一种研究力学与生化信号诱发单细胞动力学响应的高通量微流控系统及其使用方法

摘要

一种研究力学与生化信号诱发单细胞动力学响应的高通量微流控系统及其使用方法，属于细胞生物学实验装置领域。该系统包括微流控芯片及外围加载、检测与控制装置。加载装置结合控制装置，可捕获或操控大量单细胞，并对细胞精确加载不同的动态力学和生化刺激信号。控制装置接收来自检测装置实时观测到的单细胞变形、运动轨迹、生化信号时空分布等动态图像信息、以及加载装置中的压力/流量值，以此反馈控制加载装置，操控单细胞变形过程并精准控制微通道流场与生化信号传输，精准模拟体内细胞动态力学和生化微环境。本发明可实现大量单细胞的高效捕获与操控，并用于分析单细胞在不同动态力学和生化信号刺激下的动力学响应及其机制等细胞生物学研究。

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学实验装置领域，是基于流体力学和微流控芯片技术设计的由微流控芯片及外围加载、检测与控制装置组成的、用于定量研究动态力学与生化信号诱发单细胞动力学响应的高通量微流控系统。

背景技术

在体细胞存在于周围组织细胞、细胞间质及体液构成的复杂动态流动微环境中，细胞不仅受微环境中流体剪切力、正压力、牵张力等力学信号的刺激，而且受微环境中生化因子、激素、神经递质等生化物质浓度信号的协同刺激。细胞能识别来自胞外微环境中的力学与生化信号，通过各种信号通路将信号转导并传递至细胞内部，引起胞内第二信使浓度和转录水平改变、基因表达及蛋白质合成等一系列细胞事件，呈现多尺度的时间和空间动态响应，即为细胞的动力学响应，这些动力学响应与细胞分裂、分化、增殖、凋亡等功能和行为密切相关。

与经典的单细胞生物学着重研究细胞的分子组学与标志、形态、亚细胞结构及细胞器的功能不同，细胞动力学研究将胞外微环境中的力学信号和生化信号视作输入，细胞受力变形和胞内生化信号动力学响应等视作输出，细胞的力学和生化信号系统视作动力系统，以系统动力学的观点展开研究，强调细胞事件的动态变化以及内外环境因素对细胞结构和功能及整体行为的影响。特别是以单细胞为研究对象的单细胞动力学，强调单细胞力学性质与单细胞信号动力学特征在个体之间的差异性，可望发展成为单细胞分析的重要新内容与新手段，为人类重大疾病发生发展的机制探索、疾病诊断与药物评估等方面提供更全面的动态定量信息。

由于在体微环境极其复杂，导致细胞动力学的在体研究存在众多难以控制的干扰因素，体外模型研究在很大程度上能够排除干扰因素从而实现参数可控的观测，是该领域目前公认的可行研究手段。在众多研究者的共同努力下，平行平板流动腔、原子力显微镜、光镊、微管吸吮等多种体外实验技术平台前后被提出。其中，基于平行平板流动腔系统的细胞动力学研究大多以细胞群落作为研究对象，输入力学信号(多为流动腔底部壁面剪应力的近似)并非细胞本身的精确受力，输出信号则为一群细胞响应的平均值，无法精确分析异种或同种细胞力学性质和动力学信号特征参数的个体差异性；而原子力显微镜、光镊、微管吸吮等虽能实现单细胞力学性质的高精度测量，但不易提供接近人体的力学和生化刺激环境，且同时存在操作复杂、检测通量低等缺陷，无法用来进行高通量的单细胞动力学实验测量。近年来，微流控芯片技术以其特有的流体动态操控体系提供了更为接近人体内的生理环境，既能同时加载力学和生化信号，又能高通量的精准操控单细胞的运动，因此成为当今对单细胞及其微环境进行精准操控的主流平台之一，适于单细胞力学与力生物学分析及单细胞信号动力学研究。现有用于单细胞动力学分析的高通量微流控芯片主要分为两类：一类为流式细胞类，它基于流式细胞仪原理让单细胞随流体挤过一个狭窄单通道，并通过增加流体速度实现对单细胞的高通量操控，非常适合单细胞受力变形的高通量检测，但主要用于单细胞的力学信号加载，缺少生化因子协同刺激下的研究；另一类为微阵列类，它基于微结构阵列对单细胞进行高通量捕获，并通过控制单细胞外流场、压力分布实现对单细胞吮吸或控制生化信号的传输实现动态生化信号的加载，该类芯片更适合于单细胞动力学的高通量检测，但大多难以实现信号的精确定量加载。因此，迫切需要能精准定量研究不同动态力学和生化信号协同刺激下单细胞动力学响应的高通量微流控平台。

