一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法

摘要

本发明涉及发酵酵母筛选基因技术领域，且公开了一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，包括材料的准备，所述材料的准备包含有诱饵克隆pGBKT7‑gA9‑nosc‑221、诱饵载体pGBKT7、文库酵母质粒pGADT7‑多肽cDNA、Clontech酵母双杂交系统、培养基的准备，所述培养基的准备包含有大肠杆菌培养基、酵母完全培养基、酵母缺陷型筛选培养基以及其他贮备液。具体包含将诱饵质粒转化受体菌AH109中及其自激活检测、文库筛选、酵母阳性克隆鉴定及测序比对、酵母阳性克隆回转验证，以构建到pGBKT7载体上的gA9‑nosc‑221基因为诱饵，筛选酵母双杂交多肽文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和BLAST比对分析，确定与pGBKT7‑gA9‑nosc‑221相互作用的多肽，该确定多肽蛋白的方法更加高效，大大提高了研究的效率。

说明书

技术领域

本发明涉及发酵酵母筛选基因技术领域，具体为一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法。

背景技术

基因(遗传因子)是产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列，基因支持着生命的基本构造和性能，储存着生命的种族、血型、孕育、生长、凋亡等过程的全部信息，环境和遗传的互相依赖，演绎着生命的繁衍、细胞分裂和蛋白质合成等重要生理过程，生物体的生、长、衰、病、老、死等一切生命现象都与基因有关，它也是决定生命健康的内在因素，因此，基因具有双重属性：物质性和信息性，带有遗传信息的DNA片段称为基因，其他的DNA序列，有些直接以自身构造发挥作用，有些则参与调控遗传信息的表现，组成简单生命最少要265到350个基因，蛋白质作为基因的重要组成部分十分不易被筛选与发现，现在随着人们对于基因研究的深入，人们开始对多肽进行深入研究，但是目前的研究方法不够完善导致基因研究进程缓慢，为了提高研究效率，现提出一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，该方法的目的是发现pGBKT7-gA9-nosc-221的相互作用蛋白。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，具备以构建到pGBKT7载体上的gA9-nosc-221基因为诱饵，筛选酵母双杂交多肽文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和BLAST比对分析，确定与pGBKT7-gA9-nosc-221相互作用的多肽的优点，解决了当下基因研究效率缓慢，研究方法不够简便的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，包括材料的准备，所述材料的准备包含有诱饵克隆pGBKT7-gA9-nosc-221、诱饵载体pGBKT7、文库酵母质粒pGADT7-多肽cDNA、Clontech酵母双杂交系统、培养基的准备，所述培养基的准备包含有大肠杆菌培养基、酵母完全培养基、酵母缺陷型筛选培养基以及其他贮备液；

所述酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法具体包含以下步骤：

S100、将诱饵质粒转化受体菌AH109中及其自激活检测；

S101、文库筛选；

S102、酵母阳性克隆鉴定及测序比对；

S103、酵母阳性克隆回转验证。

优选的，所述将诱饵质粒转化受体菌AH109中及其自激活检测包含酵母转化、酵母转化方法、自激活检测，所述酵母转化方法包含以下步骤：

S200、从YPDA平板挑取AH109单菌落接种于YPDA液体培养基4ml，30℃，225rpm，振荡培养18-20h(过夜)，至OD600>1.5；

S201、转接YPDA液体培养基，培养体积为50ml，使初始OD600＝0.2，30℃，225rpm，振荡培养4-5h，至OD600＝0.6；

S202、离心收菌，室温，4000rpm，5min；

S203、用20ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；

S204、用5ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；

S205、用500ul 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5ml离心管，每个50ul(每个转化)，备用；

S206、每个1.5ml离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1min左右，至完全混匀；

S207、30℃水浴孵育，30min，42℃水浴热激，25min，30℃水浴复苏，30min；

S208、离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；

S209、每个转化用200ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板，30℃恒温培养4d。

优选的，所述文库筛选是用含有pGBKT7-gA9-nosc-221诱饵质粒的AH109酵母菌株作为受体制备感受态，将文库质粒pGADT7-多肽cDNA转入其中，涂SD-TLH筛选平板，所述文库筛选包含有文库DNA转化方法，具体步骤如下：

