被工程化用于优先轻链配对的CH1结构域变体和包括所述CH1结构域变体的多特异性抗体

摘要

提供了被工程化为与κCL结构域或λCL结构域优先结合的CH1结构域变体，以及包括此类经工程化的CH1结构域变体的多肽，例如抗体重链或抗体，和包括此类CH1结构域变体和/或此类多肽的药物组合物，以及用于制备和使用此类CH1结构域变体的方法。所述CH1结构域变体使重链‑轻链错配最小化，并且促进同源重链‑轻链配对，由此改进多特异性，例如双特异性，抗体的生成。还提供了制备CH1结构域变体文库的方法和鉴定一个或多个CH1结构域变体的方法。

说明书

本申请要求于2019年9月30日提交的题为“被工程化用于优先轻链配对的CH1结构域变体和包括所述CH1结构域变体的多特异性抗体(CH1 DOMAIN VARIANTS ENGINEEREDFOR PREFERENTIAL LIGHT CHAIN PAIRING AND MULTISPECIFIC ANTIBODIES COMPRISINGTHE SAME)”的美国临时申请第62/908,367的优先权，所述美国临时申请的内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及CH1结构域变体以及包括所述CH1结构域变体的抗体重链和抗体，特别是多特异性抗体，所述CH1结构域变体含有促进适当的重链-轻链配对的至少一个氨基酸取代。本发明进一步涉及包括此类抗体的组合物和其用途，例如作为治疗剂或诊断剂。本发明进一步涉及制备CH1结构域变体文库的方法和鉴定一个或多个CH1结构域变体的方法。

背景技术

正在努力开发具有超过一种抗原结合特异性的抗体治疗剂，例如双特异性抗体。双特异性抗体可以用于干扰与癌症、炎性过程或其它疾病状态相关的多个表面受体。双特异性抗体也可以用于将靶标置于紧邻处，并且调节蛋白质复合物形成或驱动细胞之间的接触。双特异性抗体的产生在20世纪60年代初首次报告(Nisonoff等人,《生物化学与生物物理学档案(Arch Biochem Biophys)》1961 93(2):460-462)，并且第一单克隆双特异性抗体在20世纪80年代使用杂交瘤技术产生(Milstein等人,《自然(Nature)》1983 305(5934):537-540)。在过去十年中，由于双特异性抗体的治疗潜力，对双特异性抗体的兴趣显著增加，并且双特异性抗体现在用于临床中，例如，博纳吐单抗(blinatumomab)和艾美赛珠单抗(emicizumab)已被批准用于治疗特定癌症(参见Sedykh等人,《药物设计开发与治疗(DrugDes Devel Ther)》12:195-208(2018)和Labrijn等人,《自然综述：药物发现(NatureReviews Drug Discovery)》18:585-608(2019)，用于最近对双特异性抗体产生方法和批准用于医疗用途的双特异性抗体的特征的综述)。

虽然双特异性抗体已示出优于单特异性抗体的显著优势，但是双特异性抗体的广泛商业应用由于缺乏有效/低成本生产方法、双特异性抗体缺乏稳定性并且在人体中缺乏长半衰期而受到阻碍。在过去的几十年中，开发了用来提高双特异性抗体的产生的多种方法。这些包含具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,《自然》305:537(1983)),WO 93/08829以及Traunecker等人,《欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)》10:3655(1991))；“杵臼结构”工程化(参见，例如美国专利第5,731,168号)；免疫球蛋白交叉技术(也称为Fab结构域交换或CrossMab形式)(参见例如WO2009/080253；Schaefer等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,108:11187-11192(2011))；用于制备抗体Fc-异源二聚体分子的工程化静电转向效应(WO 2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(参见，例如美国专利第4,676,980号以及Brennan等人,《科学(Science)》,229:81(1985))；亮氨酸拉链(参见例如Kostelny等人,《免疫学杂志(J.Immunol)》,148(5):1547-1553(1992))；“双抗体”技术(参见，例如Hollinger等人,《美国国家科学院院刊》90:6444-6448(1993))；单链Fv(scFv)二聚体(参见例如Gruber等人,《免疫学杂志》,152:5368(1994))；以及如所描述的三特异性抗体，例如在Tutt等人《免疫学杂志》147:60(1991)中。

尽管有这些改进，但产生具有正确的重链-轻链配对的双特异性抗体仍然是一个挑战。双特异性抗体可以通过两个不同的重链和两个不同的轻链的共表达来形成。以期望形式适当地形成双特异性抗体仍然是一个挑战，因为重链已演变成以相对不接近的方式结合轻链。因此，两条重链和两条轻链的共表达可能导致重链-轻链配对的扰乱——十六种可能组合的复杂混合物，其仅表示十种不同抗体中的一个与期望双特异性抗体对应(如果存在完全混杂，则混合物中的最大产率为12.5％)。这种错配(也称为链关联问题)仍然是产生双特异性的主要挑战，因为均匀配对对于可制造性和功效是必需的。

用于缓解错配的一种策略是产生具有共同轻链的双特异性抗体(参见例如Merchant等人,《自然生物技术(Nat.Biotech.)》16:677-681(1998))。可替代地，可以使用单个共同重链和两个不同的轻链(一个κ和一个λ)(参见例如Fischer等人,《自然通讯(Nature Commun.)》6:6113(2015))。然而，这种策略需要鉴定具有共同链的抗体，这是困难的并且倾向于损害每个结合臂的特异性并且基本上降低多样性(参见例如Wang等人,《MABS》10(8):1226-1235(2018))。

改进正确的重链-轻链配对的其它方法包含CrossMab技术(罗氏公司(Roche))，其中一个片段抗原结合(Fab)臂的轻链或其子结构域之一与重链Fd区的对应区交换，以及DuetMab技术(医学免疫公司(MedImmune))，其中一个Fab臂中的天然二硫键被工程化二硫键置换。然而，这些方法需要对天然IgG形式进行显著改变，这可能导致化合物不完全类似于天然抗体。

另一种策略是利用以IgG形式的重链和轻链的恒定和/或可变区中的氨基酸取代来减少或消除重链-轻链错配。据发明人所知，先前未证实仅CH1结构域的修饰解决多特异性抗体表达期间经常观察到的链关联或错配问题。相反，经工程化以包括CH1结构域变体的多特异性抗体进一步要求在CH1结构域外部进行修饰，以便解决链关联问题，如CL结构域，以及在某些情况下VH、CH2、CH3和/或VL结构域。其实例包含Lewis等人,《自然生物技术》32(2):191-198(2014)其产生突变的CH1和CL结构域、CRD1(重链被D148K、F170T、V185F取代，并且轻链被K129D、L135F取代；EU编号)和CRD2(重链被H168A和F170T取代，并且轻链被L135Y、S176W取代)，试图驱动改变的重链和轻链的优先配对并且不利于重链和轻链结构域与野生型恒定结构域的配对。然而，他们报告，在不存在可变结构域的情况下用突变的CH1和CL结构域获得的任何配对特异性在没有在VH-VL界面内进行另外工程化的情况下不会转化为全长IgG形式，即为了实现优先重链-轻链配对，需要VH-VL界面内的取代以及CL和CH1结构域取代。工程化CH1和CL结构域以含有带电荷的氨基酸残基还被认为可以促进优先重链-轻链配对(参见例如U.S.10,047,163)。具有至少两个具有不同CH1和CL结构域的Fab片段的双特异性抗体也是已知的，其中一个Fab片段在CH1结构域和Cκ结构域内具有取代以驱动优先配对(参见US20180022829和U.S.9,631,031，其公开了CH1：T187E和Cκ：N137K+S114A；CH1：L145Q+S183V和Cκ：V133T+S176V；CH1：L128A+L145E和Cκ：V133W；CH1：V185A和Cκ：L135W+N137A)。当轻链或在一些情况下CH2、CH3和/或VH也被适当取代以促进优先配对时，据称促进优先重链-轻链配对的特定CH1结构域取代的另外的实例包含：A141C/L、K147D、G166D、G166K或在128、129、162或171位置处被半胱氨酸取代(WO2019183406(Invenra公司(Invenra Inc.)))；在位置126或220处的半胱氨酸的取代被缬氨酸或丙氨酸取代或在位置128、141或168处的非半胱氨酸的取代被半胱氨酸、L145F、K147A、F170V、S183F或V185W/F(U.S.9,527,927(医学免疫公司))取代；172A和174G(WO2020060924(Dualogics公司(Dualogics))；A172R和174G或将残基190取代到M或I(U.S.10,047,167(北卡罗莱纳大学教堂山分校(University of North Carolina Chapel Hill)和礼来公司(Eli Lilly)))；L128F、A141I/M/T/L、F170S/A/Y/M、S181M/I/T、S183A/E/K/V和V185A/L(US20180177873(基因泰克公司(Genentech)))；131C/S、133R/K、137E/G、138S/G178S/Y、192N/S和/或193F/L(U.S.10,487,156(Argenx BVBA公司(Argenx BVBA)))；145D/E/R/H/K(IMGT位置26)(WO2018141894(默克公司(Merck))；124K/E/R/D(U.S.10,392,438(辉瑞公司(Pfizer))；133V、150A、150D、152D、173D或188W(US20190023810(麻省理工学院(MIT))；133S/W/A、139W/V/G/I、143K/E/A、145E/T/L/Y、146G、147T/E、174V、175D/R/S、179K/D/R、181R、186R、188F/L和/或190S/A/G/Y(US20180179296和U.S.9,914,785(Zymeworks公司(Zymeworks)))；143A/E/R/K/D和145T/L(U.S.10,077,298(Zymeworks公司))；124A/R/E/W、145M/T、143E/R/D/F、172R/T、139W/G/C、179E或186R(US20170204199(Zymeworks公司))；在位置126、127、128、134、141、171或173处被半胱氨酸取代(全药工业株式会社(ZenyakuKogyo))；L145Q、H168A、F170G、S183V和T187E(WO2020127354(鳄鱼生物科学公司(Alligator Bioscience)))；143D/E、145T、190E/D和124R(WO2017/059551(Zymeworks公司))。另外，据报告，U.S.9,150,639，协和发酵麒麟株式会社(Kyowa Hakko Kirin)产生包括A140C、K147C或S183C的重链，用于引入半胱氨酸以允许化学调节。麒麟株式会社表示含有这些重链突变的抗体变体可以包括野生型轻链，然而，没有迹象表明这有利于优先重链-轻链配对。

用于最小化重链-轻链错配的又另一个策略是利用不同的轻链，例如具有不同恒定结构域的轻链。例如，Loew等人产生具有κ轻链和λ轻链的多特异性抗体，并且观察到最小错配，因为某些天然存在的κ轻链具有高保真度，并且不与来自λ抗体的重链配对，反之亦然(WO2018057955)。不幸的是，此方法的适用性限于具有高保真度的那些轻链。其它人已经使用κ和λ轻链产生了多特异性抗体，其中氨基酸取代用于重链和轻链两者以静电或立体方式驱动优先配对(参见例如WO2017059551(Zymeworks公司)、US20140154254(安进公司(Amgen))和U.S.10,047,163(AbbVie Stentrx公司(AbbVie Stemcentrx)))。然而，将许多氨基酸取代引入重链和轻链两者中会带来另外的技术障碍，并且另外可能对抗体功能和/或免疫原性具有有害影响。

发明内容

本发明的目的是提供具有适当重链-轻链配对的经工程化的双特异性抗体。一方面，本文提供了促进重链与特定轻链的优先配对的CH1结构域变体多肽(在本文中也称为CH1结构域变体)和包括其的多肽，如抗体。CH1结构域变体含有至少一个氨基酸取代(相对于亲本，例如野生型序列)。

在一些实施例中，CH1结构域变体含有在与轻链的CL结构域形成界面的CH1结构域位置处的至少一个氨基酸取代，包含但不限于位置140和/或141或147和/或183(EU编号)。取代促进了含有CH1结构域变体的重链与特定轻链的优先配对，例如CH1结构域变体141优先与λCL结构域配对，如与κCL结构域相比，而CH1结构域变体147F和/或183R、183K或183Y优先与κCL结构域配对，如与λCL结构域相比。

在一些实施例中，CH1结构域变体含有在CH1结构域与VH之间形成界面的CH1结构域位置处的至少一个氨基酸取代，如CH1位置151(EU编号)。

恒定结构域的这种优先配对预期将驱动全长轻链和重链的配对，包含可变结构域，从而为双特异性的链配对问题生成解决方案。具体地，CH1结构域变体多肽包括根据EU编号的以下位置中的一个或多个位置处的氨基酸取代：118、119、124、126-134、136、138-143、145、147-154、163、168、170-172、175、176、181、183-185、187、190、191、197、201、203-206、208、210-214、216和218。任选地，此类CH1结构域变体多肽优先与以下配对：(i)κ轻链恒定区(“CL”)结构域，如与λCL结构域相比，和/或κ轻链多肽，如与λ轻链多肽相比；(ii)λCL结构域，如与κCL结构域相比，和/或λ轻链多肽，如与κ轻链多肽相比。

任选地，在一些实施例中，可以排除某些CH1结构域变体并且根据本发明的CH1结构域变体可以满足以下：

(a)如果CH1上的残基141被取代为C或L，残基166被D或K取代，CH1上的残基128、129、162或171被取代为C，和/或残基147被取代为D，则所述CH1结构域变体优先与之配对的CL结构域不包括氨基酸取代；

(b)如果CH1上的位置126或220被缬氨酸或丙氨酸取代，位置128、141或168处的非半胱氨酸被半胱氨酸取代，或CH1取代为L145F、K147A、F170V、S183F或V185W/F，则所述CH1结构域变体优先与之配对的CL结构域不包括氨基酸取代；

(c)如果CH1上的残基172被取代为172R，残基174突变为174G，或残基190被取代为190M或190I，则这些不是CH1包括的仅有取代；

(d)如果所述CH1取代由L128F、A141I/M/T/L、F170S/A/Y/M、S181M/I/T、S183A/E/K/V和/或V185A/L组成，CH1结构域变体优先与之配对的CL结构域未被修饰；

(e)如果所述CH1取代由131C/S、133R/K、137E/G、138S/G、178S/Y、192N/S和/或193F/L组成，则这些并非仅有的CH1取代和/或在双特异性抗体中，所述CH1结构域具有同一人免疫球蛋白亚型或同种异型；

(f)如果所述CH1取代由145D/E/R/H/K(IMGT位置26)组成，不存在对应的LC取代，129D/E/R/H/K(IMGT位置18)；

(g)如果所述CH1取代由124K/E/R/D组成，在LC的位置176处不存在对应的取代，CH1结构域变体优先与之配对；

(h)如果所述CH1取代由133V、150A、150D、152D、173D和/或188W组成，在LC中不存在CH1结构域变体优先与之配对的对应取代；

(i)如果所述CH1取代由133S/W/A、139W/V/G/I、143K/E/A、145E/T/L/Y、146G、147T/E、174V、175D/R/S、179K/D/R、181R、186R、188F/L、和/或190S/A/G/Y组成，在LC中不存在CH1结构域变体优先与之配对的对应取代；

(j)如果所述CH1取代由143A/E/R/K/D和145T/L组成，在LC中不存在CH1结构域变体优先与之配对的对应取代；

(k)如果所述CH1取代由124A/R/E/W、145M/T、143E/R/D/F、172R/T和139W/G/C、179E和/或186R组成，在LC中不存在CH1结构域变体优先与之配对的对应取代；

(l)如果所述CH1取代由在位置126、127、128、134、141、171或173处被半胱氨酸取代组成，则对应的LC位置未被修饰成形成二硫键；

(m)如果所述CH1取代由L145Q、H168A、F170G、S183V和/或T187E组成，在κ或λLC中不存在CH1结构域变体优先与之配对的对应取代；

(n)如果所述CH1取代由143D/E、145T、190E/D和/或124R组成，在LC中不存在CH1结构域变体优先与之配对的对应取代；或

(o)如果所述CH1取代由A140C、K147C和/或S183C组成，在LC中存在CH1结构域变体优先与之配对的对应取代。

在一些实施例中，CH1结构域变体多肽包括根据EU编号的以下位置中的一个或多个位置处的氨基酸取代：118、124、126-129、131、132、134、136、139、143、145、147-151、153、154、170、172、175、176、181、183、185、190、191、197、201、203-206、210、212-214和218。任选地使得所述CH1结构域变体多肽优先与以下配对：(i)κCL结构域(或含有κCL的多肽)，如与λCL结构域(或含有λCL的多肽)相比；和/或(ii)κ轻链多肽，如与λ轻链多肽相比。

在某些实施例中，此类CH1结构域变体包括位置147、位置183或位置147和183处的氨基酸取代。

在某些实施例中，此类CH1结构域变体包括以下氨基酸取代中的一个或多个：位置118被G取代；位置124被H、R、E、L或V取代；位置126被A、T或L取代；位置127被V或L取代；位置128被H取代；位置129被P取代；位置131被A取代；位置132被P取代；位置134被G取代；位置136被E取代；位置139被I取代；位置143被V或S取代；位置145被F、I、N或T取代；位置147被F、I、L、R、T、S、M、V、N、E、H、Y、Q、A或G取代；位置148被I、Q、Y或G取代；位置149被C、S或H取代；位置150被L或S取代；位置151被A或L取代；位置153被S取代；位置154被M或G取代；位置170被G或L取代；位置172被V取代；位置175被G、L、E、A取代；位置176被P取代；位置181被Y、Q或G取代；位置183被I、W、F、E、Y、L、K、Q、N、R或H取代；位置185被W取代；位置190被P取代；位置191被I取代；位置197被A取代；位置201被S取代；位置203被S取代；位置204被Y取代；位置205被Q取代；位置206被S取代；位置210被R取代；位置212被G取代；位置213被E或R取代；位置214被R取代；并且位置218被Q取代。

在某些实施例中，κ偏好CH1结构域变体多肽可以包括：(i)位置147处的氨基酸残基F、I、L、R、T、S、M、V、N、E、H、Y或Q；和/或(ii)位置183处的氨基酸残基I、W、F、E、Y、L、K、Q、N或R。

在κ偏好CH1结构域变体的一些优选实施例中，CH1结构域变体多肽可以包括：(i)位置183处的氨基酸残基R、K或Y；和/或(ii)位置147处的氨基酸残基F。

在另外的实施例中，CH1结构域变体多肽包括：(i)位置147处的氨基酸残基F和位置183处的氨基酸残基R；(ii)位置147处的氨基酸残基F和位置183处的氨基酸残基K；(iii)位置147处的氨基酸残基F和位置183处的氨基酸残基Y；(iv)位置183处的氨基酸残基R；(v)位置183处的氨基酸残基K；或(vi)位置183处的氨基酸残基Y。任选地，此CH1结构域变体可以包括以下的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:137；(ii)SEQ ID NO:138；(iii)SEQ ID NO:139；(iv)SEQ ID NO:60；(v)SEQ ID NO:41；或(vi)SEQ ID NO:136。

