西维来司他钠在制备治疗登革病毒感染所致不良妊娠的药物中的应用

摘要

本发明涉及医药技术领域，具体涉及西维来司他钠在制备治疗登革病毒感染所致不良妊娠的药物中的应用。本发明的研究证明了西维来司他钠可以减轻胎盘中中性粒细胞浸润引发的血管损伤。并且，西维来司他钠可以增加胎盘中的血流灌注，减弱登革病毒感染所引发的胎儿生长发育受限。本发明提供的西维来司他钠的新用途，为临床提供了一种治疗或预防孕妇登革病毒感染所致不良妊娠的新方法和候选药物。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及西维来司他钠在制备治疗登革病毒感染所致不良妊娠药物中的应用。

背景技术

登革病毒(Dengue virus,DENV)是一种通过蚊虫叮咬进行传播的黄病毒，包括四种不同的血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4)。DENV感染可在人一生中的任何年龄和时间发生，导致自限性登革热，甚至出现可能致命的登革出血热(DHF)或登革休克综合征(DSS)。

孕妇属于高危人群，临床研究表明，妊娠期登革病毒感染可能增加孕妇流产、早产、产后出血、产妇死亡的风险，并增加发生胎儿宫内死亡、低出生体重、先天缺陷、新生儿围产期死亡的可能性。早产和低出生体重是孕产妇登革热感染最常见的不良妊娠结局。

目前DENV感染引发不良妊娠的确切机制尚未阐明，也无有效的疫苗和特异性治疗药物用于防治。研究其确切机制和探寻有效的药物，有效避免不良妊娠结局的发生是当今亟需解决的问题。

西维来司他钠(Sivelestat Sodium)，即[[2-[[[4-[(2,2-二甲基丙酰基)氧基]苯基]磺酰基]氨基]苯甲酰基]氨基]乙酸钠，是一种外源性的中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)竞争性抑制剂，对急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征有很好的保护作用。目前临床上主要用于治疗全身性炎症反应综合征等疾病。研究还发现西维来司他钠能够减轻肝脏部分切除后的肝脏损伤，能够减少高迁移率族蛋白的释放和降低IL-6的水平。但西维来司他钠在孕妇DENV感染导致的胎盘损伤是否有保护作用，目前国内外未见相关报道。

发明内容

本发明的目的是治疗登革病毒感染所致不良妊娠。本发明的研究证明了西维来司他钠可以减轻胎盘内，中性粒细胞浸润引发的血管损伤，并且西维来司他钠可以增加胎盘中的血流灌注，减弱登革病毒感染所引发的胎儿生长发育受限。

第一方面，本发明请求保护，西维来司他钠在制备治疗登革病毒感染所致不良妊娠的药物中的应用，所述不良妊娠包括孕妇胎盘损伤、胎儿生长受限及胎儿低出生体重。

第二方面，本发明请求保护，西维来司他钠在制备治疗孕妇胎盘内中性粒细胞浸润引发的血管损伤的药物中的应用。

在西维来司他钠用于制备治疗孕妇胎盘内中性粒细胞浸润引发的胎盘血管损伤的药物时，所述损伤是炎性损伤。

在西维来司他钠用于制备治疗孕妇胎盘内中性粒细胞浸润引发的胎盘血管损伤的药物时，所述血管损伤由孕妇登革病毒感染引发的。

第三方面，本发明请求保护西维来司他钠在制备增加胎盘的血流灌注的药物中的应用。

在上述的应用中，所述药物的剂型包括但不限于：片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂或注射剂。

第四方面，本发明请求保护一种治疗登革感染引发不良妊娠的药物，所述药物含有西维来司他钠及其变体。

本发明所提供的治疗登革感染引发不良妊娠的药物中，还包括辅料，辅料选自增溶剂、助溶剂、乳化剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、渗透压调节剂、稳定剂、矫味剂、助悬剂、渗透促进剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、包合剂、包衣材料中的任意一种或几种。

第五方面，本发明还请求保护一种治疗登革感染引发不良妊娠的方法，向感染登革病毒的孕妇施用西维来司他钠。

本发明的有益效果在于：

本发明首次发现了，用于治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的西维来司他钠可以治疗登革病毒感染导致的不良妊娠。更具体地，西维来司他钠可以通过改善登革病毒感染引发的胎盘血管破坏进而缓解胎儿生长发育受限。