S300、从SD-T平板挑取单菌种接于液体SD-T培养基50ml，30℃，225rpm，振荡培养24h；

S301、转接于YPDA液体500ml，使初始OD600＝0.2，30℃，225rpm，振荡培养4-5h，至OD600＝0.6；

S302、离心收菌，室温，4000rpm，5min；

S303、用30ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；

S304、用20ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；

S305、用10ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；

S306、向离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1min左右，至完全混匀；

S307、30℃水浴孵育，30min，42℃水浴热激，25min，30℃水浴复苏1h；

S308、离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清，用6ml无菌水重悬菌体，尽量温和地混匀，从中取20ul培养物稀释后涂SD-TL平板，用于检测文库转化效率。其余涂SD-TLH，共20块；

S309、30℃恒温培养3-7d，观察菌落生长，挑取长出的克隆单菌落，转接到SD-TLH筛选平板中继续培养3-5d。

优选的，所述酵母阳性克隆鉴定及测序比对是为了鉴定SD-TLH平板中筛选到的阳性克隆分别是什么基因，需要将这些阳性克隆从酵母细胞中扩增出来进行DNA测序，并与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对分析。

优选的，所述酵母阳性克隆回转验证是将划线于SD-TLH缺陷型平板上长出的阳性克隆分别用无菌水稀释后点至SD-TL、SD-TLH、SD-TLHA和SD-TLHA+X-α-gal缺陷平板，30℃恒温培养3-4d。

优选的，所述回转验证结果表明阳性对照能在SD-TL、SD-TLH、SD-TLHA和SD-TLHA+X-α-gal缺陷平板上生长，在SD-TLHA+X-α-gal缺陷平板上显蓝色；阴性对照仅在SD-TL平板上能生长，而在其他平板都不能生长，筛选得到的31个酵母阳性克隆，31个阳性克隆能在SD-TL缺陷型平板上正常生长，31个阳性克隆能在SD-TLH缺陷型平板上生长，4个阳性克隆能在SD-TLHA、SD-TLHA+X-α-gal平板上生长，3个克隆能在SD-TLHA+X-α-gal缺陷平板上显蓝色。

与现有技术相比，本发明提供了一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，具备以下有益效果：

1、该酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，具体包含将诱饵质粒转化受体菌AH109中及其自激活检测、文库筛选、酵母阳性克隆鉴定及测序比对、酵母阳性克隆回转验证，以构建到pGBKT7载体上的gA9-nosc-221基因为诱饵，筛选酵母双杂交多肽文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和BLAST比对分析，确定与pGBKT7-gA9-nosc-221相互作用的多肽，该确定多肽蛋白的方法更加高效，大大提高了研究的效率。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，具备以构建到pGBKT7载体上的gA9-nosc-221基因为诱饵，筛选酵母双杂交多肽文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和BLAST比对分析，确定与pGBKT7-gA9-nosc-221相互作用的多肽的优点，解决了当下基因研究效率缓慢，研究方法不够简便的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法，包括材料的准备，所述材料的准备包含有诱饵克隆pGBKT7-gA9-nosc-221、诱饵载体pGBKT7、文库酵母质粒pGADT7-多肽cDNA、Clontech酵母双杂交系统、培养基的准备，所述培养基的准备包含有大肠杆菌培养基、酵母完全培养基、酵母缺陷型筛选培养基以及其他贮备液；

所述酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法具体包含以下步骤：

S100、将诱饵质粒转化受体菌AH109中及其自激活检测；

S101、文库筛选；

S102、酵母阳性克隆鉴定及测序比对；

S103、酵母阳性克隆回转验证。

具体的，所述将诱饵质粒转化受体菌AH109中及其自激活检测包含酵母转化、酵母转化方法、自激活检测，所述酵母转化方法包含以下步骤：

S200、从YPDA平板挑取AH109单菌落接种于YPDA液体培养基4ml，30℃，225rpm，振荡培养18-20h(过夜)，至OD600>1.5；

S201、转接YPDA液体培养基，培养体积为50ml，使初始OD600＝0.2，30℃，225rpm，振荡培养4-5h，至OD600＝0.6；

S202、离心收菌，室温，4000rpm，5min；

S203、用20ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；

S204、用5ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；

S205、用500ul 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5ml离心管，每个50ul(每个转化)，备用；