在一些实施例中，CH1结构域变体多肽在CH1与VH之间的界面内的CH1氨基酸位置处包括氨基酸取代。任选地，此类界面内的CH1氨基酸位置是位置151。进一步任选地，此类CH1结构域变体可以包括位置151处的氨基酸残基A或L。

在一些实施例中，CH1结构域变体多肽进一步包括一个或多个氨基酸取代，其增加CH1结构域与以下的配对：(i)κCL结构域，如与λCL结构域相比；和/或(ii)κ轻链多肽，如与λ轻链多肽相比。

在一些实施例中，权利要求2到10中任一项的CH1结构域变体多肽，其使与以下的配对：(i)κCL结构域，如与λCL结构域相比；和/或(ii)κ轻链多肽，如与λ轻链多肽相比，增加至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。可以任选地通过液相色谱法-质谱法(LCMS)测量κ配对的增加。

在一些实施例中，权利要求2到10中任一项的CH1结构域变体多肽，其使与以下的配对：(i)κCL结构域，如与λCL结构域相比；和/或(ii)κ轻链多肽，如与λ轻链多肽相比，增加至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍、至少20倍、至少21倍、至少22倍、至少23倍、至少24倍或至少25倍。可以任选地通过流式细胞术来定量κ配对的增加，例如通过比较κCL染色与λCL染色的平均荧光强度(MFI)比率。

在一些实施例中，根据本发明的CH1结构域变体多肽包括根据EU编号的以下位置中的一个或多个位置处的氨基酸取代：119、124、126、127、130、131、133、134、138-142、152、163、168、170、171、175、176、181、183-185、187、197、203、208、210-214、216和218。任选地，所述CH1结构域变体优先与以下配对：(i)λCL结构域，如与κCL结构域相比；和/或(ii)λ轻链多肽，如与κ轻链多肽相比。

在某些实施例中，λ偏好CH1结构域变体多肽包括位置141、170、171、175、181、184、185、187和218中的一个或多个处的氨基酸取代。

在某些实施例中，λ偏好CH1结构域变体多肽包括以下氨基酸取代中的一个或多个：位置119被R取代；位置124被V取代；位置126被V取代；位置127被G取代；位置130被H或S取代；位置131被Q、T、N、R、V或D取代；位置133被D、T、L、E、S或P取代；位置134被A、H、I、P、V、N或L取代；位置138被R取代；位置139被A取代；位置140被I、V、D、Y、K、S、W、R、L或P取代；位置141被D、K、E、T、R、Q、V或M取代；位置142被M取代；位置152被G取代；位置163被M取代；位置168被F、I或V取代；位置170被N、G、E、S或T取代；位置171被N、E、G、S、A或D取代；位置175被D或M取代；位置176被R或M取代；位置181被V、L、A、K或T取代；位置183被L或V取代；位置184被R取代；位置185被M、L、S、R或T取代；位置187被R、D、E、Y或S取代；位置197被S取代；位置203被D取代；位置208被I取代；位置210被T取代；位置211被A取代；位置212被N取代；位置213被E取代；位置214被R取代；位置216被G取代；并且位置218被L、E、D、P、A、H、S、Q、N、T、I、M、G、C、K或W取代。

在又某些实施例中，λ偏好CH1结构域变体多肽包括(i)-(xvii)中的任何一个或多个：(i)位置126处的氨基酸残基V；(ii)位置127处的氨基酸残基G；(iii)位置131处的氨基酸残基V；(iv)位置133处的氨基酸残基S；(v)位置138处的氨基酸残基R；(vi)位置140处的氨基酸残基I或V；(vii)位置141处的氨基酸残基D、K、E或T；(viii)位置142处的氨基酸残基M；(ix)位置168处的氨基酸残基I；(x)位置170处的氨基酸残基E、G或S；(xi)位置171处的氨基酸残基E、D、G、S或A；(xii)位置175处的氨基酸残基M；(xiii)位置176处的氨基酸残基R；(xiv)位置181处的氨基酸残基K、V、A或L；(xv)位置184处的氨基酸残基R；(xvi)位置185处的氨基酸残基R；(xvii)位置187处的氨基酸残基R；以及(xviii)位置218处的氨基酸残基L、E、D、P、A、H、S、Q、N、T、I、M、G、C或W。

在某些优选实施例中，根据本发明的λ偏好CH1结构域变体多肽包括以下取代中的一个或多个或由其组成：141D、141E、171E、170E、185R和187R。

在某些优选实施例中，根据本发明的λ偏好CH1结构域变体多肽包括以下取代中的两个或更多个或由其组成：141D、141E、171E、170E、185R和187R。

在某些优选实施例中，根据本发明的λ偏好CH1结构域变体多肽包括以下取代中的三个或更多个或由其组成：141D、141E、171E、170E、185R和187R。

在某些优选实施例中，根据本发明的λ偏好CH1结构域变体多肽包括以下取代或由其组成：(i)141E和185R；(ii)141E和187R；(iii)141E、170E或171E和185R；(iv)141E、170E或171E和187R；(v)141D和185R；(vi)141D和187R；(vii)141D、170E或171E和185R；(viii)141D、170E或171E和187R；(ix)141E、185R和187R；或(x)141D、185R和187R。

在又一些实施例中，根据本发明的λ偏好CH1结构域变体多肽包括一个或多个位置141处取代为D、K或E的取代，所述取代任选地与位置181处取代为K的取代配对，并且进一步任选地与在位置218处取代为L、E、D、P、A、H、S、Q、N、T、I、M、G、C或W的取代配对。

在又一些实施例中，根据本发明的λ偏好CH1结构域变体多肽包括位置141处取代为D、K或E的取代，所述取代与位置181处取代为K的取代配对和/或与位置218处取代为L、E、D、P、A、H、S、Q、N、T、I、M、G、C或W的取代配对。

在另外的实施例中，根据本发明的λ偏好CH1结构域变体多肽包括(i)-(xvii)中的任何一个或多个：(i)位置141处的氨基酸残基D、E或K；(ii)位置170处的氨基酸残基E；(iii)位置171处的氨基酸残基E；(iv)位置175处的氨基酸残基M；(v)位置181处的氨基酸残基K；(vi)位置184处的氨基酸残基R；(vii)位置185处的氨基酸残基R；(viii)位置187处的氨基酸残基R；(ix)位置218处的氨基酸残基P、A或E。

在另外的实施例中，根据本发明的λ偏好CH1结构域变体多肽包括：(i)位置141处的氨基酸残基D；(ii)位置141处的氨基酸残基D和位置181处的氨基酸残基K；(iii)位置141处的氨基酸残基D、位置181处的氨基酸残基K和位置218处的氨基酸残基A；(iv)位置141处的氨基酸残基D、位置181处的氨基酸残基K和位置218处的氨基酸残基P；(v)位置141处的氨基酸残基E；(vi)位置141处的氨基酸残基E和位置181处的氨基酸残基K；(vii)位置141处的氨基酸残基K；(viii)位置141处的氨基酸残基K和位置181处的氨基酸残基K；(ix)位置141处的氨基酸残基K、位置181处的氨基酸残基K和位置218处的氨基酸残基E；(x)位置141处的氨基酸残基K、位置181处的氨基酸残基K和位置218处的氨基酸残基P；(xi)位置141处的氨基酸残基E、位置170处的氨基酸残基E、位置181处的氨基酸残基V和位置187处的氨基酸残基R；(xii)位置141处的氨基酸残基E、位置171处的氨基酸残基D和位置185处的氨基酸残基R；(xiii)位置141处的氨基酸残基E、位置171处的氨基酸残基E和位置185处的氨基酸残基R；(xiv)位置141处的氨基酸残基E、位置171处的氨基酸残基G、位置185处的氨基酸残基R和位置187处的氨基酸残基R；(xv)位置141处的氨基酸残基E、位置185处的氨基酸残基R和位置187处的氨基酸残基R；(xvi)位置141处的氨基酸残基E、位置171处的氨基酸残基S和位置181处的氨基酸残基K；(xvii)位置141处的氨基酸残基E、位置170处的氨基酸残基G、位置175处的氨基酸残基M、位置181处的氨基酸残基V、位置184处的氨基酸残基R和位置187处的氨基酸残基R；(xviii)位置141处的氨基酸残基E和位置185处的氨基酸残基R；(xix)位置141处的氨基酸残基E和位置187处的氨基酸残基R；(xx)位置141处的氨基酸残基E、位置170处的氨基酸残基E和位置185处的氨基酸残基R；(xxi)位置141处的氨基酸残基E、位置170处的氨基酸残基E和位置187处的氨基酸残基R；(xxii)位置141处的氨基酸残基D和位置185处的氨基酸残基R；(xxiii)位置141处的氨基酸残基D和位置187处的氨基酸残基R；(xxiv)位置141处的氨基酸残基D、位置185处的氨基酸残基R和位置187处的氨基酸残基R；(xxv)位置141处的氨基酸残基D、位置170处的氨基酸残基E和位置185处的氨基酸残基R；(xxvi)位置141处的氨基酸残基D、位置170处的氨基酸残基E和位置187处的氨基酸残基R；(xxvii)位置141处的氨基酸残基E、位置171处的氨基酸残基E和位置187处的氨基酸残基R；(xxiii)位置141处的氨基酸残基D、位置171处的氨基酸残基E和位置185处的氨基酸残基R；或(xxix)位置141处的氨基酸残基D、位置171处的氨基酸残基E和位置187处的氨基酸残基R。

任选地，此CH1结构域变体包括以下的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:140；(ii)SEQID NO:141；(iii)SEQ ID NO:142；(iv)SEQ ID NO:143；(v)SEQ ID NO:144；(vi)SEQ IDNO:145；(vii)SEQ ID NO:146；(viii)SEQ ID NO:147；(ix)SEQ ID NO:148；(x)SEQ ID NO:149；(xi)SEQ ID NO:155；(xii)SEQ ID NO:157；(xiii)SEQ ID NO:159；(xiv)SEQ ID NO:162；(xv)SEQ ID NO:163；(xvi)SEQ ID NO:164；(xvii)SEQ ID NO:165；(xviii)SEQ IDNO:178；(xix)SEQ ID NO:179；(xx)SEQ ID NO:180；(xxi)SEQ ID NO:181；(xxii)SEQ IDNO:182；(xxiii)SEQ ID NO:183；(xxiv)SEQ ID NO:184；(xxv)SEQ ID NO:185；(xxvi)SEQID NO:186；(xxvii)SEQ ID NO:187；(xxviii)SEQ ID NO:188；或(xxix)SEQ ID NO:189。

在一些优选实施例中，λ偏好CH1结构域变体包括：(i)位置141处的氨基酸残基D、位置171处的氨基酸残基E和位置185处的氨基酸残基R；或(ii)位置141处的氨基酸残基D、位置170处的氨基酸残基E和位置187处的氨基酸残基R。

在另外的优选实施例中，λ偏好CH1结构域变体包括由以下组成的氨基酸取代：(i)位置141处的氨基酸残基D、位置171处的氨基酸残基E和位置185处的氨基酸残基R；或(ii)位置141处的氨基酸残基D、位置170处的氨基酸残基E和位置187处的氨基酸残基R。

在某些优选实施例中，λ偏好CH1结构域变体包括由以下组成的氨基酸取代：(i)SEQ ID NO:188；或(ii)SEQ ID NO:186。

在一些实施例中，λ偏好CH1结构域变体多肽可以进一步包括一个或多个氨基酸取代，其增加CH1结构域与以下的配对：(i)λCL结构域，如与κCL结构域相比；和/或(ii)λ轻链多肽，如与κ轻链多肽相比。

在一些实施例中，CH1结构域变体多肽可以使与以下的配对：(i)λCL结构域，如与κCL结构域相比；和/或(ii)λ轻链多肽，如与κ轻链多肽相比，增加至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。可以任选地通过液相色谱法-质谱法(LCMS)测量λ配对的增加。

在一些实施例中，CH1结构域变体多肽可以使与以下的配对：(i)λCL结构域，如与κCL结构域相比；和/或(ii)λ轻链多肽，如与κ轻链多肽相比，增加至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍、至少20倍、至少21倍、至少22倍、至少23倍、至少24倍或至少25倍。λ配对的增加可以任选地通过流式细胞术测量，任选地通过比较λCL染色与κCL染色的MFI值比率。

另一方面，本文进一步提供了抗体重链多肽，其包括可变区和恒定区，其中所述恒定区包括根据上文所描述的那些中的任一个的CH1结构域变体。

在一些实施例中，此类抗体重链多肽的CH1结构域变体根据包括由以下组成的氨基酸取代：(I)(i)位置147处的氨基酸残基F和位置183处的氨基酸残基R；(ii)位置147处的氨基酸残基F和位置183处的氨基酸残基K；(iii)位置147处的氨基酸残基F和位置183处的氨基酸残基Y；(iv)位置183处的氨基酸残基R；(v)位置183处的氨基酸残基K；或(vi)位置183处的氨基酸残基Y；或(II)(i)位置141处的氨基酸残基D、位置171处的氨基酸残基E和位置185处的氨基酸残基R；或(ii)位置141处的氨基酸残基D、位置170处的氨基酸残基E和位置187处的氨基酸残基R。

另一方面，本文进一步提供了抗体或抗体片段，其包括第一重链多肽和第一轻链多肽，其中(a)所述第一重链多肽和所述第一轻链多肽形成第一同源对；并且(b)所述第一重链多肽包括第一CH1结构域变体，所述第一CH1结构域变体包括根据EU编号的以下位置中的一个或多个位置处的氨基酸取代：118、119、124、126-134、136、138-143、145、147-154、163、168、170-172、175、176、181、183-185、187、190、191、197、201、203-206、208、210-214、216和218，使得所述第一CH1结构域变体优先与所述第一轻链结合。任选地，所述第一轻链多肽包括第一CL结构域，所述第一CL结构域为野生型CL结构域。进一步任选地，可以如上文所描述的排除某些CH1结构域变体并且根据本发明的CH1结构域变体可以满足如上文所描述的项目(a)-(o)中的一项或多项。本文还提供了此类抗体或抗体片段，其进一步包括第二重链多肽和第二轻链多肽，其中：(a)所述第二重链多肽和所述第二轻链多肽形成第二同源对；并且(b)所述第二重链多肽包括第二CH1结构域变体，所述第二CH1结构域变体包括根据EU编号的以下位置中的一个或多个位置处的氨基酸取代：118、119、124、126-134、136、138-143、145、147-154、163、168、170-172、175、176、181、183-185、187、190、191、197、201、203-206、208、210-214、216和218，使得所述第二CH1结构域变体优先与包括第二CL结构域的所述第二轻链多肽结合。同样，任选地，可以如上文所描述的排除某些CH1结构域变体并且根据本发明的CH1结构域变体可以满足如上文所描述的项目(a)-(o)中的一项或多项。进一步任选地，此类抗体或抗体片段包括特征(i)-(vii)中的一个或多个：(i)所述第一CL结构域是野生型CL结构域；(ii)所述第二CL结构域是野生型CL结构域；(iii)所述第一CL结构域是κCL结构域；(iv)所述第一CL结构域是λCL结构域；(v)所述第二CL结构域是κCL结构域；(vi)所述第二CL结构域是λCL结构域；(vii)所述第一CH1结构域变体是根据权利要求1到20中任一项所述的CH1结构域变体；(viii)所述第二CH1结构域变体是根据权利要求1到20中任一项所述的CH1结构域变体；和/或(ix)所述第一CH1结构域变体中的所述氨基酸取代与所述第二CH1结构域变体中的所述氨基酸取代不同。

本文进一步提供了抗体或抗体片段，其包括第一重链多肽和第一轻链多肽，其中：(a)所述第一重链多肽和所述第一轻链多肽形成第一同源对；(b)所述第一重链多肽包括根据上文所描述的κ偏好CH1结构域变体中的任一个的第一CH1结构域变体；并且(c)所述第一轻链多肽包括κCL结构域并且任选地是κ轻链多肽。任选地，(i)所述κCL结构域是野生型CL结构域；和/或(ii)所述第一轻链多肽是野生型轻链多肽。在某些实施例中，第一重链多肽任选地包括所述CH1结构域外的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代进一步促进所述重链与以下的优先配对：(i)κCL结构域，如与λCL结构域相比，和/或(ii)κ轻链多肽，如与λ轻链多肽相比。CH1结构域外的一个或多个氨基酸取代可以例如在VH中。

本文还提供了抗体或抗体片段，其包括第二重链多肽和第二轻链多肽，其中：(a)所述第二重链多肽和所述第二轻链多肽形成第一同源对；(b)所述第二重链多肽包括根据上文所描述的λ偏好CH1结构域变体中的任一个的第二CH1结构域变体；并且(c)所述第二轻链多肽包括λCL结构域，并且任选地是λ轻链多肽。任选地，(i)所述λCL结构域是野生型CL结构域；和/或(ii)所述第二轻链多肽是野生型轻链多肽。在某些实施例中，第二重链多肽任选地包括所述CH1结构域外的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代进一步促进所述重链与以下的优先配对：(i)λCL结构域，如与κCL结构域相比，和/或(ii)λ轻链多肽，如与κ轻链多肽相比。

本文还提供了抗体或抗体片段，其包括第一重链多肽、第一轻链多肽、第二重链多肽和第二轻链多肽，其中：(a)所述第一重链多肽和所述第一轻链多肽形成第一同源对；(b)所述第一重链多肽包括第一CH1结构域，所述第一CH1结构域包括根据上文所描述的κ偏好CH1结构域变体中的任一个的CH1结构域变体；(c)所述第一轻链多肽包括κCL结构域并且任选地是κ轻链多肽；(d)所述第二重链多肽和所述第二轻链多肽形成第二同源对；(e)所述第二重链多肽包括第二CH1结构域，所述第二CH1结构域包括根据上文所描述的λ偏好CH1结构域变体中的任一个的CH1结构域变体；并且(f)所述第二轻链多肽包括λCL结构域，并且任选地是λ轻链多肽。在某些实施例中，第一重链多肽任选地包括所述CH1结构域外的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代进一步促进所述重链与以下的优先配对：(i)κCL结构域，如与λCL结构域相比，和/或(ii)κ轻链多肽，如与λ轻链多肽相比。CH1结构域外的一个或多个氨基酸取代可以例如在VH中。在某些实施例中，第二重链多肽任选地包括所述CH1结构域外的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代进一步促进所述重链与以下的优先配对：(i)λCL结构域，如与κCL结构域相比，和/或(ii)λ轻链多肽，如与κ轻链多肽相比。

抗体或抗体片段中的任何一个可以是多特异性的，任选地是双特异性的。任选地，此类抗体或抗体片段的结构如图24到29中的任一个图所描绘。

在一些实施例中，在如上文所描述的多特异性抗体或抗体片段中，第一CH1结构域变体和第二CH1结构域变体使非同源重链-轻链对的形成减少至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。在一些实施例中，在如上文所描述的多特异性抗体或抗体片段中，第一CH1结构域变体和第二CH1结构域变体将同源重链-轻链对的形成增加至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。