发明内容

本发明的设计目的在于提供一种可对大量单细胞精确加载的动态力学和生化信号刺激的微流控芯片，并通过集成外围加载、检测与控制装置构建出可用于实现高通量、定量化的单细胞动力学研究的微流控系统。本发明将结合流体力学原理和微流控技术，以“圣诞树”+Y型通道组合构成的时空浓度梯度生成器和基于驻点流原理与通道边界效应设计的单细胞操控微流控芯片为主体，通过改进不同微通道结构设计与几何尺寸，利用加载装置调控入口溶液及其流量，实现大量单细胞的稳定捕获或运动操控，并对其定量加载不同时空分布的力学和生化信号刺激。控制装置接收来自检测装置测得单细胞变形、运动轨迹、生化信号时空分布等动态图像信息、以及加载装置中各注射泵的压力/流量值，以此反馈控制加载装置，操控单细胞变形过程并精准控制微通道流场与生物信号传输，精准模拟体内细胞动态力学和生化微环境，对捕获单细胞精确加载多形式的力学和生化信号的组合刺激。

本发明的技术方案如下：

一种研究力学与生化信号诱发单细胞动力学响应的高通量微流控系统，是一种结合微流控芯片及外围加载、检测和控制装置用于高通量单细胞动力学研究的微流控系统，如图1所示。微流控芯片包括“圣诞树”+Y型通道组合构成的时空浓度梯度生成器，细胞悬浮液入口，单细胞操控单元和芯片出口，如图2所示。“圣诞树”+Y型通道组合构成的时空浓度梯度生成器出口、细胞悬浮液入口均与单细胞操控单元的入口相通，芯片出口连接单细胞操控单元的输出通道。

所述的“圣诞树”+Y型通道组合构成的时空浓度梯度生成器(简称为“时空浓度梯度生成器”)包含生化刺激溶液入口1，生化刺激溶液入口2，“圣诞树”型微通道和动态缓冲液入口；生化刺激溶液入口1、生化刺激溶液入口2均与“圣诞树”型微通道的入口端相通，“圣诞树”型微通道的出口端汇集后，再与动态缓冲液入口汇集，之后连接单细胞操控单元的入口；

所述的单细胞操控单元包括细胞流动腔，细胞变形微通道阵列，阻力通道1，阻力通道2和输出通道；细胞流动腔由曲线边界1、曲线边界2、直线边界后段和直线边界前段依次围成的近三角形腔，曲线边界1和直线边界前段交汇处设有通向阻力通道1的出口，曲线边界2和直线边界后段交汇处设有通向阻力通道2的出口，阻力通道1和阻力通道2向中间汇集到输出通道，细胞变形微通道阵列处于输出通道与细胞流动腔之间，即：细胞流动腔包含入口、上出口、阵列出口和下出口，入口与时空浓度梯度生成器出口和细胞悬浮液入口相通，上、下出口分别与阻力通道1和阻力通道2相通，阵列出口与细胞变形微通道阵列连通；细胞变形微通道阵列由若干细胞变形微通道构成，并与阻力通道1和阻力通道2汇合到与出口连通的输出通道，如图3所示。

所述的细胞注入、及动态力学和生化信号加载装置包括4组可编程注射泵和注射器，4个注射器分别与生化刺激溶液入口1、生化刺激溶液入口2、动态缓冲液入口和细胞悬浮液入口相通，用于将细胞注入到芯片内，并注入生化刺激溶液和细胞培养基；