本发明通过实验证实了，西维来司他钠可以减轻胎盘中中性粒细胞浸润引发的血管损伤，并且，西维来司他钠可以增加胎盘中的血流灌注，减弱登革病毒感染所引发的胎儿生长发育受限。

本发明提供的西维来司他钠的新用途，为临床提供了一种治疗或预防孕妇登革病毒感染所致不良妊娠的新方法和候选药物。

附图说明

图1中A为利用单细胞测序技术对胎盘组织中的细胞构成进行分析的结果。B为利用中性粒细胞marker(Itgam以及Ly6g)对粒细胞群再分类的结果。

图2中A为本发明的实施例中西维来司他钠治疗后，孕鼠体重变化。B为本发明的实施例中西维来司他钠治疗后，检测胎鼠、胎盘的大体观。C为本发明的实施例中西维来司他钠治疗后，胎盘及胎鼠重量统计图。

图3为本发明的实施例中西维来司他钠治疗后，胎盘中的DENV RNA水平统计图，显示西维来司他钠无明显抑制病毒复制的作用。

图4为小鼠胎盘HE染色结果图(比例尺为100μm)，显示西维来司他钠治疗可以缓解DENV-2感染引发的胎盘组织损伤。

图5中A为用CD34

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本实施例所用实验材料如下：

1.1实验动物

健康成年的Ⅰ型干扰素受体敲除(Ifnar1

1.2受试药物

西维来司他钠(Sivelestat Sodium)购自美国AbMole公司。瞬时离心后，加入无菌PBS缓冲液进行溶解，配制成10mg/mL的溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤灭菌处理后，-20℃保存待用。

本实施例的实验方法如下：

2.1建立DENV-2感染的孕鼠模型

(1)将8-10周龄的雌性A6小鼠与正常成年A6雄鼠按照2：1的比例同笼一天，次日，检查雌鼠阴道栓并移出雄鼠，见栓记为妊娠的第0.5天(Embryonic day 0.5，E0.5)；

(2)在雌鼠妊娠的第12.5天(E12.5)，轻柔抓起小鼠，将其装入筒状固定器中，暴露后下肢，经足垫(皮下)每只注射1.0×10

(3)在病毒感染后的第6天(E18.5)时，安乐死小鼠并取材；

(4)从同笼开始，每天记录雌鼠体重变化；攻毒后，每日观察孕鼠发病情况并记录体重。

2.2检测孕鼠模型的DENV-2病毒载量

(1)提取RNA：处死孕鼠时，取100μL全血中加入1mL TransZol裂解液(购于北京全式金公司)，剧烈涡旋振荡混匀后按照说明书提取RNA；对于重要脏器组织，按照每1mLTransZol裂解液中加入50-100mg新鲜组织并研磨后进行RNA提取。用RNase-free水溶解RNA沉淀后分装冻存备用。

(2)采用反转录荧光定量PCR(SYBR Green法)对样本中的病毒RNA进行检测，用到的试剂盒为北京天根生化公司生产。根据标准曲线，将每个样品的Ct值代入方程式即可得出样品中病毒RNA拷贝数。全血中的病毒载量记为病毒RNA拷贝数/mL全血，组织中的病毒载量记为病毒RNA拷贝数/g组织。

2.3胎盘单细胞测序分析

建立孕鼠感染模型如前文所述；未感染组与DENV-2感染组各3只小鼠，在E18.5时，每组在3只小鼠中各随机取一个胎盘混合为一个测序样本，并于取样后24小时内完成单细胞悬液制备、建库测序等步骤。单细胞测序委托杭州联川生物技术公司完成。

2.4胎盘的病理学检查

(1)新鲜胎盘组织取出后，在PBS缓冲液中洗涤后，放入4％PFA中固定过夜(通常24h)后，转移至75％乙醇中，4℃冰箱保存备用。

(2)固定后，经脱水、透明、浸蜡等步骤后完成组织蜡块制作；适时将组织蜡块切为5μm的组织切片，经展片和烘干后长期保存。

(3)HE染色：先将组织切片置于60℃烘箱中进行熔蜡，随后置于二甲苯以及梯度酒精中进行脱蜡；细胞核染色使用的是北京中杉金桥生物技术公司生产的苏木素染液，细胞质染色使用的是北京索莱宝科技公司生产的伊红染液；染色结束后用中性树胶封片干燥，于显微镜下观察并拍照分析。