在一些实施例中，非同源重-轻配对的减少和/或同源重-轻配对的增加可以通过用包括所关注CH1、κLC和λLC的HC(或VH加CH1)以预定比率如HC:κLC:λLC＝2:1:1转染细胞和通过LCMS测量轻链物种如实例7和图23、30或31中的来进行定量。在使用此类或类似的定量方法的某些实施例中，示例性WT CH1可以产生HC-LC对，其中的60％是同源对，并且其中的40％是非同源对，并且通过根据本公开的CH1变体，同源对的百分比可以增加到至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％，并且非同源对的百分比可以减少到至少35％、至少30％、至少25％、至少20％、至少15％、至少10％、至少5％或0％。在使用此类或类似的定量方法的特定实施例中，同源对的百分比可以增加到至少85％、至少90％、至少95％或100％，同时非同源对的百分比可以减少到至少15％、至少10％、至少5％或0％。

在一些实施例中，在如上文所描述的多特异性抗体或抗体片段中，第一CH1结构域变体和第二CH1结构域变体使非同源重链-轻链对的形成减少至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍、至少20倍、至少21倍、至少22倍、至少23倍、至少24倍或至少25倍。在一些实施例中，在如上文所描述的多特异性抗体或抗体片段中，第一CH1结构域变体和第二CH1结构域变体将同源重链-轻链对的形成增加至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍、至少20倍、至少21倍、至少22倍、至少23倍、至少24倍或至少25倍。

在一些实施例中，非同源重-轻对的减少和/或同源重-轻对的增加可以通过以下来进行定量：以预定比率同时表达包括所关注的CH1的HC(或VH+CH1)、κLC和λLC以允许在细胞(例如，酵母细胞)上呈现重-轻对，用抗κ和抗λ抗体对细胞进行染色，并且通过FACS，例如通过如图2-5、8-13和19-22所示比较MFI值来对κ和λ存在进行定量。为了比较某个CH1的κ偏好，可以计算用抗κ染色的细胞的MFI:与用抗λ染色的细胞的MFI的比率并且除以WT CH1的此类比率以获得相对于亲本的倍数(FOP)值。为了比较某个CH1的λ偏好，可以计算用抗λ染色的细胞的MFI:与用抗κ染色的细胞的MFI的比率并且除以WT CH1的此类比率。

在使用此类或类似的定量方法的某些实施例中，使用根据本公开的κ偏好CH1变体，FOP值(针对κ偏好计算，即κ:λ的MFI)可以增加至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍、至少20倍、至少21倍、至少22倍、至少23倍、至少24倍或至少25倍。在使用此类或类似的定量方法的某些实施例中，使用根据本公开的λ偏好CH1变体，FOP值(针对λ偏好计算，即λ:κ的MFI)可以增加至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍、至少20倍、至少21倍、至少22倍、至少23倍、至少24倍或至少25倍。

在一些实施例中，第二CH1结构域变体包括位置141处的取代并且使非同源重链-轻链对的形成减少至少50％。在一些实施例中，第二CH1结构域变体包括位置141处的取代，并且第一CH1结构域变体包括位置183和任选地位置147处的取代，或反之亦然，并且使非同源重链-轻链对的形成减少至少50％到至少75％。在一些实施例中，第二CH1结构域变体包括141D或141E，并且第二CH1结构域变体包括183R、183K或183Y和任选地147F，或反之亦然，并且使非同源重链-轻链对的形成减少至少50％到至少75％。在一些实施例中，第二CH1结构域变体包括141D或141E、170E、171E、181K、185R、187R和218P中的一个或多个，并且第一CH1结构域变体包括183R、183K或183Y和任选地147F，或反之亦然，并且使非同源重链-轻链对的形成减少至少50％到至少75％。在一些实施例中，第二CH1结构域变体包括141D、171E和185R的组合、141D、171E和187R的组合或141D、181K和218P的组合，并且第二CH1结构域变体包括183R、183K或183Y和任选地147F，或反之亦然，并且使非同源重链-轻链对的形成减少至少50％到至少75％。

在一些实施例中，第一CH1结构域变体和第二CH1结构域变体提供期望的第一同源对和第二同源对的至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的形成。在一些实施例中，第一CH1结构域变体和第二CH1结构域变体提供期望第一同源对和第二同源对的约85％到约95％的形成。在一些实施例中，第二CH1结构域变体包括位置141处的取代，并且第一CH1结构域变体包括位置183和任选地位置147的取代，并且提供期望第一同源对和第二同源对的约85％到至少约95％的形成。在一些实施例中，第二CH1结构域变体包括141D或141E，并且第一CH1结构域变体包括183R、183K或183Y和任选地147F，或反之亦然，并且提供期望第一同源对和第二同源对的约85％到至少约95％的形成。在一些实施例中，第一CH1结构域变体和第二CH1结构域变体使非同源重链-轻链对的形成减少小于25％、小于20％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。在一些实施例中，第二CH1结构域变体包括位置141、170、171、181、185、187和/或218处的取代，并且第一CH1结构域变体包括位置183和任选地位置147处的取代，或反之亦然，并且使非同源重链-轻链对的形成减少小于约15％、小于约10％或小于约5％。在一些实施例中，第二CH1结构域变体包括141D或141E、170E、171E、181K、185R、187R和218P中的一个或多个，并且第一CH1结构域变体包括183R、183K或183Y和任选地147F，或反之亦然，并且使非同源重链-轻链对的形成减少小于约15％、小于约10％或小于约5％。

在又另一方面，本文进一步提供了药物和诊断组合物，其包括：(i)如上文所描述的CH1结构域变体多肽；(ii)如上文所描述的抗体重链多肽；和/或(iii)如上文所描述的抗体或抗体片段。

另一方面，本文进一步提供了抗体和药物组合物的治疗和诊断用途，所述抗体和药物组合物包括：(i)如上文所描述的CH1结构域变体多肽；(ii)如上文所描述的抗体重链多肽；和/或(iii)如上文所描述的抗体或抗体片段。

在仍另一方面，本文进一步提供了核酸，其编码：(i)如上文所描述的CH1结构域变体多肽；(ii)如上文所描述的抗体重链多肽；和/或(iii)如上文所描述的抗体或抗体片段。

在又另一方面，本文进一步提供了包括编码以下的核酸的载体或用编码以下的核酸转染的细胞：(i)如上文所描述的CH1结构域变体多肽；(ii)如上文所描述的抗体重链多肽；和/或(iii)如上文所描述的抗体或抗体片段和其用来产生上述的用途。

另一方面，本公开提供了生成CH1变体结构域文库的方法，所述方法包括步骤(a)-(c)：(a)提供(i)一个或多个由与包括κCL结构域的多肽配对的包括CH1结构域的多肽构成的集(“Cκ集”)；(ii)一个或多个由与包括λCL结构域的多肽配对的包括CH1结构域的多肽构成的集(“Cλ集”)；和/或(iii)在C

任选地：(I)在步骤(a)中，所述CH1结构域、所述κCL结构域和所述λCL结构域是野生型的和/或人的；(II)在步骤(a)中，(i)所述与包括κCL结构域的多肽配对的包括CH1结构域的多肽和(ii)所述与包括λCL结构域的多肽配对的包括CH1结构域的多肽两者都是完整抗体或抗原结合片段(“Fab”)；(III)在步骤(b)中，所述CH1结构域的一个或多个氨基酸位置在以下情况下被选择：所述CH1结构域的所述一个或多个氨基酸位置处的氨基酸残基在以下的

在一些实施例中，步骤(b)中选择的一个或多个CH1氨基酸位置：(i)位于与Cκ集的代表性集的至少10％中的κCL结构域的界面处，并且在Cκ集的代表性集的至少90％中的分数溶剂可及表面积大于10％；(ii)位于与Cλ组的代表性集的至少10％中的λCL结构域的界面处，并且在Cλ组的代表性集的至少90％中的分数溶剂可及表面积大于10％和/或(iii)位于与C

在一些实施例中，在步骤(b)中选择的所述氨基酸位置包括根据EU编号的位置118、119、124、126-134、136、138-143、145、147-154、163、168、170-172、175、176、181、183-185、187、190、191、197、201、203-206、208、210-214、216和218中的一个或多个位置。任选地，可以如上文所描述的排除某些CH1结构域变体并且根据本发明的CH1结构域变体可以满足如上文所描述的标准(a)-(o)。

在一些实施例中，在步骤(c)中编码CH1变体结构域或CH1结构域变体文库的合成多肽在酵母菌株中表达。在一些实施例中，酵母菌株是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。在一些实施例中，如酵母菌株等细胞系统共表达(i)包括κCL结构域，如κ轻链，的一个或多个多肽和(ii)包括λCL结构域，如λ轻链，的一个或多个多肽。任选地其中κ和/或λCL结构域是野生型的。进一步任选地，所述κ和/或λCL结构域是人类的。

在一些实施例中，本公开的方法进一步包括验证一个或多个经取代的CH1氨基酸残基驱动κ轻链或λ轻链的优先配对。在一些实施例中，荧光激活细胞分选用于验证一个或多个经取代的CH1氨基酸残基驱动κ轻链或λ轻链的优先配对。

在一些实施例中，一个或多个κ恒定(Cκ)结构域、一个或多个λ恒定(Cλ)结构域和一个或多个CH1结构域是野生型的。在一些实施例中，一个或多个κ恒定(Cκ)结构域、一个或多个λ恒定(Cλ)结构域和一个或多个CH1结构域是人类的。

在一些实施例中，生成CH1结构域文库的方法包括步骤(a)-(c)：(a)选择根据EU编号的以下CH1氨基酸位置中的一个或多个CH1氨基酸位置：118、119、124、126-134、136、138-143、145、147-154、163、168、170-172、175、176、181、183-185、187、190、191、197、201、203-206、208、210-214、216和218；(b)选择不同于在步骤(a)中选择的所述位置的一个或多个所关注CH1氨基酸位置；以及(c)产生CH1结构域变体多肽文库或CH1结构域变体编码构建体的文库，其中在步骤(a)和(b)中选择的所述一个或多个氨基酸位置中的一个或多个氨基酸位置被任何非野生型氨基酸取代。在某些实施例中，在(a)中选择的所述氨基酸位置可以包括位置141、147、151、170、171、181、183、185、187或218或其任何组合。在某些实施例中，步骤(c)中的所述产生是通过简并密码子，任选地表示六个天然存在的氨基酸(D、T、A、E、K和N)的简并RMW密码子或表示所有20个天然存在的氨基酸残基的简并NNK密码子进行的。在某些实施例中，在步骤(c)中，在步骤(a)中选择的氨基酸位置可以被取代为预定氨基酸，并且在(b)中选择的氨基酸位置通过简并密码子取代。任选地，取代为预定氨基酸的取代可以包括A141D、A141E、K147F、P151A、P151L、F170E、P171E、S181K、S183R、V185R、T187R或K218P或其任何组合。

在又另一方面，本公开提供了鉴定优先与以下配对的一个或多个CH1结构域变体多肽的方法：(A)包括κCL结构域的多肽，如与包括λCL结构域的多肽相比；或(B)包括λCL结构域的多肽，如与包括κCL结构域的多肽相比。此类方法包括步骤(a)-(c)：(a)将一个或多个候选CH1结构域变体多肽与(i)包括κCL结构域的一个或多个多肽和(ii)包括λCL结构域的一个或多个多肽共表达；(b)将(i)与包括κCL结构域的多肽配对的候选CH1结构域变体多肽的量与(ii)与包括λCL结构域的多肽配对的候选CH1结构域变体多肽的量进行比较；(c)基于步骤(b)中的所述比较，选择提供与以下的优先配对的一个或多个CH1结构域变体：(A)包括κCL结构域的多肽，如与包括λCL结构域的多肽相比；或(B)包括λCL结构域的多肽，如与包括κCL结构域的多肽相比。在步骤(a)中，通常所表达的所述候选CH1结构域变体多肽的总量和包括所表达的(κ和λ)CL结构域的所述多肽的总量可以大致相同。任选地其中在步骤(a)中，所述候选CH1结构域变体多肽、所述包括κCL结构域的多肽和所述包括λCL结构域的多肽大致以2:1:1的比率表达。

在一些实施例中，在步骤(a)中，所述(i)包括κCL结构域的一个或多个多肽和(ii)包括λCL结构域的一个或多个多肽是野生型的和/或人的。

在一些实施例中，在步骤(b)中，量是通过荧光激活细胞分选或通过液相色谱法-质谱法确定的。

在一些实施例中，所述方法进一步包括步骤(d)：(d)将一个或多个对照CH1结构域变体与(i)包括κCL结构域的一个或多个多肽和(ii)包括λCL结构域的一个或多个多肽共表达，任选地其中所述一个或多个对照CH1结构域变体中的一个或多个对照CH1结构域变体根据上文所描述的那些中的任一个的CH1结构域变体。

附图说明

图1A-C是CH1结构域变体与Cλ结构域或Cκ结构域结合的示意图。图1A示出了野生型CH1结构域与Cλ和Cκ的异二聚化(野生型或未修饰的CH1结构域称为CH1

图2A和2B示出了多轮选择的示例性FACS图以鉴定具有λCL结构域偏好(图2A)或κCL结构域偏好(图2B)的CH1结构域变体。R1＝第一轮选择，R2＝第二轮选择，R3＝第三轮选择。x轴示出用PE标记的λ轻链，并且y轴示出用FITC标记的κ轻链。

图3示出了表达具有λCL结构域偏好或κCL结构域偏好的CH1结构域变体的单个独特克隆。对克隆的抗κ中值荧光强度(MFI)与抗λMFI的比率(κ:λ比率)进行评分。将任何单个克隆的κ:λ比率与具有野生型CH1序列的匹配菌株(“亲本”)进行比较。FOP意指相对于亲本的倍数。

图4示出了在位置141、147或183处用氨基酸取代表达CH1结构域变体的单个独特克隆(EU编号)。对克隆的抗κMFI与抗λMFI的比率进行评分，并且与亲本进行比较以确定FOP。CH1位置147和183被鉴定为提供κCL结构域偏好的两个位置。CH1位置141被鉴定为提供λCL结构域偏好的位置。

图5示出了在具有λCL结构域偏好(A141T、Q、D或R)或κCL结构域偏好(K147V、A、F、Y或M)的CH1结构域中的位置141、147和/或183(EU编号S183K)处的特定氨基酸取代，如通过抗κMFI与抗λMFI的比率测量的。在从多个位置处从具有多样性的文库进行初始选择之后鉴定示出为白点(V134；T141、V147；A151和K183)的氨基酸取代，并且在从具有靶向位置141、147和183的多样化的文库中进行另外轮次选择后，鉴定示出为黑点的氨基酸取代。亲本κ:λ比率(野生型信号):GAL1 Cκ；GAL10 Cλ:3.58和GAL1 Cλ；GAL10Cκ:0.3。亲本比率是实验重复的平均值。对于在位置147和183处具有取代的CH1变体，列出的第一氨基酸是位置147处的变体，并且列出的第二氨基酸是183处的变体(例如，Y x F意指具有取代K147Y和S183F的CH1变体)。

图6A-E示出了代表性结合数据，其表明与野生型CH1结构域(BsAb1和BsAb15)相比，CH1结构域变体不改变多特异性抗体(BsAb2-BsAb14)的靶结合。图6A示出了针对BsAbs1-3的IL12B和EGFR结合数据。图6B示出了针对BsAbs 5、7和4的IL12B和EGFR结合数据。图6C示出了针对BsAbs 9、10和6的IL12B和EGFR结合数据。图6D示出了针对BsAbs 11、12和8的IL12B和EGFR结合数据。图6E示出了针对BsAbs13-15的IL12B和EGFR结合数据。Pani＝帕尼单抗(Panitumumab)；Uste＝乌司奴单抗(Ustekinumab)。

图7示出了与含有野生型CH1结构域的双特异性抗体(BsAb1)相比，在含有CH1结构域变体的双特异性抗体(BsAb2-BsAb14)中正确重链-轻链配对(HC1-LC1或HC2-LC2)的增加以及重链-轻链错配(HC1-LC2和HC2-LC1)的同时减少。

图8示出了在从实例5中的141x181x218文库选择输出获得的CH1结构域的位置141、181和218处具有不同氨基酸取代的WT克隆、A141D克隆和单个克隆的λ偏好FOP值。矩形中标记的13个数据点对应于具有最高FOP值的克隆，并且CH1位置141、181和218处的氨基酸残基和每个克隆的FOP值提供在表8中。

图9示出了在实例5中的141x181x218文库选择输出中CH1结构域的位置141处具有D、在位置181处具有K和在位置218处具有不同氨基酸取代的WT克隆、A141D克隆和单个克隆的λ偏好FOP值。空心数据点表示具有相同CH1序列的单个克隆的FOP，并且实心数据点表示平均FOP值。

图10示出了用重新克隆的克隆以及WT和A141D克隆测量的λ偏好FOP值，这证实维持了λ偏好。

图11示出了具有实例5中选择的九个141x181x218前导序列之一的CH1的HEK293产生的IgG以及针对κCL和λCL染色的WT和A14D的示例性散点图。单个克隆的散点图与WT图重叠。x轴示出用PE标记的λ轻链，并且y轴示出用FITC标记的κ轻链。

图12示出了来自实例5的九个前导序列以及WT和A141D的λ偏好FOP值。选择具有最高FOP值(D_K_WT、D_K_P和D_K_A)的三个CH1变体用于随后在HEK293中的双链(κ或λ)转染。

图13比较在位置141处具有相同氨基酸的CH1变体中的λ偏好FOP值。当位置141为D时，在位置181处或在位置181和218处的另外的氨基酸取代进一步增加FOP值。

图14示出了在HEK293中产生的九个前导序列全长IgG的轻链种类(比较κ和λ)％，如通过液相色谱法-质谱法(“LCMS”)测量的。选择具有最高FOP值(D_K_WT、D_K_P和D_K_A)的三个CH1变体用于随后在HEK293中的转染。

图15示出了三个前导序列(D_K_WT、D_K_P和D_K_A)和A141D相对于WT的产率的示例性过程产率，示出为相对于亲本的倍数(“FOP”)值。

图16示出了具有三个前导CH1变体(D_K_WT、D_K_P和D_K_A)之一或A141D或WT的κ配对的Fab和λ配对的Fab的Tm(℃)。

图17示出了相对λTm(℃)，如定义为：[λ配对的变体Fab相对于λ配对的WT Fab的Tm变化(“ΔλTm”)]-[κ配对的变体Fab相对于κ配对的WT Fab的Tm变化(“ΔκTm”)]。