所述的单细胞动力学实验检测装置包括倒置荧光显微镜、压力传感器和流量传感器，用于实时监测单细胞变形、运动轨迹、生化信号时空分布这些动态图像信息、以及加载装置中各注射泵的压力/流量值；

所述的控制装置是计算机，分别与加载装置和实验检测装置连接，用于接收细胞图像、荧光信号及传感器数据，并驱动加载装置中的可编程注射泵对注射流量进行精确控制。

所述的微流控系统主要用于实现以下功能，一是大量单细胞的高效捕获与操控，二是对每一个捕获的单细胞精确施加动态力学和生化信号刺激进而探究分析单细胞动力学响应。为实现上述功能，具体设计原理如下：

(一)单细胞高效捕获与操控

单细胞捕获与操控主要由单细胞操控单元实现。由于细胞流动腔的高度远小于其宽度和长度，并且尺寸在微米量级，根据流体力学原理，细胞流动腔内液体流动主要受压力梯度和上、下平行平板摩擦力的影响，侧面边界摩擦力的影响可忽略不计，沿细胞流动腔高度方向取平均后的平均流速

取如图4所示的坐标系，在Z＝x+iy平面上引进复势

式中

与

φ(x,y)＝Ar

因此，等势线和流线分别为

r

与

r

图4给出了基于复势W(Z)＝AZ

与

式中

式中对应坐标系为基于复势W(Z)＝AZ

直线边界前段与后段和通过原点的两条流线重合，满足方程

进一步地，将细胞流动腔的直线边界与若干并行排列的细胞变形微通道连通(如图3所示)，并将曲线边界1和曲线边界2沿细胞流动腔中轴线对称延伸，分别与阻力通道1和阻力通道2连通，整体单细胞操控单元可等效于图5所示的电路图。假设流入细胞流动腔的总流量为Q，流经阻力通道1和阻力通道2的流量分别为Q

Q＝Q

式中，

类比于电路理论，在此流场中，各流体驻点(即各细胞变形微通道入口位置)与阻力通道出口间的压强差ΔP和各通道流量间满足如下关系

Q

其中，R

因此，可通道调节微通道的几何尺寸(即长度L、宽度W和高度H)调整微通道的流阻大小。

进行单细胞捕获或操控时，关闭生化刺激溶液入口1、生化刺激溶液入口2和动态缓冲液入口，打开细胞悬浮液入口。根据流量守恒和流阻关系，具体捕获机制如下：通过调节阻力通道和细胞变形微通道的几何尺寸，使得初始各细胞变形微通道流阻R

由于细胞可变形，通过控制装置调节入口流量或压力，细胞既可被捕获于细胞变形微通道入口位置，也可穿过微通道，因此所述的微流控系统也可实现单细胞操控。

(二)动态力学和生化信号定量加载与控制

待单细胞被捕获后，关闭细胞悬浮液入口，打开生化刺激溶液入口1、生化刺激溶液入口2和动态缓冲液入口，对捕获细胞定量加载力学和生化信号刺激。

根据流量、流阻关系，由于微通道几何尺寸固定后各流阻及流阻比例关系均已知，捕获细胞所受力学信号主要由入口总流量大小决定，因此作用于细胞上的力可量化；并且通过控制装置控制加载装置中的各注射泵的流量值随时间以任意形式变化，从而实现对捕获细胞施加不同波形的力学信号；当各细胞变形微通道完全相同时，每个细胞所受的力学信号也是相同的。此外，如上所述，通过调节入口流量或压力，可使细胞穿过细胞变形微通道，从而研究细胞在穿过微通道过程中的单细胞变形与动力学响应，此时通过改变细胞变形微通道的几何形状，可在穿过过程中对单细胞施加不同的力学刺激模式。如图6所示，当细胞变形微通道为直通道时，细胞穿过过程中所受力学刺激模式恒定；当细胞变形微通道为变截面通道时，力学刺激渐变，或逐渐增大，或逐渐减小；也可实现周期变化的力学刺激模式，实现有-无-有-无形式的力学刺激。

