPS粉末10mg，溶解于1mL无菌PBS中，按需分装，于-20℃保存。注意：不可反复冷冻溶解。

Westernblot实验所需试剂配制，见表5。

表5 Westernblot实验所需试剂配制

三、实验方法

(一)、LPS作用于RAW264.7巨噬细胞浓度筛选

取生长密度达到80％的RAW264.7细胞，按计数后的密度计算，将细胞以1×10

其中ODs为样品组，OD

(二)、Griess法检测细胞上清液NO含量

1)标准曲线绘制：用预先配制好的完全培养基(DMEM+10％FBS)将1mol/LNaNO

2)样品检测：细胞铺板及给药方法同“(一)”，培养24h后，取出Griess ReagentⅠ和Ⅱ，使回复室温。按NO试剂盒说明书操作。

(三)、MTT检测RAW264.7巨噬细胞

参考查阅文献确定各单体化合物作用于RAW264.7细胞的浓度分别为3.125μM，6.25μM，12.5μM，25μM，50μM，100μM。细胞孵育24h后，换成含有不同浓度各单体化合物的DMEM培养基(含2％FBS)继续培养24h。

(四)、Griess法检测细胞上清液NO

MTT实验明确各单体化合物单体化合物最佳作用浓度后，进行细胞铺板，孵育24h后，换成含有选定浓度各萃取部位及5μg/mL浓度LPS的DMEM培养基(含2％FBS)继续培养24h，利用Griess法检测上清液NO含量。基于各单体化合物的NO检测结果，进行后续单体化合物抗炎活性实验。

(五)、Elisa试剂盒检测细胞上清液TNF-α、IL-6等炎症因子

细胞培养与铺板，铺板后孵育24h，换成含有既定浓度各单体化合物及5μg/mL浓度LPS的DMEM培养基(含2％FBS)继续培养24h，Elisa法检测细胞上清液TNF-α、IL-6炎症因子的含量。参考文献及前期预实验，测定TNF-α炎症因子时，细胞培养上清液须稀释4倍；测定IL-6炎症因子时，细胞培养上清液无须稀释。按照Elisa试剂盒说明书对各炎症因子进行测定。

(六)、Westernblot分析

RAW264.7细胞以1×10

(1)RAW264.7细胞蛋白提取：

1)准备工作：预先准备冰盒，EP管上做好标记，配制细胞裂解液(将RIPA裂解液与PMSF按100：1混合)，PBS储存于4℃冰箱预冷。

2)清洗：尽量吸净培养基，勿有残留。将冷的PBS缓慢转圈加入6孔板中冲洗细胞两次，冲洗完毕后将PBS彻底吸净。

3)细胞裂解：每孔加80μL细胞裂解液，晃动6孔板混匀，置于冰上裂解5min。

4)蛋白提取：用细胞刮刀沿同一方向将蛋白刮下，收集至1.5mL离心管中。

5)离心：将离心管置于冰盒中，放入4℃冰箱中继续裂解30min。裂解完成后于12000r/min，4℃下离心15min，取上清于新的EP管中备用。

(2)BCA法测细胞蛋白浓度：

1)准备工作：将装有蛋白的EP管置于冰盒中。

2)蛋白标准曲线绘制：标准蛋白配制见表6。

表6 BCA法蛋白定量表

(3)采用BCA法测定蛋白的浓度，按照BCA试剂盒说明书进行具体操作。根据BCA测定结果计算后，用PBS和5×loading buffer缓冲液将所有蛋白样品稀释至同一浓度(Westernblot实验中须等体积上样)。

(4)蛋白变性：稀释后的蛋白样品于金属浴中100℃变性15min。变性好的蛋白冷却后，于-80℃储存备用。使用时，须将蛋白样品离心并轻弹EP管底部使样品充分融化。

(5)SDS-PAGE电泳：根据蛋白分子量大小选择相对应的下层胶(分离胶)进行配置。配制电泳胶前，将制胶玻璃板清洗干净后吹干；各溶液预先放置于室温，防止分离胶凝固过程中产生的热量使气体析出而产生气泡。后将两块玻璃板对齐放入制胶架中夹紧并垂直固定于制胶架上，灌入UP水检漏(静置10min水面不下降即说明制胶板放置正确)。倒出UP水后用吸水纸吸取制胶板中残余的水分，准备配置分离胶，分离胶配制参考表7和表8。