图18提供了来自实例6中的重新克隆输出的测序结果，可视化了在输出克隆中观察到的频繁氨基酸取代。

图19示出了来自实例6中的重新克隆输出的前导序列以及来自实例5的141x181x218前导序列(DKP、DKA、KKE、KKP和EKK)中的一些的λ偏好FOP值(λMFI:κMFI)，其在酵母中表达为IgG。至少七个用箭头标记的前导序列具有等于或高于所测试141x181x218前导序列的值的FOP值。

图20示出了来自实例7的14个前导序列以及实例5中鉴定的DKP、A141D和野生型的λ偏好FOP值。用箭头标记的两中前导序列，“A414D_P171E_V185R”和“A141D_F170E_T187R”示出比DKP更高的FOP值。所有14个前导序列的FOP值都高于野生型。

图21示出了比较实例7中的14个CH1结构域变体和三个对照(实例5中鉴定的DKP、A141D和野生型)的λ偏好示例性FACS图。x轴示出用PE标记的λ轻链，并且y轴示出用FITC标记的κ轻链。每个图中的编号是表14中所示的排序#。例如，编号为“1”和“2”的前两个图分别是“A414D_P171E_V185R”和“A141D_F170E_T187R”的图。

图22示出了图21的单个图(标记为“a”)、野生型图(标记为“b”)和DKP图(标记为“c”)的示例性FACS图重叠。

图23示出了在HEK293中产生的14个前导序列和三个对照全长IgG的轻链种类(比较κ和λ)％，如通过实例7中的LCMS测量的。三个对照用空心箭头示出。与阳性对照“DKP”相比，“A414D_P171E_V185R”和“A141D_F170E_T187R”(实心箭头)示出更高的λ％和更低的κ链％。

图24-29提供了本文所公开的CH1结构域变体可以使用的各种多特异性抗体结构的示例性实施例和非限制性实施例。在图24-29中，除非另有说明，否则以下适用：(1)每个结构域呈现为矩形，其中的文本示出结构域名称(例如，CH1、VH1等)；(2)实心矩形和点状矩形是具有κ或λ偏好CH1结构域变体，其可以是本文所公开的CH1结构域变体；(3)“CH1κ”是具有κCL偏好CH1结构域变体，“CH1λ”是具有λ偏好CH1结构域变体，并且在有或没有轻链同种异型偏好的情况下，没有“κ”或“λ”指示的“CH1”是任何CH1结构域、野生型或变体；(4)“Cκ”是κCL结构域，“Cλ”是λCL结构域，并且没有“κ”或“λ”指示的“CL”，当示出与实心或点状CH1结构域配对时，表示配对的实心或点状CH1结构域偏好的同种异型(κ或λ)的CL结构域；(5)当超过一个实心和/或点状CH1结构域存在于多特异性结构中时，至少一个是本文所公开的CH1结构域变体，并且其余可以是或可以不是本文所公开的CH1结构域变体；(6)当实心和点状CH1结构域两者都存在于多特异性结构中时，实心和点状表示具有不同轻链同种异型偏好的CH1结构域(即，当实心表示具有κ偏好CH1结构域时，点状表示具有λ偏好CH1结构域，反之亦然)；(7)VH1和VL1形成第一表位的抗原结合位点，VH2和VL2形成第二表位的抗原结合位点，VH3和VL3形成第三表位的抗原结合位点，VH4和VL4形成第四表位的抗原结合位点，VH5和VL5形成第五表位的抗原结合位点，并且VH6和VL6形成第六表位的抗原结合位点；(8)所有第一到第六表位可以彼此不同，或并非所有第一到第六表位可以彼此不同，只要特异性组合整体使所呈现的结构具有多特异性；(9)彼此连接的一组多个结构域表示多肽(例如，重链多肽、轻链多肽等)；(10)多肽内的结构域方向根据从N端到C端的显示结构域名称的文本方向；(11)接头或铰链可以根据需要在结构域之间使用，并且二硫键可以在多肽之间(和/或结构域内)存在，这也许是为了使抗原结合位点正确形成，即使所述图没有明确地示出接头、铰链或二硫键；(12)图中所示的CH2和/或CH3结构域可以尽可能省略，并且适当时，可以用铰链替换；(13)CH1、CH2和CH3结构域可以单独地为野生型或变体，并且可单独地具有任何(重链)同种异型；并且(14)当结构中存在超过一个CH1结构域时，CH1结构域可以是或可以不是相同的同种异型，当结构中存在超过一个CH2结构域时，CH2结构域可以是或可以不是相同的同种异型，并且当结构中存在超过一个CH3结构域时，CH3结构域可以是或可以不是相同的同种异型。

图24A-24C提供了本文所公开的CH1结构域变体可以使用的各种多特异性抗体结构的一些示例性实施例和非限制性实施例。在图24A中，κ偏好CH1结构域(“CH1κ”)用于一个多肽。另一个CH1结构域可以或可以不偏好λCL结构域，并且可以是或可以不是本文所公开的CH1结构域变体。在图24B中，λ偏好CH1结构域(“CH1λ”)用于一个多肽。另一个CH1结构域可以或可以不偏好κCL结构域，并且可以是或可以不是本文所公开的CH1结构域变体。在图24C中，CH1κ用于一个多肽，并且CH1λ用于一个多肽。在没有或有用于去除错配化合物的最少或较少精力的情况下，这种通用结构允许制造双特异性化合物。CH1κ和CH1λ结构域中的至少一个是本文所公开的CH1结构域变体。如上文在(10)中所描述的，多肽内的结构域方向根据从N端到C端的显示结构域名称的文本方向。因此，在图24A的左上化合物的情况下，在从N端到C端的方向上，第一多肽包括VH1-CH1k-CH2-CH3，第二多肽包括VL1-Ck，第三多肽包括VH2-CH1-CH2-CH3，并且第四多肽包括VL2-CL。图24A-24C(和所有其它适用图)表示促进两个非同一多肽的异源二聚化的机制，例如“杵臼结构”工程化。图24A-24C(和所有其它适用图)示出了连接含CH1κ的多肽和含CH1λ的多肽的铰链结构。尽管两个键(例如，二硫键)明确示出为连接两个多肽，但键的数量和键的确切定位/位置可以变化并且适当地选择。在图24C的右下方，“+”指示两个不同Fab片段的混合物。

图25A-25B提供了本文所公开的CH1结构域变体可以使用的各种多特异性抗体结构的另外的示例性实施例和非限制性实施例。结构类似于图24A-23C中的结构，但结构域顺序不同。在图25A中，CH1κ与VL位于同一多肽中，并且CH1λ与VL位于同一多肽中。在图25B中，Cλ与CH2位于同一多肽中(上三个和左下方)，并且Cλ位于重链样多肽(含铰链的多肽)中(右下方)。

图26A-26C提供了各种多特异性抗体结构的另外的示例性实施例和非限制性实施例，所述多特异性抗体结构包括串联的两组两个抗原结合位点，并且因此是四价的。所述结构可以是双特异性、三特异性或四特异性的，这取决于第一、第二、第三和第四表位是什么。例如，如果第一、第二和表位彼此不同，并且如果第四表位与第一、第二或第三表位相同，则结构将是四价三特异性结构。

图27A-27C提供了各种多特异性抗体结构的另外的示例性实施例和非限制性实施例，所述多特异性抗体结构类似于图26A-26C中的那些结构，但结构域顺序不同。如上文在(10)中所描述的，多肽内的结构域方向根据从N端到C端的显示结构域名称的文本方向。因此，在图27A的左上结构的情况下，在从N端到C端的方向上，第一多肽包括VH3-VH1-CH1(实心)-CH2-CH3，第二多肽包括VL1-VL3-CL，第三多肽包括VH4-VH2-CH1(点状)-CH2-CH3，并且第四多肽包括VL2-VL4-CL。在图27A-27C的任何结构中，可以在结构域之间使用适当来实现抗原结合位点的适当形成。

图28A-28D提供了含有至少一个scFv的各种多特异性抗体结构的另外的示例性实施例和非限制性实施例。图24-29中提供的结构中的任何结构可以另外包括或修改为包括一个或多个含有scFv的部分，例如与重链恒定结构域、轻链恒定结构域和/或抗原结合结构域中的任何一个缀合。举例来说，图28A-28C提供了其中图24A中的左上结构与两个scFv缀合的结构，允许至多四个表位的特异性。在图28A中，scFv与CH3结构域缀合。在图28B中，scFv与CL结构域缀合。在图28C中，scFv与VH结构域缀合。在某些情况下，超过两个scFv可以缀合。举例来说，图28A-28C提供了其中图24A中的左上结构与四个scFv缀合的结构，允许至多六个表位的特异性。

图29A-29D提供了含有两个另外的Fab片段的各种多特异性抗体结构的又另外的示例性实施例和非限制性实施例。尽管两个Fab片段与CH3结构域缀合，但应注意，Fab片段可以与结构的任何其它部分缀合，并且还应注意一个(或三个或超过三个)而非两个Fab片段可以缀合。在图29A中，两个CH1结构域与CH2和CH3结构域在同一多肽中。在中间结构中，κ偏好CH1结构域和λ偏好CH1结构域存在于同一多肽(对于两个含CH1的多肽中的两个)内。当两个含CH1的多肽相同时，所述结构促进四价双特异性化合物的产生，而不需要促进两个非同一多肽的异源二聚化的机制(如“杵臼结构”工程化)，例如通过简单地使用在实例中使用的三链转染系统。在图29B中，两个多肽不含有任何CH1结构域。在中间结构中，当两个不含CH1的多肽相同时，所述结构促进四价双特异性化合物的产生，而不需要促进两个非同一多肽的异源二聚化的机制(如“杵臼结构”工程化)，例如通过简单地使用在实例中使用的三链转染系统。在图29C和29D中，每个多肽含有CH1结构域。在图29C和29D的中间结构中，如果第一和第三表位是相同表位并且第二和第四表位是相同表位但与第一和第三表位不同，则结构是双特异性的。在此类结构中，如果两个含CH2/CH3的多肽相同的，则所述结构促进四价双特异性化合物的产生，而不需要促进两个非同一多肽的异源二聚化的机制(如“杵臼结构”工程化)，例如通过简单地使用在实例中使用的三链转染系统。

图30示出了含有实例7中鉴定的前两个λ偏好CH1变体(“A141D P171E V185R”或“A141D F170E T187R”)之一或实例4中鉴定的κ偏好CH1变体(“K147F S183R”)或WT CH1的完整IgG的相对于WT的过程产率归一化的示例性过程产率。带条纹的条(与κ配对)和实心条(与λ配对)表示相对于WT对应产率归一化的过程产率。空心菱形(与κ配对)和实心三角形(与λ配对)表示原始过程产率(mg/L)。

图31示出了含有实例7中鉴定的前两个λ偏好CH1变体(“A141D P171E V185R”或“A141D F170E T187R”)之一或实例4或5中鉴定的λ偏好CH1变体(“A141D”或“A141D S181KK218P”)或实例4中鉴定的κ偏好CH1变体(“K147F S183R”)或WT CH1的Fab的相对于WT的过程产率归一化的示例性过程产率。产率相对于WT对应产率归一化。带条纹的条表示含有κLC的Fab，并且实心条表示含有λLC的Fab。

图32示出了在其电子密度中的野生型CH1-Cλ界面。与野生型λ恒定结构域(Cλ)配对的帕尼单抗可变片段(Fv)和野生型IgG1-CH1的Fab晶体结构的所关注区域中的代表性电子密度。重链(HC)碳原子以浅灰色着色，λ轻链(λLC)碳原子以白色着色，氮原子以深灰色着色，并且氧原子以黑色着色。蛋白质以棒状表示示出。2Fo-Fc电子密度图被示出为以1σ轮廓化的具有

图33示出了在其电子密度中的A141D CH1-Cλ界面。与野生型λ恒定结构域(Cλ)配对的帕尼单抗可变片段(Fv)和A141D取代的IgG1-CH1的Fab晶体结构的所关注区域中的代表性电子密度。重链(HC)碳原子以浅灰色着色，λ轻链(λLC)碳原子以白色着色，氮原子以深灰色着色，并且氧原子以黑色着色。蛋白质以棒状表示示出。2Fo-Fc电子密度图被示出为以1σ轮廓化的具有

图34示出了在其电子密度中的野生型CH1-Cκ界面。与野生型κ恒定结构域(Cκ)配对的帕尼单抗可变片段(Fv)和野生型IgG1-CH1的Fab晶体结构的所关注区域中的代表性电子密度。重链(HC)碳原子以浅灰色着色，κ轻链(κLC)碳原子以白色着色，氮原子以深灰色着色，并且氧原子以黑色着色。蛋白质以棒状表示示出。2Fo-Fc电子密度图被示出为以0.9σ轮廓化的具有

图35示出了在其电子密度中的K147F-S183R CH1-Cκ界面。与野生型κ恒定结构域(Cκ)配对的帕尼单抗可变片段(Fv)和K147F-S183R取代的IgG1-CH1的晶体结构的所关注区域中的代表性电子密度。重链(HC)碳原子以浅灰色着色，κ轻链(κLC)碳原子以白色着色，氮原子以深灰色着色，并且氧原子以黑色着色。蛋白质以棒状表示示出。2Fo-Fc电子密度图被示出为以0.9σ轮廓化的具有

图36A-36D示出了HC-A141D取代允许与λLC氢键合同时通过与κLC的空间位阻使κ配对不稳定。图36A-36D提供了在WT CH1与λLC之间(图36A)、在WT CH1与κLC之间(图36B)、在A141D CH1与λLC之间(图36C)或在A141D CH1与κLC之间(图36D)HC-Ala141位置周围的配对界面的视图。κ轻链恒定结构域(κLC)界面含有例示在图36B中的三个疏水残基Phe116、Phe118和Leu135。λLC中Thr116在结构上等效的κLC-Phe116位置处的存在使得与HC-Asp141的羧基氢结合，如黑色虚线所示(图36C)。在图36D中，A141D CH1-恒定λ(Cλ)和WT CH1-Cκ的HC比对示出HC-Asp141侧链与κLC-Phe116侧链的空间位阻。重链(HC)碳原子以浅灰色着色，轻链(LC)碳原子以白色着色，氮原子以深灰色着色，并且氧原子以黑色着色。侧链以具有透明分子表面的棒状表示示出，并且主链原子以草图表示示出。

图37A和37B示出了野生型CH1序列将HC-Gln175隔离在链内氢键网络中，这可能会被K147F取代破坏，从而允许HC-Gln175自由与κLC-Gln160相互作用。图37A和37B提供了HC中三元氢键网络的视图，涉及帕尼单抗野生型CH1-恒定κ(Cκ)结构(图37A)和帕尼单抗K147F-S183R-CH1-Cκ结构(图37B)中的Lys147、Asp148和Gln175。重链(HC)碳原子以浅灰色着色，κ轻链(κLC)碳原子以白色着色，氮原子以深灰色着色，并且氧原子以黑色着色。侧链以棒状表示示出，并且主链原子以草图表示示出。氢键示出为虚线。

图38A-38D示出了HC-Arg183与κLC-Thr178之间的氢键合可以驱动κ配对，而HC-Arg183与λLC-Tyr178的空间位阻降低了对λ配对的偏好。图38A-38D提供了IgG1-CH1中S183R取代周围区域和在帕尼单抗野生型CH1-恒定λ(Cλ)结构(图38B)中HC-Ser183与λLC-Thr178之间以及在帕尼单抗K147F-S183R-CH1-恒定κ(Cκ)结构(图38C)中HC-Arg183与κLC-Thr178之间的氢键的视图。图38A示出了HC-Ser183和κLC-Thr178距离太远而无法发生氢键合。重链(HC)碳原子以浅灰色着色，轻链(LC)碳原子以白色着色，氮原子以深灰色着色，并且氧原子以黑色着色。侧链以棒状表示示出。λLC-Tyr178的侧链也示出为透明的分子表面。氢键示出为黑色虚线。图38D提供了模型，其中帕尼单抗K147F-S183R-CH1-Cκ结构的HC与帕尼单抗野生型CH1-Cλ结构的HC叠加。所得模型示出了HC-Arg183与λLC-Tyr178之间的明显空间位阻。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。如本文所用，术语“约”当参考特定列举的数值使用时意指所述值可以与所列举值相差不超过1％。例如，如本文所用，表述“约100”包含99和101以及介于其之间的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

应当理解，本文所描述的本公开的方面和实施例包含“包括”方面和实施例，“由方面和实施例组成”和“基本上由方面和实施例组成”。

本文提供了含有至少一个氨基酸取代的经工程化的CH1结构域，所述氨基酸取代通过促进含有CH1结构域的重链与κCL结构域(或κ轻链)或λCL结构域(或λ轻链)的优先配对来防止重链-轻链错配。术语“优先配对”是指重链(或CH1结构域)与多肽，例如抗体，例如双特异性抗体中的轻链(或CL结构域)的配对。当重链(H1)与两条不同的轻链(L1和L2)共表达时，H1将与L1和L2中的每一个配对，从而产生H1:L1和H1:L2的混合物。在一些情况下，H1可以与L1和L2两者同样配对良好，产生大约50:50H1:L1到H1:L2的混合物。例如，如果形成的H1:L1异二聚体的量大于H1与L1和L2共表达时形成的H1:L2异二聚体的量，则H1与L1之间将发生“优先配对”。在此实例中，H1相对于L2与L1配对。如果相比L2，H1固有地偏向于与L1配对(使得H1:L1与H1:L2的比率不是50:50，而是例如60:40或70:30，在这种情况下形成H1:L2仍然是不期望的)，那么当H1:L1之间的配对数量与H1:L2相比有所改进(增加)时，将出现期望配对之间的优先配对，即H1:L1。如本文所使用的，术语“优先配对”涵盖重链和轻链的配对(如上文所描述)以及CH1结构域和CL结构域的配对。举例来说，如果形成的CH1:Cκ的量大于CH1与Cκ和Cλ共表达时形成的CH1:Cλ的量，则将在CH1结构域与κCL结构域之间发生“优先配对”。同样，如果形成的CH1:Cλ的量大于CH1与Cλ和Cκ共表达时形成的CH1:Cκ的量，则将在CH1结构域与λCL结构域之间发生“优先配对”。

发现鉴定为CH1-CL界面的一部分(对于Cκ和Cλ两者)的CH1结构域内的某些位置影响重链与轻链的结合。另外，CH1:VH界面处的CH1结构域内的位置也示出影响重链与轻链的结合。重链通过两组结构域界面与轻链配对：一组在VH与VL结构域之间，并且另一组在CH1与CL结构域之间，并且其中链配对或相遇或接触称为“界面”。此外，在重链内，CH1结构域还与VH的一部分接触，并且CH1结构域和VH非常接近的这种空间也被术语“界面”涵盖。界面包括重链中的氨基酸残基和轻链中的氨基酸残基，或者可替代地，CH1结构域中的氨基酸残基和VH中的氨基酸残基，它们在三维空间中相互接触。在一些实施例中，界面包括重链的CH1结构域和轻链的CL结构域。在其它实施例中，界面包括CH1结构域和重链的VH结构域。“界面”优选地源自IgG抗体或其Fab。