同样地，加载装置结合控制装置可为捕获的细胞加载不同时空分布的生化信号刺激。为增强“圣诞树”型微通道中生化刺激物的混合效果，将“圣诞树”型微通道设计为类似“千鸟格”状的宽通道与窄通道交叉循环的结构；并且，为了保证“圣诞树”型微通道出口形成的横向方向浓度梯度的线性效果，根据期待浓度与空间距离间的定量关系，“圣诞树”型微通道最后一级分支通道的出口宽度按一定比例进行设计，如图2中细节放大图所示。对捕获细胞加载动态生化信号的方法如下：向时空浓度梯度生成器的生化刺激溶液入口1和生化刺激溶液入口2分别通入流量恒定且相等的生化刺激溶液和不含生化因子的细胞培养基，根据流体力学和物质传输原理，可在“圣诞树”型微通道出口(与动态缓冲液入口连通)产生沿横向方向线性空间分布的生化刺激浓度梯度；并向动态缓冲液入口通入流量随时间变化的细胞培养基，可在时空浓度梯度生成器出口(细胞流动腔的入口)产生具有线性空间分布的动态生化信号，从而可对每一个捕获的细胞精确施加不同时空分布的生化信号刺激。此外，也可向生化刺激溶液入口1和生化刺激溶液入口2均通入流量恒定且相等的生化刺激溶液，向动态缓冲液入口通入流量随时间变化的细胞培养基，此时可在时空浓度梯度生成器出口产生无空间梯度的动态生化信号，从而对捕获的细胞施加相同的动态生化信号刺激。进一步地，通过控制装置控制加载装置中的相应注射泵的流量值随时间以期望函数形式变化，从而实现对捕获细胞施加不同的生化信号。

此外，为防止外部微型异物、细胞碎片或PDMS碎片等杂质阻塞微通道或粘贴在微通道侧壁从而影响内部流动环境，所述的微流控芯片的四个入口，即生化刺激溶液入口1、生化刺激溶液入口2、动态缓冲液入口与细胞悬浮液入口，均与杂质过滤器相连，过滤器结构如图7所示。

本发明的有益效果是本发明可对大量单细胞进行高效捕获与操控，并对捕获细胞施加不同的动态力学和生化信号刺激，可用于研究不同动态力学与生化信号刺激下单细胞的动力学响应，也可普遍用于研究动态细胞环境调控离体细胞生物学行为及其机制的细胞生物学研究实验。

附图说明

图1是研究力学与生化信号诱发单细胞动力学响应的高通量微流控系统结构示意图。

图2是微流控芯片结构俯视图。

图3是单细胞操控单元结构示意图。

图4是基于复势W(Z)＝AZ

图5是单细胞捕获机制等效原理图。

图6是三种细胞变形微通道示例；其中，(1)细胞变形微通道示例1：直通道，(2)细胞变形微通道示例2：变截面通道，(3)细胞变形微通道示例3：周期变化通道。

图7是过滤器结构俯视图；白色区域为障碍物。

图中：(A)微流控芯片，(B)细胞注入、及动态力学和生化信号加载装置，(C)单细胞动力学实验检测装置，(D)控制装置；I“圣诞树”+Y型通道组合构成的时空浓度梯度生成器，II单细胞操控单元；S1生化刺激溶液入口1，S2生化刺激溶液入口2，B1动态缓冲液入口，C1细胞悬浮液入口，O1芯片出口；①细胞流动腔，②细胞变形微通道阵列，③阻力通道1，④阻力通道2，⑤输出通道，1-1曲线边界1，1-2曲线边界2，1-3a直线边界前段，1-3b直线边界后段；W

具体实施方式

如图1所示，本发明是用于高通量单细胞动力学研究的微流控系统，该系统包含微流控芯片A，细胞注入、及动态力学和生化信号加载装置B，单细胞动力学实验检测装置C和控制装置D。