2.5胎盘血管的免疫组织化学分析

(1)胎盘组织切片经熔蜡、脱蜡后，需封闭内源性过氧化物酶，封闭液购自北京中杉金桥生物技术公司；随后进行膜打孔、抗原修复，抗原修复采用pH＝9.0Tris-EDTA抗原修复液，购自北京索莱宝科技有限公司；用1％BSA封闭非特异位点后，加一抗孵育过夜，兔抗小鼠CD34抗体购自美国Abcam公司(ab81289)，使用时按照1：600的比例进行稀释。

(2)经洗涤后使用购自北京中杉金桥生物技术公司的兔二步法检测试剂盒以及DAB显色试剂盒对CD34阳性细胞进行定位；细胞核染色方法与HE染色相同。

(3)胎盘微血管密度采用AngioTool软件进行分析。

2.6统计结果分析

定量数据用平均值(mean)±标准差(standard deviation，SD)表示。所有数据使用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析，多个样本均数比较采用方差分析(ANOVA)检验差异的显著性。P<0.05(*)、P<0.01(**)和P＜0.001(***)分别表示数据差异有统计学意义、有显著统计学意义和有极显著统计学差异。

本实施例的实验结果如下：

(1)DENV-2感染的孕鼠胎盘内大量中性粒细胞浸润：

怀孕的建立和维持需要细胞外基质(ECM)的降解和重构，有利于胎盘血管的生成。在这一过程中，中性粒细胞发挥着重要作用，一方面，中性粒细胞释放弹性蛋白酶等特异性蛋白酶，紧密调控ECM的降解以及促进新血管形成。另一方面，中性粒细胞异常的聚集或激活可能损伤胎盘组织，甚至导致妊娠相关不良结局的发生。

图1的A为利用单细胞测序技术对胎盘组织中的细胞构成进行分析的结果。DENV-2感染的孕鼠胎盘里的粒细胞数量明显增多(如框内所示)。图1的B为利用中性粒细胞marker(Itgam以及Ly6g)对粒细胞群再分类，显示了异常增加的粒细胞群主要为中性粒细胞。图1的A及图1的B的结果显示了，DENV-2感染孕鼠后，引发胎盘中中性粒细胞的大量聚集。

(2)西维来司他钠治疗可以改善DENV-2感染孕鼠引发的胎鼠生长发育受限：

Sivelestat治疗可有效缓解DENV-2感染引发的孕鼠体重下降(图2的A)，以及胎盘、胎儿重量下降(图2的B和图2的C)，这说明Sivelestat可以缓解DENV-2感染引发的胎鼠生长发育受限。(*,P＜0.05；***,P＜0.001)。

(3)西维来司他钠几乎不影响DENV-2的复制

图3为DENV-2感染组及Sivelestat治疗组重要脏器病毒载量检测结果。相较于DENV-2感染组，Sivelestat治疗并不能有效减少孕鼠血液、肝脏、脾脏以及胎盘中的病毒RNA水平，提示Sivelestat并不能通过抑制病毒复制来减轻感染的影响，进一步提示配伍抗病毒药物可能达到更好的治疗效果。

(4)西维来司他钠可以减轻DENV-2感染引发的胎盘组织损伤，增加胎盘中的血流灌注

图4为孕鼠胎盘组织HE(苏木素-伊红)染色结果。相较于DENV-2感染组，Sivelestat治疗后，胎盘巨细胞滋养层区血管有明显的红细胞充盈的现象(用空心箭头指示)，迷路区血流灌注也有所恢复，血管分布较为规则、均一。

(5)西维来司他钠可以缓解DENV-2感染引发的胎盘血管破坏

从胎盘组织CD34阳性微血管免疫组化染色结果来看，与DENV-2感染组相比，Sivelestat治疗后，胎盘迷路区微血管损伤有所恢复，血管壁增厚，闭合血管较少(见图5的A)，且微血管密度有所提升，血管分支也有所提升(见图5的B)，这表明Sivelestat治疗可以缓解DENV-2感染孕鼠引发的胎盘血管异构，进而缓解胎儿生长发育受限。(*,P＜0.05；**,P＜0.01；***,P＜0.001)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。