本文所描述的CH1变体结构域在以下处含有氨基酸取代：一个或多个CH1:CL界面(CH1:κCL或CH1:λCL)位置，例如位置141、147、170、171、175、181、183、184、185、187和/或218或一个或多个CH1:VH界面位置，例如位置151，如与亲本比较的。术语“亲本”是指随后被修饰以生成变体的多肽(和编码所述多肽的氨基酸序列)。亲本多肽可以是野生型或天然存在的多肽或其变体或工程化形式。因此，“亲本CH1结构域”是指随后被修饰以生成CH1结构域变体的CH1结构域多肽(和编码CH1结构域多肽的氨基酸序列)。此类亲本CH1结构域可以是野生型或天然存在的CH1结构域或其变体或工程化形式，例如被修饰以缀合毒素或小分子药物的野生型CH1结构域。此类亲本CH1结构域可以分离或是较大构建体，例如Fab、F(ab′)

所得CH1变体结构域与κCL(Cκ)结构域或λCL(Cλ)结构域具有优先配对，所述Cκ和Cλ结构域可以是轻链的一部分。CH1结构域位置147和183(EU编号)中的一个或两个处的氨基酸变异促进与Cκ的结合(并且同时阻止与Cλ的配对)，而CH1结构域位置141处的氨基酸变异促进与Cλ的结合(并且同时阻止与Cκ的配对)。κ和λCL结构域可以任何数量的形式存在，包含但不限于野生型或嵌合Fab或IgG，例如含有Vκ和Cκ、Vκ和Cλ、Vλ和Cκ或Vλ和Cλ的Fab或IgG。通过改进重链-轻链配对的保真度，同时维持双特异性抗体的天然IgG结构，此类CH1变体结构域可以用于工程化多特异性抗体，由于它作为治疗分子的公认特性，包含长的体内半衰期和引发效应器功能的能力，这是有利的。

术语“CH1结构域”是指抗体的重链的第一恒定结构域、重链的可变结构域的C端和铰链区的N端。根据IMGT，CH1结构域是来自位置118-215(EU编号)的氨基酸序列，并且铰链区是来自位置216-230(EU编号)的氨基酸序列。如本文所使用的，术语“CH1结构域变体”是指包含整个CH1结构域(根据EU编号的位置118-215)的氨基酸序列或其包括CH1残基118-215(根据EU编号)中的至少7个的片段，其中此类片段包含本文所公开的修饰中的一个或多个，以及铰链区的一部分(位置216-218)。被筛选以鉴定所描述的CH1结构域变体的文库包含在铰链区域中的变异，例如位置216和218。

CH1结构域与轻链的CL结构域配对。在一些实施例中，轻链是κ链。在一些实施例中，轻链是λ链。术语“κ恒定结构域”、“κCL结构域”或“Cκ”是指κ轻链的恒定结构域。术语“λ恒定结构域”、“λCL结构域”或“Cλ”是指λ轻链的恒定结构域。单个二硫键共价连接具有CL结构域的CH1。如本文所使用的，CH1结构域是指所有抗体同种异型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgM和IgE。

术语“抗体”以最广泛的含义在本文使用并且涵盖各种抗体结构，包含(但不限于)：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和/或抗体片段(优选地那些展现出期望抗原结合活性的片段，所述片段也称为“抗原结合抗体片段”)。

“单克隆抗体”或“mAb”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即包括所述群体的单个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了(例如含有天然发生的突变和/或取代或在单克隆抗体制剂的生产期间产生)可能的变体抗体，此类变体通常以少量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体都针对抗原上的单个决定簇。

“多特异性抗体”在本文中也可以称为“多特异性化合物”，是指包括至少两个不同的抗原结合结构域的抗体，所述抗原结合结构域识别并且特异性结合至少两个不同的抗原或至少两个不同的表位。在一些实施例中，多特异性抗体含有(1)第一重链和第一轻链，其形成同源对并且与第一抗原结合，以及(2)第二重链和第二轻链，其形成同源对并且与第二抗原结合。

本文也可以称为“双特异性化合物”的“双特异性抗体”是一种类型的多特异性抗体，并且指包括识别并且特异性与至少两个不同抗原或至少两个表位结合的两个不同抗原结合结构域的抗体。至少两个表位可以或可以不在同一抗原内。双特异性抗体可以靶向例如相同或不同(例如，免疫细胞和癌细胞)细胞上的两个不同的表面受体、两个不同的细胞因子/趋化因子、受体和配体。可以由双特异性抗体靶向的抗原的组合可以包含但不限于：CD3和Her2；CD3和Her3；CD3和EGFR；CD3和CD19；CD3和CD20；CD3和EpCAM；CD3和CD33；CD3和PSMA；CD3和CEA；CD3和gp100；CD3和gpA33；CD3和B7-H3；CD64和EGFR；CEA和HSG；TRAIL-R2和LTβR；EGFR和IGFR；VEGFR2和VEGFR3；VEGFR2和PDGFRα；PDGFRα和PDGFRβ；EGFR和MET；EGFR和EDV-miR16；EGFR和CD64；EGFR和Her2；EGFR和Her3；Her2结构域ECD2和Her2结构域ECD4；Her2和Her3；IGF-1R和HER3；CD19和CD22；CD20和CD22；CD30和CD16A；FceRI和CD32B；CD32B和CD79B；MP65和SAP-2；IL-17A和IL-23；IL-1α和IL-1β；IL-12和IL-18；VEGF和骨桥蛋白；VEGF和Ang-2；VEGF和PDGFRβ；VEGF和Her2；VEGF和DLL4；FAP和DR5；FcgRII和IgE；CEA和DTPA；CEA和IMP288；以及LukS-PV和LukF-PV。

“不同抗原”可以指不同的和/或独特的多个蛋白质、多肽或分子；以及不同的和/或独特的多个表位，所述表位可以被包含在一个蛋白质、多肽或其他分子内。因此，双特异性抗体可以与相同多肽上的两个表位结合。

术语“表位”是指与抗体分子的可变区中的特异性抗原结合位点相互作用的抗原决定簇，称为互补位。单个抗原可以具有多于一个表位。因此，不同的抗体可以结合抗原上的不同区域，并且可以具有不同的生物学效应。术语“表位”还指抗原上B细胞和/或T细胞所响应的位点。其还指由抗体结合的抗原区域。表位可以被定义为结构的或功能的。功能表位通常是结构表位的子集，并且具有直接促成相互作用亲和力的那些残基。表位也可以是构象的，即，由非线性氨基酸构成。在某些实施例中，表位可以包含作为分子诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基基团或磺酰基基团的化学活性表面分组的决定簇，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。

在一些情形中，抗体包括四条多肽链：通过二硫键互相连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。每个重链包括可变区，如重链可变区(“VH”)和重链恒定区(“CH”)。在完整抗体的情况下，CH包括结构域CH1、CH2和CH3。在抗体片段的情况下，CH可以包括CH1、CH2和/或CH3结构域，并且在一些优选实施例中，CH包括至少CH1结构域。本文所公开的CH1结构域变体可以与野生型CH2和/或CH3结构域或CH2和/或CH3结构域组合使用，所述结构域包括一个或多个氨基酸取代，例如改变或改进抗体稳定性和/或效应子功能的氨基酸取代。每个轻链包括可变区，如轻链可变区(“VL”)和轻链恒定区(“CL”)。VH区和VL区可以进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的超变区，所述超变区散布有更保守的被称作框架区(FR)的区。每个VH和VL包括从氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本公开的某些实施方案中，抗体(或其抗原结合片段)的FR可以与人生殖系序列相同，或者可以是经天然或人工修饰的。可以基于两个或更多个CDR的并排分析来定义氨基酸共有序列。因此，重链中的CDR分别被命名为“CDRH1”、“CDRH2”和“CDRH3”，并且轻链中的CDR被命名为“CDRL1”、“CDRL2”和“CDRL3”。在其它情况下，抗体可以包括其多聚体(例如，IgM)或其抗原结合片段。

在某些情况下，VH和CL可以存在于一个多肽中。在某些情况下，VL和CH1、CH2和/或CH3结构域可以存在于一个多肽中。例如，在某些抗体或抗体片段中，尽管第一多肽包括VH1和CH1，并且第二多肽包括VL1和CL(VH1和VL形成第一表位的抗原结合位点)，第三多肽包括VH2和CL，并且第四多肽包括VL2和CH1(VH2和VL2形成第二表位的抗原结合位点)。在另一个某个抗体或抗体片段中，尽管第一多肽包括VH1和CH1，并且第二多肽包括VL1和CL(VH1和VL形成第一表位的抗原结合位点)，第三多肽包括VL2、CL，以及CH2和/或CH3结构域中的一者或多者，并且第四多肽包括VH和CH1。本发明涵盖包括本文所公开的CH1变体中的任何CH1变体的任何抗体或抗体片段，其提供与κCL的优先配对或与λCL的优先配对，而不管CH1结构域是处于重链或轻链中。

本文使用的术语“同源对”或“同源配对”是指两个抗体链(例如重链和轻链)的对或配对，各自含有可变区(例如VH和VL)，其中可变区的组合提供与表位或抗原的预期结合特异性。本文使用的术语“非同源对”或“非同源配对”是指两个抗体链(例如重链和轻链)的对或配对，各自含有可变区(例如VH和VL)，其中可变区的组合不提供与表位或抗原的预期结合特异性。

存在五种主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类中的若干类可以进一步分为亚类(同种异型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类别的免疫球蛋白对应的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。

除非另有明确说明，否则本文所使用的术语“抗体”涵盖包括两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的分子(有时称为“全长抗体”或“完整抗体”或“整个抗体”等，在所有情况下是指具有与天然抗体基本上类似的结构的抗体)以及其抗原结合抗体片段。“抗原结合片段”或“抗原结合抗体片段”是指完整抗体的一部分或源自一个完整抗体或多个完整抗体的部分的组合，并且结合一个完整抗体或多个完整抗体与之结合的抗原。

抗体的抗原结合片段包含特异性地结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白。示例性抗体片段包含但不限于：Fv；片段抗原结合(“Fab”)片段；Fab'片段；含有游离巯基基团的Fab'('Fab'-SH')；F(ab')

与完整抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的、三特异性的、四特异性的等)。抗体的多特异性抗原结合片段可以包括至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性地结合单独的抗原或同一抗原的不同表位。

本公开提供了优先与κ轻链CL结构域或λ轻链CL结构域配对(或与之结合)的CH1结构域变体。在一个实施例中，CH1结构域变体未展现与κ级轻链或λ级轻链的结合减少，并且同时展现对与另一类轻链(在此实例中，分别为λ或κ)结合的排他性或增加的偏好。这些CH1结构域变体可以用于在通过促进适当的重链和轻链配对生成多特异性例如双特异性抗体时全部或部分解决重链和轻链错配。在一个实施例中，CH1结构域变体可以任选地与CH1结构域之外的其它变体组合使用，以进一步促进与κ轻链CL结构域或λ轻链CL结构域的优先配对(例如，VH:VL取代如Q39E/K:Q38K/E(Dillon等人,《MAbs》2017 9(2):213-230)；或Q39K+R62E:Q38D+D1R或Q39Y+Q105R:Q38R+K42D(Brinkmann等人,《MAbs》2017 9(2):182-212)。更具体地，包括这些CH1变体结构域的双特异性抗体将形成更少的不需要的产品相关的污染物，即含有错配结构域的分子，在下游加工期间消除所述污染物可能具有挑战性。例如，通过将抗体A的重链CH1结构域工程化为κ偏好CH1结构域变体(例如147Phe和/或183Arg、Lys、Tyr)并且将抗体B的重链CH1结构域工程化为λ偏好CH1结构域变体(例如141Asp)，包括(i)来自抗体A的重链和轻链(其中轻链是κ轻链)和(ii)来自抗体B的重链和轻链(其中轻链是λ轻链)的双特异性抗体可能会更有效地产生，即更少不需要的产品相关的污染物。因此，抗体A的重链将有利于与抗体A的轻链结合(并且不利于与抗体B的轻链结合)，而抗体B的重链将有利于与抗体B的轻链结合(并且不利于与抗体A的轻链结合)。参见图1和7以及表6。

在一些实施例中，CH1结构域变体将错配，即非同源HC1-LC2和/或HC2-LC1对的形成减少至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或至少80％。在一些实施例中，在位置141，例如141D处含有取代的CH1结构域变体，单独或与其它取代组合，例如147F+183R、147F+183K、147F+183Y，将错配，即非同源HC1-LC2和/或HC2-LC1对的形成减少至少25％到至少80％。在一些实施例中，在位置141，例如141D处含有取代的CH1结构域变体，单独或与其它取代组合，例如183R、183K、183Y、147F+183R、147F+183K、147F+183Y，将错配，即非同源HC1-LC2和/或HC2-LC1对的形成减少至少50％。在一些实施例中，在位置141，例如141D处含有取代的CH1结构域变体，单独或与其它取代组合，例如183R、183K、183Y、147F+183R、147F+183K、147F+183Y，将错配，即非同源HC1-LC2和/或HC2-LC1对的形成减少至少75％。

在一些实施例中，CH1结构域变体优先与同源CL结构域(Cκ或Cλ)或含有对应CL结构域(Cκ或Cλ)的同源轻链配对(与之结合)，导致期望的第一同源对和第二同源对即HC1-LC1和/或HC2-LC2的至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的形成。在一些实施例中，CH1结构域变体优先与同源CL结构域(Cκ或Cλ)或含有对应CL结构域(Cκ或Cλ)的同源轻链配对(与之结合)，导致期望的第一同源对和第二同源对即HC1-LC1和/或HC2-LC2的约80％到约99％或更具体地，至少约85％到至少约95％的形成。在一些实施例中，在位置141，例如141D处含有取代的CH1结构域变体，单独或与其它取代组合，例如183R、183K、183Y、147F+183R、147F+183K、147F+183Y，提供期望的第一同源对和第二同源对即HC1-LC1和/或HC2-LC2的约85％到至少约95％的形成。

在一些实施例中，CH1结构域变体使错配重链-轻链异质二聚体，即HC1-LC2和/或HC2-LC1对的形成减少到小于25％、小于20％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。在一些实施例中，在位置141，例如141D处含有取代的CH1结构域变体，单独或与其它取代组合，例如183R、183K、183Y、147F+183R、147F+183K、147F+183Y，使错配重链-轻链异质二聚体的形成减少到少于约15％、少于约10％或少于约5％。

几个CH1结构域位置被鉴定为影响轻链结合偏好，即优先与κCL结构域或λCL结构域配对，包含位置118、119、124、126-134、136、138-143、145、147-154、163、168、170-172、175-176、181、183-185、187、190、191、197、201、203-206、208、210-214、216和218(EU编号)。用变体(非野生型)氨基酸残基取代CH1结构域中这些位置中的任何一个或多个处的野生型氨基酸残基产生重链，所述重链对于含有κCL结构域或λCL结构域的轻链具有优先配对。例如，位置147和183中的每一个位置被鉴定为对于κCL结构域具有配对偏好，并且位置141、170、171、175、181、184、185、187和218被鉴定为对于λCL结构域具有配对偏好。

用Thr、Asp、Lys、Glu、Arg、Met、Val或Gln取代CH1结构域位置141处的野生型氨基酸残基(Ala)示出增加与含有λCL结构域的轻链结合的重链偏好。用Glu、Gly、Ser、Asn或Thr取代CH1结构域位置170处的野生型氨基酸残基(Phe)；用Glu、Gly、Ser、Asn、Asp或Ala取代CH1结构域位置171处的野生型氨基酸残基(Pro)；用Asp或Met取代CH1结构域位置175处的野生型氨基酸残基(Met)；用Val、Leu、Ala、Lys或Thr取代CH1结构域位置181处的野生型氨基酸残基(Ser)；用Arg取代CH1结构域位置184处的野生型氨基酸残基(Ser)；用Met、Leu、Ser、Arg、Thr取代CH1结构域位置185处的野生型氨基酸残基(Val)；用Arg、Asp、Glu、Tyr或Ser取代CH1结构域位置187处的野生型氨基酸残基(Thr)；和/或用Leu、Glu、Asp、Pro、Ala、His、Ser、Gln、Asn、Thr、Ile、Met、Gly、Cys、Lys或Trp取代CH1结构域位置218处的野生型氨基酸残基(Lys)还有助于增加重链与含有λCL结构域的轻链的配对。

用Val、Ala、Phe、Ile、Thr、Ser、Tyr、Leu、Arg、Asn、Glu、His、Met或Gln取代CH1结构域位置147处的野生型氨基酸残基(Lys)示出增加与含有κCL结构域的轻链结合的重链偏好。CH1结构域位置183处野生型氨基酸残基(Ser)取代为Arg、Lys、Tyr、Trp、Glu、Phe、Ile、Leu、Asn或Gln的取代示出增加与含有κCL结构域的轻链结合的重链偏好(参见图5)。给定变体氨基酸残基在特定位置处的影响可以变化，但基于包括变体残基的氨基酸位置，所有变体都示出与Cκ或Cλ的改进的优先配对。另外，鉴于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的CH1区中的高度类似性，预期本文所描述的CH1结构域变体将在每种同种异型中显示类似的优先配对特性。

与野生型CH1结构域序列(位置141处的Ala)相比，第一轮选择鉴定在位置141处的Thr促进与Cλ优先配对，但与Thr相比，另外几轮选择鉴定Asp、Arg和Gln提供增加的优先配对(参见图5)。另外的筛选策略鉴定Lys和Glu也提供增加的λ偏好(参见实例5，图10-14)。还发现位置170处的Glu；位置171处的Glu；位置175处的Met；位置181处的Lys；位置184处的Arg；位置185处的Arg；位置187处的Arg；和/或位置218处的Pro、Ala或Glu增加λ偏好(参见实例5-7)。此外，申请人示出增加λ偏好特定取代组合包含但不限于：位置141处的Asp和位置181处的Lys；位置141处的Asp、位置181处的Lys和位置218处的Ala；位置141处的Asp、位置181处的Lys和位置218处的Pro；位置141处的Glu、位置170处的Glu、位置181处的Val和位置187处的Arg；位置141处的Glu、位置171处的Asp和位置185处的Arg；位置141处的Glu、位置171处的Glu和位置185处的Arg；位置141处的Glu、位置171处的Gly、位置185处的Arg和位置187处的Arg；位置141处的Glu、位置185处的Arg和位置187处的Arg；位置141处的Glu、位置171处的Ser和位置181处的Lys；位置141处的Glu、位置170处的Gly、位置175处的Met、位置181处的Val、位置184处的Arg和位置187处的Arg。在另外的筛选工作中，鉴定：“位置141处的Asp、位置171处的Glu和位置185处的Arg”和“位置141处的Asp、位置170处的Glu和位置187处的Arg”为特别λ偏好CH1结构域取代组合(参见图20、23、30和31)。