所述的微流控芯片A由“圣诞树”+Y型通道组合构成的时空浓度梯度生成器I，细胞悬浮液入口C1，单细胞操控单元II和芯片出口O1构成，如图2所示。其中，“圣诞树”+Y型通道组合构成的时空浓度梯度生成器I包含生化刺激溶液入口1S1，生化刺激溶液入口2S2，“圣诞树”型微通道和动态缓冲液入口B1；单细胞操控单元II由细胞流动腔①，细胞变形微通道阵列②，阻力通道1③，阻力通道2④和输出通道⑤构成；细胞流动腔①由曲线边界1 1-1、曲线边界2 1-2、直线边界前段1-3a和直线边界后段1-3b围成，包含两个入口、上出口、阵列出口和下出口，入口与时空浓度梯度生成器出口和细胞悬浮液入口相通，上、下出口分别与阻力通道1③和阻力通道2④相通，阵列出口与细胞变形微通道阵列②连通；细胞变形微通道阵列②由70个直通道型细胞变形微通道构成，并与阻力通道1③和阻力通道2④汇合到与出口O1连通的输出通道⑤，如图3所示。所述的微流控芯片的四个入口，即生化刺激溶液入口1S1、生化刺激溶液入口2S2、动态缓冲液入口B1与细胞悬浮液入口C1，均与杂质过滤器相连，过滤器结构如图7所示。

微流控芯片A所有微通道采用标准化的微加工方法，并用PDMS制作完成，最后与洁净盖玻片永久键合，构成密封且透明的生物相容性良好的玻璃-PDMS型芯片。微通道的结构参数如下：“圣诞树”型微通道窄通道和宽通道的宽度分别为40微米和100微米，细胞流动腔①的长度L

所述的细胞注入、及动态力学和生化信号加载装置B由4组可编程注射泵和注射器构成，4个注射器分别与生化刺激溶液入口1S1、生化刺激溶液入口2S2、动态缓冲液入口B1和细胞悬浮液入口C1相通，用于将细胞注入到芯片内，并注入生化刺激溶液和细胞培养基。

所述的单细胞动力学实验检测装置C包括倒置荧光显微镜、压力传感器和流量传感器，用于实时监测单细胞变形、运动轨迹、生化信号时空分布等动态图像信息、以及加载装置中各注射泵的压力/流量值。

所述的控制装置D是计算机，分别与加载装置B和实验检测装置C连接，用于接收细胞图像、荧光信号及传感器数据，并驱动加载装置B中的可编程注射泵对注射流量进行精确控制。

为研究力学和生化信号刺激下的单细胞动力学响应，实验步骤如下：

步骤一、大量单细胞的高效捕获与操控

当微流控系统中各装置连通后，打开细胞悬浮液入口C1，关闭生化刺激溶液入口1S1、生化刺激溶液入口2S2和动态缓冲液入口B1，将细胞悬浮液注入到细胞流动腔①中，通过控制装置D控制加载装置B中连接细胞悬浮液注射器的注射泵，调节流量以实现将大量单细胞的高效捕获于细胞变形微通道阵列②中或使其有控制地穿过细胞变形微通道。

步骤二、不同动态力学和生化信号定量加载与控制，并对实时测量监测单细胞的动力学响应

待细胞被捕获后，关闭细胞悬浮液入口C1，打开生化刺激溶液入口1S1、生化刺激溶液入口2S2和动态缓冲液入口B1。向生化刺激溶液入口1S1和生化刺激溶液入口2S2通入相同的流量恒定且相等的生化刺激溶液，向动态缓冲液入口B1通入流量随时间动态变化的细胞培养基，从而可对每一个捕获细胞施加相同的动态力学和生化信号刺激；或向生化刺激溶液入口1S1和生化刺激溶液入口2S2分别通入流量恒定且相等的生化刺激溶液和细胞培养基，向动态缓冲液入口B1通入流量随时间动态变化的细胞培养基，从而可对每一个捕获细胞施加相同的动态力学信号刺激和具有线性空间分布的动态生化信号。通过荧光显微镜实时监测记录不同动态力学和生化信号信号刺激下的单细胞动力学响应过程，并将细胞影像、荧光信号等反馈给控制装置D。

综上，本发明可对大量单细胞进行高效捕获与操控，并对其加载不同动态力学和生化信号刺激，可用于在单细胞水平下分析微流动环境定量调控离体细胞的生物学行为及其机制的细胞生物学研究。