S206、每个1.5ml离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1min左右，至完全混匀；

S207、30℃水浴孵育，30min，42℃水浴热激，25min，30℃水浴复苏，30min；

S208、离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；

S209、每个转化用200ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板，30℃恒温培养4d。

具体的，所述文库筛选是用含有pGBKT7-gA9-nosc-221诱饵质粒的AH109酵母菌株作为受体制备感受态，将文库质粒pGADT7-多肽cDNA转入其中，涂SD-TLH筛选平板，所述文库筛选包含有文库DNA转化方法，具体步骤如下：

S300、从SD-T平板挑取单菌种接于液体SD-T培养基50ml，30℃，225rpm，振荡培养24h；

S301、转接于YPDA液体500ml，使初始OD600＝0.2，30℃，225rpm，振荡培养4-5h，至OD600＝0.6；

S302、离心收菌，室温，4000rpm，5min；

S303、用30ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；

S304、用20ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；

S305、用10ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清；

S306、向离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1min左右，至完全混匀；

S307、30℃水浴孵育，30min，42℃水浴热激，25min，30℃水浴复苏1h；

S308、离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清，用6ml无菌水重悬菌体，尽量温和地混匀，从中取20ul培养物稀释后涂SD-TL平板，用于检测文库转化效率。其余涂SD-TLH，共20块；

S309、30℃恒温培养3-7d，观察菌落生长，挑取长出的克隆单菌落，转接到SD-TLH筛选平板中继续培养3-5d。

具体的，所述酵母阳性克隆鉴定及测序比对是为了鉴定SD-TLH平板中筛选到的阳性克隆分别是什么基因，需要将这些阳性克隆从酵母细胞中扩增出来进行DNA测序，并与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对分析。

具体的，所述酵母阳性克隆回转验证是将划线于SD-TLH缺陷型平板上长出的阳性克隆分别用无菌水稀释后点至SD-TL、SD-TLH、SD-TLHA和SD-TLHA+X-α-gal缺陷平板，30℃恒温培养3-4d。

具体的，所述回转验证结果表明阳性对照能在SD-TL、SD-TLH、SD-TLHA和SD-TLHA+X-α-gal缺陷平板上生长，在SD-TLHA+X-α-gal缺陷平板上显蓝色；阴性对照仅在SD-TL平板上能生长，而在其他平板都不能生长，筛选得到的31个酵母阳性克隆，31个阳性克隆能在SD-TL缺陷型平板上正常生长，31个阳性克隆能在SD-TLH缺陷型平板上生长，4个阳性克隆能在SD-TLHA、SD-TLHA+X-α-gal平板上生长，3个克隆能在SD-TLHA+X-α-gal缺陷平板上显蓝色。

工作原理：该酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法包括材料的准备，所述材料的准备包含有诱饵克隆pGBKT7-gA9-nosc-221、诱饵载体pGBKT7、文库酵母质粒pGADT7-多肽cDNA、Clontech酵母双杂交系统、培养基的准备，所述培养基的准备包含有大肠杆菌培养基、酵母完全培养基、酵母缺陷型筛选培养基以及其他贮备液，酵母双杂交筛选多肽文库的实验方法具体包含将诱饵质粒转化受体菌AH109中及其自激活检测、文库筛选、酵母阳性克隆鉴定及测序比对、酵母阳性克隆回转验证，以构建到pGBKT7载体上的gA9-nosc-221基因为诱饵，筛选酵母双杂交多肽文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和BLAST比对分析，确定与pGBKT7-gA9-nosc-221相互作用的多肽，该确定多肽蛋白的方法更加高效，大大提高了研究的效率。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。