类似地，与野生型CH1结构域序列相比，第一轮选择鉴定位置147处的Val或Ala和位置183处的Lys促进与Cκ的优先配对，但分别与147Val或Ala或183Lys相比，另外几轮的选择鉴定位置147处的Phe、Ile、Thr、Tyr、Leu、Arg、Asn、Glu、His、Met或Gln和/或位置183处的Arg、Tyr、Trp、Glu、Phe或Gln提供增加的优先配对。这些CH1结构域变体单独地或与其它氨基酸取代组合可以改进含有此类CH1结构域变体的重链与含有Cκ或Cλ的轻链的优先配对。

本文提供了包括根据EU编号的以下位置中的一个或多个位置处的氨基酸取代的变体CH1结构域，并且因此，所述CH1结构域变体显示出对Cκ或Cλ(或包括此类结构域的轻链)的优先配对：118、119、124、126-134、136、138-143、145、147-154、163、168、170-172、175-176、181、183-185、187、190、191、197、201、203-206、208、210-214、216、218。如本文所展示的，在这些位置中的一个或多个处的不同氨基酸残基取代可以产生优先与Cκ或Cλ配对的CH1结构域(参见表3和表4)。在一些实施例中，位置147(EU编号)处的氨基酸取代不是半胱氨酸。在一些实施例中，在位置183(EU编号)处的氨基酸取代不是半胱氨酸或苏氨酸。在一些实施例中，在位置147(EU编号)处的氨基酸取代不是半胱氨酸并且在位置183(EU编号)处的氨基酸取代不是半胱氨酸或苏氨酸。

在一些实施例中，CH1结构域变体包括在以下位置中的一个或多个处的氨基酸取代以驱动CH1结构域变体(或包括此类结构域的重链)与Cκ(或包括此类结构域的轻链)的优先配对：118、124、126-129、131-132、134、136、139、143、145、147-151、153-154、170、172、175-176、181、183、185、190-191、197、201、203-206、210、212-214和218(EU编号)。在一些实施例中，氨基酸取代是以下中的一项或多项：位置118被G取代；位置124被H、R、E、L或V取代；位置126被A、T或L取代；位置127被V或L取代；位置128被H取代；位置129被P取代；位置131被A取代；位置132被P取代；位置134被G取代；位置136被E取代；位置139被I取代；位置143被V或S取代；位置145被F、I、N或T取代；位置147被F、I、L、R、T、S、M、V、E、H、Y或Q取代；位置148被I、Q、Y或G取代；位置149被C、S或H取代；位置150被L或S取代；位置151被A或L取代；位置153被S取代；位置154被M或G取代；位置170被G或L取代；位置172被V取代；位置175被G、L、E、A取代；位置176被P取代；位置181被Y、Q或G取代；位置183被I、W、F、E、Y、L、K、Q、N或R取代；位置185被W取代；位置190被P取代；位置191被I取代；位置197被A取代；位置201被S取代；位置203被S取代；位置204被Y取代；位置205被Q取代；位置206被S取代；位置210被R取代；位置212被G取代；位置213被E或R取代；位置214被R取代；并且位置218被Q取代。在一些实施例中，CH1结构域变体包括在位置147和183处的氨基酸取代以驱动与κ轻链的优先配对(与之结合)。在一些实施例中，在位置147取代的氨基酸选自由以下组成的组：F、I、L、R、T、S、M、V、E、H、Y和Q，并且其中在位置183处取代的氨基酸选自由以下组成的组：I、W、F、E、Y、L、K、Q、N和R。在特定实施例中，CH1结构域变体包括单独在位置183处的R或K或Y或与在位置147处的F组合。κ偏好CH1结构域变体的非限制性实例可以包括SEQ ID NO:137、138、139、60、41或136的氨基酸序列。

在一些实施例中，CH1结构域变体包括在以下位置中的一个或多个处的氨基酸取代以驱动CH1结构域变体(或包括此类结构域的重链)与Cλ(或包括此类结构域的轻链)的优先配对：119、124、126-127、130-131、133-134、138-142、152、163、170-171、175、181、183-185、187、197、203、208、210-214、216和218(EU编号)。在一些实施例中，氨基酸取代是以下中的一项或多项：位置119被R取代；位置124被V取代；位置126被V取代；位置127被G取代；位置130被H或S取代；位置131被Q、T、N、R、V或D取代；位置133被D、T、L、E、S或P取代；位置134被A、H、I、P、V、N或L取代；位置138被R取代；位置139被A取代；位置140被I、V、D、Y、K、S、W、R、L或P取代；位置141被D、T、R、E、K、Q、V或M，优选地D、E或K取代；位置142被M取代；位置152被G取代；位置163被M取代；位置168被F、I或V取代；位置170被N、G、E、S或T，优选地E或G取代；位置171被N、E、G、S、A、D，优选地D、E、G或S取代；位置175被D或M，优选地M取代；位置181被V、L、A、K或T，优选地K或V取代；位置183被L或V取代；位置184被R取代；位置185被M、L、S、R或T，优选地R取代；位置187被R、D、E、Y或S取代；位置197被S取代；位置203被D取代；位置208被I取代；位置210被T取代；位置211被A取代；位置212被N取代；位置213被E取代；位置214被R取代；位置216被G取代；并且位置218被P、A、L、E、D、H、S、Q、N、T、I、M、G、C、K或W，优选地P或A取代。在一些实施例中，CH1结构域包括在残基141处的氨基酸取代以驱动与λ轻链的优先配对。在一些实施例中，在残基141处取代的氨基酸选自由以下组成的组：T、R、E、K、V、D和M。在特定实施例中，CH1结构域变体包括在位置141处的Asp或Glu。在一些实施例中，在位置141处的氨基酸取代可以与CH1内的一个或多个取代组合，例如在位置181处的Lys或在位置181处的Lys和在位置218处的Ala或Pro。在位置141处的Asp或Glu可以与在位置170、171、175、181、184、185和/或187处的一个或多个取代组合，如在位置170处的Glu或Gly、在位置171处的Asp、Glu、Gly或Ser、在位置175处的met、在位置181处的Val或Lys、在位置184处的Arg、在位置185处的Arg和/或在位置187处的Arg。λ偏好CH1结构域变体的非限制性实例可以包括SEQID NO:140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、155、157、159、162、163、164、165、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188或189的氨基酸序列。

在特定实施例中，CH1结构域变体包括141D、181K和218P的组合、141D、171E和185R的组合或141D、170E和187R的组合。在另外的实施例中，CH1结构域变体包括SEQ ID NO:188、186或143的氨基酸序列。

本公开还考虑包括CH1结构域变体的多肽，例如抗体。此类多肽可以是多特异性抗体，所述多特异性抗体包括含有第一CH1结构域变体的第一重链和含有第二CH1结构域变体的第二重链。第一重链和第二重链可以与不同的表位结合。在一些实施例中，抗体包括包含第一CH1结构域的第一重链。在一些实施例中，抗体进一步包括包含第二CH1结构域的第二重链，所述第二CH1结构域包括与第一重链CH1结构域不同的氨基酸序列。

在一些实施例中，第一CH1结构域变体可以优先与Cκ配对(或与之结合)，并且第二CH1结构域变体可以优先与Cλ结合。在此情况下，第一轻链包括Cκ结构域，并且第二轻链包括Cλ结构域。在一些实施例中，第一轻链是κ轻链(Cκ和Vκ)或嵌合轻链(Cκ和Vλ)，并且第二轻链是λ轻链(Cλ和Vλ)或嵌合轻链(Cλ和Vκ)。

在一些实施例中，第一CH1结构域变体可以优先与Cλ配对(与之结合)，并且第二CH1结构域可以优先与Cκ配对(与之结合)。在此情况下，第一轻链包括Cλ结构域，并且第二轻链包括Cκ结构域。在一些实施例中，第一轻链是λ轻链(Cλ和Vλ)或嵌合轻链(Cλ和Vκ)，并且第二轻链是κ轻链(Cκ和Vκ)或嵌合轻链(Cκ和Vλ)。

第一轻链和第二轻链可以包括(或可以不包括)驱动与CH1结构域的优先配对的氨基酸取代。在一些实施例中，轻链的CL结构域未被修饰以改变与重链的结合，例如CH1结构域。在一些实施例中，第一轻链含有野生型CL结构域，例如野生型Cκ结构域或野生型Cλ结构域。在一些实施例中，第二轻链含有野生型CL结构域，例如野生型Cκ结构域或野生型Cλ结构域。野生型κ轻链或Cκ结构域可以由IGKC编码。野生型λ轻链或Cλ结构域可以由IGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6或IGLC7编码。

在一些实施例中，抗体是多特异性抗体。在一些实施例中，抗体是双特异性抗体。此类多特异性和双特异性抗体可以包括含有CH1结构域的任何形式，如但不限于图24-29中描绘的结构。还参见例如表2处的Brinkmann和Kontermann,《MAbs》9(2):182-212(2017)，其通过引用整体并入本文。

多特异性抗体可以包括具有表3、4、7、9、12或13中列出的氨基酸序列的CH1结构域变体中的一个或多个。在一些实施例中，抗体包括含有第一CH1结构域变体的第一重链和第一轻链，所述第一重链和第一轻链形成第一同源对。第一CH1结构域变体可以包括根据EU编号的以下位置中的一个或多个位置处的氨基酸取代：118、119、124、126-134、136、138-143、145、147-154、163、168、170-172、175-176、181、183-185、187、190、191、197、201、203-206、208、210-214、216、218。此类第一CH1结构域变体优先与第一轻链结合。第一轻链的CL结构域可以或可以未被修饰成改变与第一重链的结合。

在一些实施例中，抗体进一步包括含有第二CH1结构域变体的第二重链和第二轻链，所述第二重链和第二轻链形成第二同源对。第二CH1结构域变体可以包括根据EU编号的以下位置中的一个或多个位置处的氨基酸取代：118、119、124、126-134、136、138-143、145、147-154、163、168、170-172、175-176、181、183-185、187、190、191、197、201、203-206、208、210-214、216、218。此类第二CH1结构域变体优先与第二轻链结合。第二轻链的CL结构域可以或可以未被修饰成改变与第二重链的结合。

在多特异性抗体或抗体片段的某些实施例中，抗体或抗体片段可以包括κ偏好CH1结构域变体和λ偏好CH1结构域变体。在一些情况下，κ偏好CH1结构域变体可以是如本文所公开的κ偏好CH1结构域变体，并且λ偏好CH1结构域可以是可以或可以不是本文所描述的λ偏好CH1结构域。在一些情况下，λ偏好CH1结构域变体可以是如本文所公开的λ偏好CH1结构域变体，并且κ偏好CH1结构域可以是可以或可以不是本文所描述的κ偏好CH1结构域。在某些情况下，κ偏好CH1结构域变体和λ偏好CH1结构域变体两者都是如本文所公开的变体。

本文所公开的CH1结构域变体中的任何一个可以用于为κCL结构域或λCL结构域提供配对偏好，并且CL结构域可以是野生型或非野生型。此外，在向抗体结构的其余部分，例如CH2、CH3、VH、VL或CL结构域引入或不引入进一步的氨基酸改变的情况下，本文所公开的CH1结构域变体中的任何一个可以用于在抗体或抗体片段结构中提供κ/λ配对偏好。例如，本文所公开的CH1结构域变体可以与可以进一步增强轻链配对偏好的VH取代一起使用(例如，VH:VL取代如Q39E/K:Q38K/E(Dillon等人,《MAbs》2017 9(2):213-230)；或Q39K+R62E:Q38D+D1R或Q39Y+Q105R:Q38R+K42D(Brinkmann等人,《MAbs》2017 9(2):182-212)。

在不希望影响本发明的范围的情况下，强调本文所提供的CH1结构域变体在野生型轻链(或包括野生型CL结构域的多肽)的上下文中提供κ/λ配对偏好，而不需要CH2、CH3或可变结构域中的另一个修饰，但此类非CH1修饰可以任选地与由本文发明人发现的新型CH1结构域变体组合使用。考虑到在产生抗体，特别是多特异性抗体方面的许多报告的失败，这尤其出乎意料，其中仅修饰CH1结构域提供了有意义的κ或λ偏好。

在一些实施例中，抗体是药物组合物的一部分。此类组合物可以含有包括本文所描述的CH1结构域变体的多个多肽，例如抗体。

本公开还考虑用于获得此类CH1结构域变体的方法。本文所描述的变体CH1结构域可以通过合理设计(计算机)或可以随机地，例如使用ePCR或本领域已知的其它诱突变技术来鉴定。在一个实施例中，采用合理的设计方法来设计变体CH1结构域。对于此类方法，可以组装和分析一组结构，例如实验衍生的蛋白质结构，例如Fab晶体结构，以鉴定涉及跨越CH1-CL结构域界面(也称为CH1-CL结构域界面位置)的接触的溶剂暴露位置。可以通过选择具有某些特性的结构，例如与参考(野生型)CH1、Cκ和Cλ的高百分比同一性来对所述组进行策划。在一些实施例中，如果一对侧链原子在

选择要改变的单独或组合(例如，单峰、双重峰、三重峰等)的氨基酸位置可能取决于各种不同的参数，例如，所述位置在形成不同结构中CH1与CL之间或CH1与VH之间的界面中的一致作用、整体结构中位置的可及性、位置与影响抗原结合的位置的关系或残基以变构方式影响CH1:CL或CH1:VH界面形成的可能性，而不直接参与跨所述界面的分子间接触。在一些实施例中，如果出现以下情况，则选择CH1结构域中的氨基酸残基进行变异：1)所述残基位于与Cκ集中至少10％的结构中的轻链恒定结构域的界面处，并且在Cκ集中至少90％的结构中的分数溶剂可及表面积(SASA)大于10％(参见实例1)或2)所述残基位于与Cλ集中至少10％的结构中的轻链恒定结构域的界面处，并且在Cλ集中至少90％的结构中的分数SASA大于10％或3)所述残基位于与C

此外，对于本文提供的以赋予κ或λ偏好CH1结构域中的特定氨基酸取代中的每一个，作为取代结果包含的氨基酸可以通过保守氨基酸取代来进一步取代以获得另一个提供等效κ或λ偏好CH1结构域变体。可替代地，对于每个CH1结构域变体，相对于野生型序列，在CH1结构域变体中未受影响的一个或多个氨基酸位置可以通过保守取代来改变，以获得另一个提供等效κ或λ偏好CH1结构域变体。

“保守氨基酸取代”是本领域已知的，并且包含氨基酸取代，其中具有某些物理和/或化学特性的一个氨基酸交换为具有相同或类似化学或物理特性的另一个氨基酸。例如，保守氨基酸取代可以是酸性/带负电的极性氨基酸取代另一种酸性/带负电的极性氨基酸(例如，Asp或Glu)、具有非极性侧链的氨基酸取代另一种具有非极性侧链的氨基酸(例如Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Val等)、碱性/带正电的极性氨基酸取代另一种碱性/带正电的极性氨基酸(例如，Lys、His、Arg等)、具有极性侧链的不带电的氨基酸取代另一种具有极性侧链的不带电的氨基酸(例如，Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr等)、具有β支链侧链的氨基酸取代另一种具有β支链侧链的氨基酸(例如，Ile、Thr和Val)、具有芳香族侧链的氨基酸取代另一种具有芳香族侧链的氨基酸(例如，His、Phe、Trp和Tyr)等。

接下来，可以生成其中CH1结构域残基变化的文库。一个或多个CH1结构域残基可以在文库中变化。在一些实施例中，约一到六个CH1结构域残基在文库中变化。各个残基位置处的氨基酸多样性可以通过简并密码子例如NNK生成，以允许在给定CH1结构域位置处表示至少全部20个天然存在的氨基酸。所选择的CH1结构域位置可以个别地变化以生成点取代(也称为单峰)，或者位置组合的子集可以组合变化，例如以生成双重取代和三重取代(也称为双重峰和三重峰)。在一些实施例中，生成变体组合，所述变体组合包含在3D空间中邻近的CH1结构域位置，例如位置147x[124、126、145、148、175和181]。

在一些实施例中，制备CH1结构域变体文库的方法包括：a)提供一组结构，所述一组结构含有一个或多个κ恒定(Cκ)结构域、一个或多个λ恒定(Cλ)结构域和一个或多个CH1结构域；b)选择取代与一个或多个Cκ结构域位置和/或一个或多个Cλ结构域位置接触的一个或多个溶剂暴露的CH1结构域位置；c)用除所述亲本氨基酸以外的任何氨基酸取代在步骤b)中鉴定的所述一个或多个CH1结构域位置；以及d)合成编码步骤c)的CH1变体结构域的多肽以组装CH1变体结构域文库。

在一些实施例中，一个或多个Cκ结构域、一个或多个Cλ结构域和一个或多个CH1结构域是野生型的。在一些实施例中，一个或多个Cκ结构域、一个或多个Cλ结构域和一个或多个CH1结构域是人的(包含所有等位基因功能变体)。在一些实施例中，步骤a)中的Cκ氨基酸序列由IGKC编码。在一些实施例中，步骤a)中的Cλ氨基酸序列由IGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6或IGLC7编码。在特定实施例中，步骤a)中的Cλ氨基酸序列由IGLC2编码。在一些实施例中，所得CH1结构域文库被设计成需要跨越CH1-CL界面或CH1-VH界面的相互作用。

在一些实施例中，选择用于取代的一个或多个CH1氨基酸残基(i)位于与CH1:Cκ结构的代表性集的至少10％中的轻链恒定结构域的界面处，并且在CH1:Cκ结构的代表性集的至少90％中的分数溶剂可及表面积大于10％；(ii)位于与CH1:Cλ结构的代表性集的至少10％中的轻链恒定结构域的界面处，并且在CH1:Cλ结构的代表性集的至少90％中的分数溶剂可及表面积大于10％；或(iii)位于与C

在一些实施例中，通过改变一个或多个在本文中公开为改变轻链同种异型偏好的CH1位置(例如，位置141、147、151、170、171、181、183、185、187或218或其任何组合)，以及任选地一个或多个另外的所关注的CH1位置来生成文库。在某些实施例中，可以通过将本文作为改变轻链同种异型偏好公开的一个或多个CH1位置(例如，位置141、147、151、170、171、181、183、185、187或218或其任何组合)处的预定取代与一个或多个另外的所关注的CH1位置组合来生成文库。在特定实例中，预定取代可以包括A141D、A141E、K147F、P151A、P151L、F170E、P171E、S181K、S183R、V185R、T187R或K218P或其任何组合。

在一些实施例中，筛选文库以鉴定显示与κ轻链或λ轻链优先结合的CH1结构域变体。此类筛选可以通过在合适的宿主细胞，例如真核细胞，例如酵母细胞，例如酿酒酵母细胞中表达文库开始。在将包含在宿主细胞的文库中的CH1变体结构域表达之后，可以例如通过FACS或MACS筛选变体文库以鉴定具有期望结合特性的那些变体。