表7不同浓度SDS-PAGE分离胶的分离范围

表8配制不同体积8％SDS-PAGE分离胶所需各成分体积

灌入约4.5mL分离胶后，再灌入异丙醇压平液面及除去气泡。待30min后分离胶凝固(可参照未灌入制胶板的分离胶)，倒掉上层异丙醇并用吸水纸吸掉残留，灌入配好的浓缩胶，插入合适的梳子。待40min后，浓缩胶凝固(可参照未灌入制胶板的浓缩胶)，将制好的电泳胶水平夹在电泳槽上，灌入电泳液检漏(漏液或电极不平衡会导致条带偏移或移动缓慢。此时水平拔出梳子，尽量使上样孔保持垂直状态。提蛋白前需将样品离心至完全融化，上样20～30μg，按所需在两端及/或中间加入Marker。上样完成后，补足电泳液，开始电泳，先用恒压80V，使样品在浓缩胶中浓缩30min左右，待样品电泳行至分离胶后，换成恒压120V继续分离50～90min，电泳至蓝色条带距离制胶板最下端5～10mm时停止电泳。

(6)转膜：首先剪取合适大小PVDF膜(具体依据蛋白所需分子量和不同分离胶中该分子量的范围)，剪去一个角作为标记(后续实验中区分正反面)。将甲醇活化1min后的PVDF膜、海绵、滤纸依次浸泡在预冷的转膜液中。将海绵和滤纸依次放于转膜夹黑色的一面。取出电泳槽内的玻璃板，将玻璃板用切胶刀撬动后，按照Marker标识切下目标蛋白所在的电泳胶，置于黑色转膜夹的滤纸上，此事须注意避免电泳胶与滤纸间产生气泡，再将PVDF膜放在电泳胶上，同时注意排除PVDF膜与电泳胶之间的气泡。最后，将滤纸和海绵覆盖于上。安装完毕后将夹子置于转膜仪中，黑色夹子面向电泳槽黑面，恒流250mA，依据分子量大小设定时间为30～90min不等(转膜仪中须放置冰袋，通电后将转膜仪器置于冰水混合物中，避免过热导致蛋白质降解)。

(7)封闭：封闭液为5％脱脂牛奶。转膜结束后打开转膜夹，检查Marker是否完全转移至PVDF膜上，若电泳胶上仍残留Marker，则蛋白可能未转膜完全，下次实验时须适当加大电流或增加时间。若Marker已转至膜背面，则下次实验时须减少时间。转膜结束后，将PVDF膜放入抗体孵育盒，加脱脂牛奶没过PVDF膜，置于室温摇床，慢摇1.5～2h或4℃过夜。

(8)孵育一抗：用TBST冲洗掉封闭液，将孵育盒置于4℃摇床，调至慢速，孵育过夜。

(9)孵育二抗：回收一抗，用TBST于室温将PVDF膜清洗3次，每次8min，之后室温慢速孵育二抗1h。孵育完毕后用TBST于室温将PVDF膜清洗3次，每次8min。

(10)显影：采用ECL化学法，将ECL发光液滴加在在PVDF膜上，用凝胶成像。

(七)、统计学分析

所有数据采用GraphPad Prism分析软件统计分析，组间比较采用单因素方差(OneWayANOVA)，P＜0.05表示结果具有统计学差异，P＜0.01表示结果具有显著统计学差异，P＜0.001表示结果具有极显著统计学差异。

四、实验结果

(一)、黄酮类化合物对RAW264.7细胞活力影响

通过MTT法检测各受试物对5μg/mL浓度LPS诱导作用下RAW264.7细胞活力的影响。实验中对各单体化合物受试物的测试分别设置了6组浓度梯度(3.125μM，6.25μM，12.5μM，25μM，50μM，100μM)。从图14可以看出，不同浓度的化合物1～7作用于RAW264.7细胞后，细胞活力都在80％以上；化合物8～10、12在作用浓度大于12.5μM时，细胞活力降低并呈现浓度依懒性，且下降幅度较大。我们选择小于12.5μM的浓度作为单体化合物的作用浓度，最终我们选择10μM作为黄酮类单体合物的剂量浓度。

(二)、黄酮类化合物对RAW264.7细胞NO水平影响

将各浓度为10μM的单体化合物与5μg/mL的LPS共同作用于RAW264.7细胞24h，Griess法检测细胞培养液中NO含量。如图15，可以发现5μg/mL浓度的LPS处理组与正常细胞对照组相比NO含量极显著增加(P<0.001)；化合物3、4、5、6、8、9、11、12作用于RAW264.7巨噬细胞后，对NO的产生有不同程度的抑制作用。据此我们选择化合物3、4、5、6、8、9、11、12进行后续实验。