在一些实施例中，鉴定具有优先Cκ或Cλ结构域结合的CH1结构域变体的方法包括：a)提供一组结构，所述一组结构含有一个或多个κ恒定(Cκ)结构域、一个或多个λ恒定(Cλ)结构域和一个或多个CH1结构域；b)选择取代与一个或多个Cκ结构域位置和/或一个或多个Cλ结构域位置接触的一个或多个溶剂暴露的CH1结构域位置；c)用除所述亲本氨基酸以外的任何氨基酸取代在步骤b)中鉴定的所述一个或多个CH1结构域位置；d)合成编码步骤c)的CH1变体结构域的多肽以组装CH1变体结构域文库；以及e)筛选d)的文库以鉴定具有优先Cκ或Cλ结构域结合的CH1结构域变体。

在一些实施例中，一个或多个Cκ结构域、一个或多个Cλ结构域和一个或多个CH1结构域是野生型的。在一些实施例中，一个或多个Cκ结构域、一个或多个Cλ结构域和一个或多个CH1结构域是人的(包含所有等位基因功能变体)。在一些实施例中，步骤a)中的Cκ氨基酸序列由IGKC编码。在一些实施例中，步骤a)中的Cλ氨基酸序列由IGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6或IGLC7编码。在特定实施例中，步骤a)中的Cλ氨基酸序列由IGLC2编码。在一些实施例中，所得CH1结构域文库被设计成需要跨越CH1-CL界面或CH1-VH界面的相互作用。

在一些实施例中，选择用于取代的一个或多个CH1氨基酸残基(i)位于与CH1:Cκ结构的代表性集的至少10％中的轻链恒定结构域的界面处，并且在CH1:Cκ结构的代表性集的至少90％中的分数溶剂可及表面积大于10％；(ii)位于与CH1:Cλ结构的代表性集的至少10％中的轻链恒定结构域的界面处，并且在CH1:Cλ结构的代表性集的至少90％中的分数溶剂可及表面积大于10％或(iii)位于与CH1:C

本文所描述的方法可以进一步包括验证一个或多个经取代的CH1氨基酸残基驱动重链相对于λCL结构域(或包括λCL结构域的轻链)对于κCL结构域(或包括κCL结构域的轻链)的优先配对，反之亦然。可以使用多种方法来评估优先轻链配对，包含但不限于荧光激活细胞分选(FACS)、LC-MS、αLISA和SDS-PAGE。在一些实施例中，在步骤c)中选择用于取代的一个或多个CH1结构域位置在具有预定频率的轻链的界面处发生，例如在任何给定的野生型抗体结构组中，所选的CH1结构域位置在至少10％的结构中接触CL结构域。在一些实施例中，在步骤c)中选择用于取代的一个或多个CH1结构域位置在任何给定的Cκ或Cλ集中至少约90％或更多的结构中具有大于约10％的分数溶剂可及表面积。在一些实施例中，在步骤c)中选择用于取代的一个或多个CH1结构域位置在具有预定频率的VH区的界面处发生，例如在任何给定的野生型抗体结构组中，所选的CH1结构域位置在至少10％的结构中接触VH。

通过采用本文所描述的用于鉴定CH1结构域变体的方法，选择以下CH1结构域位置用于取代：114、116、118、119、121-124、124--143、147-154、160、162-165、167、168、170-172、174、175、176、178、180、181、183-185、187、190、191、197、201、203-208、210-214、216和/或128(根据EU编号)。取代这些CH1结构域位置中的任何一个或组合可以导致CH1结构域对于特定CL结构域具有优先配对。因此，包括此类CH1结构域变体的重链和包括特定CL结构域的轻链更可能形成同源对，即重链与轻链之间存在优先配对，所述重链和轻链形成至少部分地由一个或多个CH1结构域取代驱动的同源对。

在一个实施例中，CH1结构域变体优先与Cκ配对，因此驱动含有Cκ结构域的轻链和含有CH1结构域变体的重链的优先配对。在另一个实施例中，CH1结构域变体优先与Cλ结构域配对，因此驱动含有Cλ结构域的轻链和含有CH1结构域变体的重链的优先配对。某些示例性CH1结构域取代被鉴定为促进与κ轻链的优先重链配对，例如147F和/或183R、183K或183Y，而其它CH1结构域取代被鉴定为促进与λ轻链的优先重链配对，例如141D、141E、141K、170E、170G、171E、171D、171G、171S、175M、181K、181B、184R、185R、187R、218A或218P。因此，包括此类CH1结构域变体的双特异性抗体可以在重链-轻链配对中生成改进的保真度。在一些实施例中，双特异性抗体含有包括CH1λ的第一重链(如141D、141E或141K以及170E、170G、171E、171D、171G、171S或175M和/或181K、181B、184R、185R、187R、218A和/或218P)和包括CH1κ的第二重链(如147F和/或183R、183K或183Y)，所述重链中的每一个优先与其同源轻链配对。在一些实施例中，双特异性抗体含有包括CH1κ的第一重链(如147F和/或183R、183K或183Y)和包括CH1λ的第二重链(如141D、141E或141K以及170E、170G、171E、171D、171G、171S或175M和/或181K、181B、184R、185R、187R、218A和/或218P)，例如“141D、171E和185R”或“141D、170E和187R”，所述重链中的每一个与其同源轻链优选配对。

通过采用本文所描述的方法获得的编码CH1变体结构域的多肽可以在宿主细胞，例如真核细胞中重组表达。在一些实施例中，CH1变体结构域在酵母中表达。在一些实施例中，酵母菌株是酿酒酵母。在一些实施例中，酵母菌株共表达一条或多条野生型κ轻链和一条或多条野生型λ轻链。

下文提供的实例旨在说明本发明。这些实例并非意在将本发明约束到任何具体应用或操作理论。

实例

实例1：用于文库中多样化的CH1结构域位置的计算机选择

从蛋白质数据库(PDB)组装一组Fab晶体结构，并且用于结构引导方法以鉴定用于多样化的CH1-CL界面残基。

通过选择与参考(野生型)CH1、Cκ和Cλ序列(如下所示)具有高百分比同一性的结构，来缩小一组初始2,367个Fab晶体结构。CH1比对的参考序列跨越适当的CH1(EU残基118-215)加上IgG1铰链的一部分(EU残基216-229)。Cκ和Cλ参考序列分别跨越EU残基编号108-214和107A-215。

CH1(加上上到中铰链)参考：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC(SEQ ID NO:1)。

Cκ参考：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:2)。

Cλ参考：

GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO:3)。

如果一对侧链原子在

单个重链和轻链残基的溶剂可及表面积(SASA)在“自由状态”下计算，即没有分别与轻链和重链配对。分数SASA定义为残基SASA与掺入与残基相同的氨基酸(即X)的模型分离的Gly-X-Gly三肽的比率。溶剂暴露的残基定义为分数SASA大于10％的那些残基。

通过高百分比同一性来缩小一组初始晶体结构导致鉴定一组183CH1:Cκ结构(“Cκ集”)和43CH1:Cλ结构(“Cλ集”)。在考虑由于结构中缺少氨基酸而导致的比对中的间隙之后，Cκ集中的所有条目与参考CH1和Cκ序列具有100％的同一性，而Cλ集中的条目与参考序列具有>99％的同一性。

下文示出了Cκ与Cλ之间的基于结构的序列比对。CH1与Cκ和Cλ形成稳定的界面，尽管后者结构域之间的序列同一性低。根据BLOSUM62评分，保守和半保守取代分别使用“|”和“:”来描绘。结构域之间的序列同一性为38.3％(在107个Cκ残基上的41个同一性)。

Cκ:-RTVAAP

AAPSV|FPPS:E|L:::A::VCL|::FYP:V WK:D:::::|::

Cλ:GQPKAAPSV

Cκ:EQ

:::S::Y:SS L:L::|::H|Y:C|VTH|G S|V K:EC

Cλ:

加下划线的氨基酸表示与CH1结构域接触的Cκ和Cλ残基。此确定是基于对Cκ和Cλ集中的Fab结构的一致意见。存在25个Cκ界面残基和26个Cλ界面残基。构建2×2基质，所述基质聚焦于在Cκ或Cλ(N＝28)的界面处的位置，并且取决于(1)给定位置处的残基是否接触CH1，以及(2)所述位置处的氨基酸在Cκ与Cλ之间是否相同(参见表1)。

表1.CH1:CL界面处的Cκ和Cλ氨基酸位置

表1突出了结构上保守的一组14个Cκ和Cλ位置，即相同EU残基编号，但具有不同氨基酸同一性，所述位置接触CH1结构域。表2列出了14个氨基酸位置(EU编号)，并且示出了κ和λ轻链中存在的氨基酸。可以利用Cκ和Cλ界面残基同一性的此类差异来生成突变CH1结构域，所述突变CH1结构域仅与Cκ或Cλ特异性结合，但不与两者结合。

表2.具有用于Cκ和Cλ的非相同氨基酸残基的结构上保守的CH1接触位置

作为选择文库变异的初始阈值，单个CH1结构域位置需要满足以下标准：1)所述位置位于与Cκ集的结构的至少10％中的轻链恒定结构域的界面处，并且在所述位置处的残基在Cκ集的结构的至少90％中的分数SASA大于10％；或2)所述位置位于与Cλ集的结构的至少10％中的轻链恒定结构域的界面处，并且在所述位置处的残基在Cλ集的结构的至少90％中的分数SASA大于10％；或3)所述位置位于CH1:Cκ集(Cκ集)或CH1:Cλ集(Cλ集)的结构的至少10％中的VH区的界面处，并且在所述位置处的残基在Cκ和/或Cλ集的结构的至少90％中的分数SASA大于10％。界面定义考虑了CH1残基与任何CL结构域残基的接触，即包含但不限于表2中列出的一组十四个CL结构域残基或CH1残基与任何VH残基的接触。

基于此阈值标准，鉴定了一组三十个CH1氨基酸位置以用于潜在包含(在不考虑Cys220之后)。从这个较大的组中，选择一组25个CH1位置以在文库中变化。通过表示所有20个天然氨基酸的简并NNK密码子生成每个位置处的氨基酸多样性(Stemmer等人,《美国国家科学院院刊》1994年10月25日；91(22):10747-51)。在25个CH1位置中的每一个处单独进行氨基酸取代，并且选择性地组合单个取代的子集，例如以生成双重突变体和三重突变体。最终文库设计由表示25个单峰的89个CH1寡核苷酸(单个CH1位置处的NNK密码子多样化)、48个双重峰突变体(两个CH1位置处的NNK密码子多样化)和16个三重峰突变体(三个CH1位置处的NNK密码子多样化)组成。

实例2：共表达Cκ和Cλ轻链的酵母中CH1结构域变体文库

在共表达野生型人IgG Cκ和Cλ轻链的工程化酵母菌株中(以不同的表达水平，以允许随后选择Cλ偏好的CH1取代和Cκ偏好的CH1取代)构建和表达人CH1结构域变体的文库。

构建了双向表达质粒(pAD7064和pAD4800)，所述质粒中的每个质粒都含有两侧是野生型人IgG轻链κ和λ恒定结构域的酿酒酵母Gal1/Gal10启动子区，以及酿酒酵母URA3基因(选择标记)。质粒pAD7064和pAD4800相对于Gal1/10启动子区在κ和λ恒定结构域的朝向上不同。将独特的限制性酶位点(PME-I和SFI-I)放置在每个质粒中的κ和λ恒定结构域的上游。pAD7064和pAD4800分别用PME-I和SFI-I消化，然后与PCR扩增的DNA插入物(ADI-26140轻链区；Gal1/10启动子区；以及具有5'和3'端的通过同源重组引导组装到质粒的差异编码(“简并”)ADI-26140轻链可变区(IDT gblock))一起转化到工程化酵母菌株中。将转化的酵母接种到缺乏URA3+的固体琼脂平板上，在30℃下生长48小时，然后拾取克隆并且萃取和纯化DNA。在测序后，鉴定了两个双轻链DNA构建体：(1)Gal10::ADI-26140-VL-CκGal1::ADI-26140-VL-Cλ(在显性启动子控制下的人Cλ，允许随后选择Cκ偏好的CH1取代)；以及(2)Gal10::ADI-26140-VL-CλGal1::ADI-26140-VL-Cκ(在显性启动子控制下的人Cκ，允许随后选择Cλ偏好的CH1取代)。ADI-26140是抗鸡蛋溶菌酶(HEL)IgG。

对于重链表达，构建DNA载体(pAD4466)，所述DNA载体含有Gal1启动子、SFI-I限制位点、人IgG重链(IgG1(N297A))的CH2-CH3结构域和TRP1(可选择标志物)。

并行地，生成两个独立的CH1结构域变体DNA片段池，用于插入pAD4466中。使用如实例1中所描述的计算机设计方法生成第一池。通过容易出错的PCR(ePCR)生成第二池。简言之，在PCR反应中分别以(a)1:100和1:100或(b)1:100和1:10的稀释度包含诱突变核苷酸类似物dPTP(0.01mM)和8-oxo-DGTP(0.01mM)。

将pAD4466用SFI-I消化，并且引入表达Cκ和Cλ的酵母菌株中，连同编码ADI-26140HC可变区的PCR扩增DNA和来自合理设计工作或ePCR的CH1结构域变体DNA。每个DNA片段在5'和3'端处都具有适当的DNA序列，以指导与消化质粒或PCR片段(ADI-26140重链可变区或CH1蛋白结构域)的组装(通过同源重组)。

通过天然酿酒酵母同源重组方法进行单个文库的组装。将每个文库的转化细胞的稀释物平板接种在缺乏尿嘧啶和色氨酸的培养基上，以对每个文库的成员数量进行定量。每个库的编号大于10

实例3：影响轻链结合的CH1结构域位置的鉴定

如先前所描述的产生文库(参见例如WO2009036379；WO2010105256；WO2012009568；Xu等人,《蛋白质工程、设计和选择(Protein Eng Des Sel.)》2013年10月；26(10):663-70)。简言之，在IgG的诱导和呈递后，将酵母细胞(约10^7-10^8个)在4℃下用PBSF中的1:100稀释的山羊抗人F(ab')2κ-FITC(阿拉巴马州伯明翰的南方生物技术公司(Southern Biotech,Birmingham,Alabama)，目录号2062-02)和1:100稀释的山羊抗人F(ab')

在96孔板中培养表示独特序列的单个克隆。在IgG的诱导和呈递后，将约2×10

以下CH1结构域位置(EU编号)被鉴定为影响轻链结合偏好，即对于κCL结构域(或含有κCL结构域的轻链)或λCL结构域(或含有λCL结构域的轻链)的优先结合：118、119、124、126-134、136、139-141、143、145、147-154、163、168、170-172、175-176、181、183、185、187、190、191、197、201、203-206、208、210-214、216和218。表3提供了从优先κ轻链的选择中鉴定的CH1序列的列表。序列柱中的加粗氨基酸残基指示取代位置，即不同于亲本(SEQ ID NO:1)的氨基酸取代。表4提供了从优先λ轻链的选择中鉴定的CH1序列的列表。序列柱中的加粗氨基酸残基指示取代位置。

表3.优先结合Cκ的CH1结构域序列

表4.优先结合Cλ的CH1结构域序列

Δ表示氨基酸缺失。

出人意料地发现，定位于VH:CH1界面而不是CH1:轻链界面处的一些CH1氨基酸取代在三链系统中产生κ结合偏好。具体地，突变组K147V+P151A和P151L+N201S(SEQ ID NO:36和70，表3)返回分别为18.1和10.4的κFOP值。虽然位置CH1:147位于CH1:LC界面处，但CH1:201不在(其完全溶剂暴露，并且不是任何结构域间界面的一部分)；因此，在这些高FOP克隆中P151取代的出现表明此位置在确定κ对于λ偏好方面的潜在作用。不希望受理论束缚，出于下文讨论的原因，此类远端突变被认为影响HC:LC配对，因此可能利用VH:CH1界面处的突变来用于优选的κ对于λ配对。

首先，P151是VH与CH1结构域之间所谓的“球窝接头”的一部分(Lesk A.M.等人,《自然》1988 Sep 8；335(6186):188-90；Landolfi N.F.等人,《免疫学杂志》2001年2月1日；166(3):1748-54)。已假设此接头通过其对抗体可变结构域和恒定结构域之间的“肘角”的影响来调节结构域内灵活性(Stanfield R.L.等人,《分子生物学期刊(J Mol Biol.)》2006年4月14日；357(5):1566-74)。球窝接头中的取代可以具有功能性结果，如由于此区中的单个氨基酸取代而具有还原中和活性的抗IFN-γ单克隆抗体的情况(Landolfi N.F.等人,《免疫学杂志》2001年2月1日；166(3):1748-54)。这种效应归因于改变的柔性和变构机制，而不是抗原结合界面处的直接变化。其次，还已知具有λ恒定结构域的Fab相对于具有κ结构域的Fab具有更大范围的肘角(Stanfield R.L.等人,《分子生物学期刊》2006年4月14日；357(5):1566-74.doi:10.1016/J.jmb.2006.01.023.2006年1月25日电子出版)。这种超柔性归因于在VL与CL结构域之间的所谓的转换区中的单个残基插入。第三，对Fab晶体结构的进一步分析(Adimab未公开的数据)揭示了球窝接头区中的原子包装的κ与λFab之间的差异。因此，球窝接头对Fab柔性的调节，连同具有κ和λ轻链的Fab之间的固有差异，表明了通过VH:CH1界面处的突变推导差异κ与λ偏好的新机制。

实例4：具有κ优先或λ优先轻链配对的CH1结构域变体的鉴定和表征

基于κ与λ之间的MFI比率，选择从增加的Cκ和Cλ偏好的选择得到的克隆用于进一步表征(参见图4)。分离并扩增在每个所关注位置(141、147或183)处突变到20个氨基酸(NNK)中的每一个的DNA池。使用适当的轻链碱性菌株，以如先前所描述的方式构建这些单个位置靶向文库。在CH1结构域的位置141、147、183或147+183处存在变异的情况下构建四个文库。如上文所描述进行κ或λ偏好的选择。如先前所描述对输出进行测序，并且进行基于FACS的κ或λ偏好相对于适当亲本的定量，以确定提供轻链κ或λ优先配对的氨基酸取代。