(三)、黄酮类化合物对RAW264.7细胞TNF-α、IL-6水平影响

通过Elisa法检测各单体化合物对5μg/mL浓度LPS诱导作用下RAW264.7细胞的TNF-α、IL-6水平影响。如图16，可以发现5μg/mL浓度的LPS处理组与正常细胞对照组相比TNF-α和IL-6炎症因子的含量极显著增加(P<0.001)；化合物3、4、5、6组TNF-α和IL-6炎症因子的产生与LPS模型对照组相比差异不具有统计学意义(P>0.05)。化合物8、9、11、12组与LPS模型对照组相比差异极显著(P<0.001)，能够明显抑制TNF-α和IL-6炎症因子的产生。

(四)、黄酮类化合物对RAW264.7细胞炎症相关蛋白表达影响

(1)黄酮类化合物对RAW264.7细胞COX-2表达水平的影响

在炎症过程中，环氧合酶-2(COX-2)在放大炎症反应中起关键作用。环氧合酶-2(COX-2)是一种诱导性酶，在正常生理条件下很少表达，在炎症或肿瘤病理状态下表达增加。

如图17所示，与正常细胞对照组相比5μg/mL浓度的LPS处理组的COX-2表达水平极显著升高(P<0.001)，化合物3、5与LPS模型对照组相比存在统计学差异(P＜0.05)，化合物8、9、11、12组与LPS模型对照组相比差异极显著(P<0.001)，能够明显降低COX-2的表达水平。

(2)黄酮类化合物对RAW264.7细胞TLR-4表达水平的影响

TLRs含有一个与IL-1受体信号域同源的细胞质结构域，TLRs的激活导致NF-κB的激活，并诱导激活适应性免疫反应所需的细胞因子。

如图18所示，与正常细胞对照组相比5μg/mL浓度的LPS处理组的COX-2表达水平极显著升高(P<0.001)，化合物4与LPS模型对照组相比存在统计学差异(P＜0.05)，化合物8、9、11、12组与LPS模型对照组相比差异极显著(P<0.001)，能够明显降低TLR-4的表达水平。

(3)黄酮类化合物对RAW264.7细胞NF-κB表达水平的影响

核因子κB(NF-κB)可以调节大量参与免疫和炎症反应以及细胞增殖分化的基因表达。NF-κB被细胞因子、炎症损伤、感染和其他需要快速重新编程基因表达的应激条件激活以响应各种刺激

如图19所示，与正常细胞对照组相比5μg/mL浓度的LPS处理组的表达水平极显著升高(P<0.001)，化合物5与LPS模型对照组相比存在统计学差异(P＜0.05)，化合物8、9、11、12组与LPS模型对照组相比NF-κB相对蛋白表达水平差异极显著(P<0.001)，能够明显降低NF-κB的表达水平。

(4)黄酮类化合物对RAW264.7细胞IκBα表达水平的影响

在静息状态下，IκB(inhibitor ofNF-κB)以失活状态存在于细胞质中，当IKK(IκBkinase)被上游的TLR-4/NF-κB信号通路激活后，会磷酸化并降解IκBα，启动炎性细胞因子转录并最终诱发炎症。

如图20所示，与正常细胞对照组相比5μg/mL浓度的LPS处理组的IκBα相对蛋白表达水平极显著升高，(P<0.001)，化合物3与LPS模型对照组相比存在统计学差异(P＜0.05)，化合物8、9、11、12组与LPS模型对照组相比差异极显著(P<0.001)，能够明显降低IκBα相对蛋白的表达水平。

通过Westerm Blot实验进一步研究发现，黄酮类化合物能够不同程度上抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NF-κB、p-IκBa的磷酸化水平，同时能够下调Toll样受体(TLR-4)、促炎介质(COX-2)和促炎细胞因子(TNF-α和IL-6)的释放:表明昆仑雪菊中的黄酮类化合物整体上具有抗炎活性，从而抑制巨噬细胞炎性反应。但是NO实验筛选出的8种化合物抗炎活性具有差异性，活性强弱顺序依次为12＞11＞9＞8＞3、4、5、6。这种活性的差异，一方面来自于细胞水平对化合物作用的差异性，另一方面与化合物自身的结构特异性相关。

综上所述，本发明对从昆仑雪菊乙酸乙酯部位分离纯化的12个化合物的体外细胞水平抗炎活性进行了评价，研究发现，8个黄酮类化合物的NO抑制作用较好，4个黄酮类化合物表现出良好的抗炎活性，这为以后昆仑雪菊黄酮类化合物抗炎机制进一步研究以及开发具有抗炎保健作用的食品、药品提供了理论基础。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式只局限于这些说明。对本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。