在位置141、147和183中的每一个处具有氨基酸残基取代的若干CH1结构域变体被鉴定为对κCL结构域(或含有κCL结构域的轻链)或λCL结构域(或含有λCL结构域的轻链)具有配对偏好。在CH1结构域位置141处，用D、R或Q(与野生型A相比)的取代增加了与λCL结构域(或含有λCL结构域的轻链)的优先配对(即，降低的κ:λMFI比率)(参见图5)。在CH1结构域位置147处，用F、I、T、Y、L、R、N、E、H、M或Q(与野生型K相比)的取代增加了与κCL结构域(或包括κCL结构域的轻链)的优先配对(即，增加的κ:λMFI比率)(参见图5)。CH1结构域位置183处取代为R、K、Y、W、E、F或Q(与野生型S相比)的取代增加了与κCL结构域(或含有κCL结构域的轻链)的优先配对(即，增加的κ:λMFI比率)(参见图5)。表5示出了具有驱动配对偏好的特定氨基酸取代的观察到的CH1结构域变体的数量。

表5.在具有轻链偏好的CH1结构域变体中观察到的氨基酸取代

接下来，评估鉴定的CH1结构域变体对呈IgG样形式(在N端连接到二聚体Fc分子的2个Fab区)的对照标准双特异性抗体(2条重链×2条轻链)的影响。使用源自两种批准的临床治疗性抗体：乌司奴单抗和帕尼单抗的VH-CH1序列。引入‘杵’(S354C；T366W)和‘臼’(Y349C；T366S；L368A；Y407V)突变以促进重链的期望异源二聚体配对。在通过标准方案转染到HEK293细胞之前，通过桑格测序(Sanger sequencing)确认DNA质粒。

将转染的HEK细胞在CD optiCHO培养基中(英杰公司(Invitrogen))培养，并且在转染后第6天，收集上清液并且经受基于蛋白A的亲和力纯化。用

对纯化的Fab进行LCMS，以确认每种IgG组分(2条重链×2条轻链)的序列，并且测定每种组分的相对百分比(参见图7)。简言之，用GingisKHAN消化纯化的IgG，以酶促方式从Fc部分裂解Fab区。将Fab样品注入到保持在65℃下的聚有应用生物系统(AppliedBiosystems)

当两条重链都是野生型时，错误的配对在约30％的时间发生；然而，当重链包括如本文所描述的CH1变体结构域时，重链和轻链的正确配对存在显著改进(参见图7和表6)。Pani轻链是野生型的。Uste轻链是λ融合。HC1是pani；LC1是paniκ；HC2是uste；LC2是usteλ。例如，当第一重链(HC1)含有K147F和S183R/K/Y并且第二重链含有A141D(分别为BsAbs 10、12和14)时，错配至少减轻了一半，即仅在6.8、10.5或11％的时间发生。实际上，在位置141处的单个取代(141D)导致50％的错配减少，即，6.1％相对于3.1％HC1-LC2和22.8％相对于9.9％HC2-LC1(BsAb2)。基于此，申请人提供了表7中具有κ或λ轻链/CL结构域偏好的示例性CH1结构域序列。

表6.重链-轻链产物形成百分比

表7.具有κ或λ链偏好的CH1结构域

通过尺寸排阻色谱法(SEC)评估纯化的抗体的表达和质量。简言之，使用安捷伦1100HPLC监测柱色谱(TSKgel Super SW3000柱)。用高糖基化和聚集的IgG对柱进行预处理，以便将抗体-柱相互作用的可能性最小化，并且在使用前用洗涤缓冲液(200mM磷酸钠，250mM氯化钠pH 6.8)平衡。将大约2-5μg蛋白质样品注入到柱上，并且将流速调整到0.400毫升/分钟。在波长280nm处监测蛋白质迁移。总测定时间大约为11分钟。使用ChemStation软件分析数据。SEC图谱确认与野生型相比，CH1结构域取代对变体图谱没有影响(数据未示出)。

测量与人IL-12B(Uste)和人EGFR(Pani)结合的纯化的双特异性抗体的结合亲和力和动力学，以确认CH1变体结构域不影响靶结合(参见图6A-6E)。使用具有100nM抗原的

实例5：141×181×218文库构建和选择

还鉴定了提供与λCL结构域优先配对的另外的CH1氨基酸取代。基于先前选择数据以及结构分析，选择一组三个CH1位置(141、181和218)进行另外的变异。位置141处的氨基酸多样性通过表示六个天然存在的氨基酸(D、T、A、E、K和N)的简并密码子RMW生成。位置181和218处的氨基酸多样性通过表示所有20个天然存在的氨基酸的简并密码子NNK生成。文库设计包含具有2,400的多样性的这三个位置处的氨基酸的所有可能组合。使用轻链菌株与GAL10启动子(GAL1::ADI-26140VL-Ck x GAL10::ADI-26140VL–Cl)下的λ轻链，此文库以如先前所描述的方式构建。通过用抗人κ-FITC和抗人λ-PE抗体染色来进行λ偏好选择，随后进行多轮细胞分选，如先前所描述的。如先前所描述的对输出(96个克隆)进行测序，并且对基于FACS的λ偏好相对于亲本菌株的定量进行定量。野生型(“WT”)和先前鉴定的前导克隆A141D包含在分析中。基于这些数据，鉴定了在轻链λ优先配相对于亲本方面提供最大改进的氨基酸组合和A141D。

图8示出如由FOP值确定的，大部分输出克隆在与λ链配对中具有较高偏好。表8提供了CH1结构域取代和图8中标记的前13个克隆的λ:κMFI比率的FOP值。

表8.来自输出克隆的前13个FOP值

分析表明，与在位置181处取代为K的取代配对的在位置141处取代为D、K或E的取代以及在位置218处取代为L、E、D、P、A、H、S、Q、N、T、I、M、G、C或W的取代在输出克隆中频繁出现，并且相对于A141D，增加λ轻链偏好(λ:κMFI比率增加)。图9示出了在具有位置141处的D、位置181处的K和CH1的位置218处的各种氨基酸的克隆中测量的单个和平均FOP值。将前导CH1序列克隆回到LC染色中(此过程随后在所有测定中采用)并且通过计算一式三份的FOP值来确认克隆和λ偏好(图10)。

另外的分析生成了用于哺乳动物IgG产生的9个唯一的候选CH1序列(参见表9)。

表9.具有κ或λ链偏好的CH1结构域

通过标准方法将9个候选CH1序列连同WT(即，“ASK”)和A141D(即，“DSK”)克隆到哺乳动物表达载体中。为了确定λ偏好，将表示期望重链、λ轻链和κ轻链的质粒以2:1:1质粒比率转染到HEK293细胞中。培养转染的HEK细胞，并且使用先前所描述的方案纯化IgG。不希望受理论束缚，表达大约相等量的总重链和轻链多肽(HC:κLC:λLC＝“2:1:1”此处导致总HC:总LC＝1:1)(即，无过量HC和无过量LC)似乎允许发明人避免各种偏差，导致CH1结构域变体的真正κ或λ偏好的可视化。

对哺乳动物产生的IgG进行基于FACS的λ偏好的定量。图11提供了FACS图并且图12和表10提供了9个CH1变体以及WT和A141D(即“DSK”)的FOP值(λ:κMFI)。图13示出，当CH1在位置141处具有D时，在位置181或位置181和218处的另外取代进一步改进了λ偏好(基于λ:κMFI比率)。

表10. 9个CH1变体的FOP值

另外，使用还原全长IgG的LCMS数据来确定纯化的IgG样品中的λ轻链和κ轻链的相对量。图14比较了与κ轻链(LC)配对的物种％和与λ轻链配对的物种％。

这些数据的分析产生了三个CH1序列(SEQ ID NO:143、142和141，分别具有DKP、DKA和DKK取代)，相对于亲本和先前鉴定的前导序列A141D，λ偏好得到改进。

为了确定这些CH1序列是否与κ轻链配对，将候选CH1重链质粒用1.)κ轻链或2.)λ轻链转染到HE293细胞中。作为具有κ偏好的CH1的K147F S183R、WT、A141D也作为对照包含在内。培养转染的HEK细胞并且通过标准方法纯化。使用先前描述的方法由纯化的IgG生成连接的重链Fab和轻链Fab。使用标准方法测定过程产率，并且相对于WT过程产率归一化以计算“FOP”过程产率。基于过程产率FOP，当仅存在κLC(但不是λLC)时，A141D、A141D S181K、A141D S181K K218A和A141D S181K K218P全部仍然与κLC结合，但与κLC相比，在λLC发生更多的结合(图15)。使用BioRad CFX96RT PCR，通过差示扫描荧光法测量κ-和λ-Fab的Fab Tm(图16)。对于每个CH1变体，计算λ配对的Fab在Tm中的相对增益(“相对λTm增益”或“净λTm增益”)，如所定义的：[λ配对的变体Fab相对于λ配对的WT Fab的Tm变化(“ΔλTm”)]-[κ配对的变体Fab相对于κ配对的WT Fab的Tm变化(“ΔκTm”)](图17)。如图17所示，在S181或S181和K218处，相对λTm增益随着另外的取代而增加。不希望受理论束缚，基于图16和17，κLC配对的不稳定似乎有助于相对λTm增益和与λCL配对的增加。

实例6：141×ALL文库构建和选择

当与位置141处的取代配对时，构建另外的文库以对CH1中的另外的残基进行采样，以驱动λ优先结合。六个新文库(LAD11522-LAD11527)被设计成跨CH1的三个区(DOR1、DOR2和DOR3)中具有最多三个取代(表11)。六个文库一起表示每个可能的取代集合，所述集合包含与位置141配对的三个所关注结构域内的两个取代。在所有文库中，通过简并密码子RMW生成位置141处的氨基酸多样性，并且通过简并密码子NNK生成其它两个变异位置处的氨基酸多样性。使用先前所描述的方法构建文库。如先前所描述进行λ偏好的选择。

表11.文库设计和构建

从第二轮FACS选择之后开始，分离选择输出CH1多样性并且重新克隆到适当的双链轻链菌株中，以恢复文库中减少的κ轻链表达。使用具有适当引物和标准DNA纯化的PCR扩增来分离CH1多样性。然后用ADI-26140重链可变区电穿孔此DNA片段池，并且将质粒消化到适当的双链轻链菌株中。

如先前所描述(图18)对输出进行测序，并且定量基于FACS的λ偏好相对于亲本菌株的定量。分析中包含先前鉴定的前导克隆A141D S181K K218P。基于这些数据，确定了轻链λ优先配对相对于亲本方面具有最大改进的氨基酸组合。

含有28个独特CH1序列的前46个克隆(表12)在酵母中表达为IgG。将新CH1序列连同WT、A141D(或“DSK”)和来自实例5中的141×181×218系列(DKP、DKA、KKE、KKP和EKK)的前导序列中的一些与通过流式细胞术测定的FOP值进行比较(λMFI:κMFI)(图19)。对应于图19中用箭头标记的数据点，具有CH1序列SEQ ID NO:155、157、159、162、163、164或165的至少七个示出等于或高于测试的141×181×218前导序列的值的FOP值。

表12.来自141×ALL序列的具有λ偏好的28个独特的CH1序列

实例7：141×(170/171)×(185/187)系列的构建体和筛选

对实例6中的结果的分析产生了四个新的所关注位置/残基，包含F170、P171、V185和T187。基于在位置170、171、185和187以及在先前研究中产生高FOP值的141处经常观察到的氨基酸(例如，在位置141处频繁的E和D；141×ALL输出中在位置170或171处频繁的E；和当位置141被取代且独立地被位置171取代时，在位置185和/或187处频繁的R)，每个CH1结构域具有最多三个氨基酸取代的14个独特CH1结构域变体(表13)被合理地设计为前导λ优先取代组的候选者。表13中的14个前导序列包含“A141E”；V185R；T187R"(SEQ ID NO:163)和“A141E；P171E；V185R(SEQ ID NO:159)”，其在实例6中测试。

表13.来自141×(170/171)×(185×187)系列的新CH1序列

如上文所描述的，将含有14个CH1结构域变体序列之一的重链克隆到哺乳动物(HEK)细胞中，所述哺乳动物细胞共表达κ和λ轻链(重链(HC):λ轻链(LC):κLC的比率＝2:1:1，即HC:LC的比率总是1:1)。野生型(ADI-26140重链)、“A141D”变体和“A141D_S181K_K218P”变体也作为对照包含在内。使用如上文所描述的相同测定来确定λ偏好。

通过流式细胞术评估λMFI与κMFI比率。表14和图20-22中提供了14个前导序列的FOP值和单独的FACS图(每个图中的编号是表14中所示的排序#)。在14个前导序列中，“A141D_P171E_V185R”和“A141D_F170E_T187R”示出比实例5中鉴定的前导序列“A141D_S181K_K218P”甚至更高的FOP值。14个前导序列中的许多其它变体也示出与“A141D”相比更高的FOP值，并且所有14个前导序列都示出与野生型相比更高的FOP值。

表14.14个CH1变体前导序列和对照的FOP值(基于FOP值的排序)

使用LCMS定量每个样品的κ和λLC的量(表15和图23)。与基于FACS的λ偏好评估的结果类似，“A141D_P171E_V185R”和“A141D_F170E_T187R”示出与实例6中鉴定的前导序列“A141D_S181K_K218P”相比甚至更高的λ链％和甚至更低的κ链％。14个前导序列中的许多其它变体还示出与“A141D”相比更高的λ％和更低的κ％，并且所有14个前导序列都示出与野生型相比更高的λ％和更低的κ％。

表15.通过LCMS测量的λLC％和κLC％(具有表14中的FOP值)

为了确定前两个λ偏好CH1变体(“A141D_P171E_V185R”和“A141D_F170E_T187R”)是否与κ轻链配对，将CH1变体重链质粒用1.)κ轻链或2.)λ轻链(重链:轻链的比率＝1:1)转染到HEK293细胞中。作为具有κ偏好的CH1的K147F S183R、WT也作为对照包含在内。培养转染的HEK细胞，并且使用蛋白质A柱通过标准方法纯化IgG。使用标准方法测定过程产率(mg/L)，并且相对于WT过程产率归一化。基于归一化的过程产率，当仅存在κLC(但不是λLC)时，“A141D_P171E_V185R”和“A141D_F170E_T187R”仍然与κLC结合，但与κLC相比，在λLC发生更多的结合(图30)。

还评价了Fab形式的过程产率。使用相同方法产生和纯化具有CH1变体重链的IgG。作为具有κ偏好的CH1的K147F S183R、WT、A141D和A141D S181K K218P也作为对照包含在内。使用标准方法，经由木瓜蛋白酶酶消化和CH1柱纯化由纯化的IgG生成连接的重链Fab和轻链Fab。归一化的Fab消化物计算为相对于每条轻链的亲本回收率％归一化的从IgG消化物中回收的Fab的回收率％(回收的Fab的量/消化物中的IgG的量)。使用标准方法测定过程产率，并且相对于WT过程产率归一化。与图15的数据一致，“A141D”和“A141D S181K K218P”的λLC高于κLC的过程产率，并且“K147F S183R”示出极高的κ偏好(图31)。当仅存在κCH1(但不是λCH1)时，“A141D_P171E_V185R”和“A141D_F170E_T187R”仍与κCH1结合，但λLC获得的产率明显高于κLC获得的产率(图31)。将“P171E_V185R”或“F170E_T187R”添加到“A141D”突变进一步增强了“A141D”的λ偏好。

实例8：“A141D”和“K147F S183R”变体的结构分析

帕尼鲁单抗野生型CH1-Cλ的结晶和结构测定

将6.5mg/ml的帕尼单抗野生型CH1-恒定λ(Cλ)Fab蛋白在4℃下以14,000×g离心5分钟。将305nL蛋白质与150nL储集器液滴和50nL种子溶液混合，并且在MRC 3孔板中在20℃下用40ul储集器溶液平衡。从BCS筛选(分子尺寸)中鉴定的晶种用于微晶种基质筛选(MMS)(D'Arcy,A.、Villard,F.和Marsh,M.(2007)“一种用于蛋白质结晶的自动微晶种基质筛选方法(An automated microseed matrix-screening method for proteincrystallization)”《晶体学学报D区—生物晶体学(Acta Crystallogr D BiolCrystallogr)》63,550-554.)结晶实验，以获得在0.1M磷酸盐/柠檬酸盐pH 5.5和36％(v/v)PEG Smear Low中生长并且转移到0.1M磷酸盐/柠檬酸盐pH 5.5、38％PEG Smear Low和4％甘油，然后在液氮中快速冷冻中的晶体。在配备有Eiger2 XE16M检测器(德科特思公司(DECTRIS))的英格兰迪德科特钻石光源站I03处在100K下收集到

帕尼单抗A141D CH1-Cλ、野生型CH1-Cκ和K147F-S183R CH1-Cκ的结晶和结构测定

帕尼单抗A141D CH1-Cλ、帕尼单抗野生型CH1-恒定κ(Cκ)和帕尼单抗K147F-S183RCH1-CκFab在4℃下以14,000×g离心5分钟。对于帕尼单抗A141D CH1-Cλ和K147F-S183RCH1-Cκ，将200nL 10.0mg/ml Fab与150nL储集器滴液混合，并且将50nL种子溶液与40ul储集器溶液平衡。在MMS实验中使用从BCS筛选鉴定的种子晶体，以发现最佳结晶条件。将0.1M磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液pH 5.5和36％(v/v)PEG Smear Low用于帕尼单抗A141D CH1-Cλ和0.1M乙酸钠pH 4.5，其中30％v/v PEG Smear Low用于帕尼单抗K147F-S183R CH1-Cκ。将150nL的19.2mg/ml野生型CH1-Cκ与150nL储集器液滴混合，并且添加到40ul储集器溶液中，并且使用PACT套件(分子尺寸)进行筛选。最终结晶条件由具有20％w/v PEG 6000的0.1MMES pH 6.0和0.2M氯化钙二水合物组成。将晶体转移到由以下组成的低温溶液中：0.1M磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液pH 5.5、38％PEG Smear Low、4％甘油；0.07M MES、pH 6.0、21％PEG6000、0.2M CaCl2、23,5％甘油；以及分别针对帕尼单抗A141D CH1-Cλ、野生型CH1-Cκ和K147F-S183R CH1-Cκ的0.1M NaAc pH 4.5、32.5％PEG Smear Low、25％甘油。所有晶体在液氮中快速冷冻，并且在配备有Eiger2 XE 16M检测器(德科特思公司)的英格兰迪德科特钻石光源站I03处在100K下收集到

使用野生型CH1-Cλ的晶体结构作为搜索模型，通过分子置换解析帕尼单抗A141D-CH1-Cλ结构。在Refmac5中进行了几轮各向异性B因子和简单的约束细化(Murshudov,G.N.、Skubak,P.、Lebedev,A.A.、Pannu,N.S.、Steiner,R.A.、Nicholls,R.A.、Winn,M.D.、Long,F.和Vagin,A.A.(2011)用于细化大分子晶体结构的REFMAC5,《晶体学学报D区—生物晶体学》67,355-367.)，其中在最后几轮细化中应用了模糊因子。A141D CH1-Cλ的位置占有率是基于野生型CH1-Cλ的占有率分配的，并且在迭代细化期间在Coot中手动调整(Emsley P.、Lohkamp,B.、Scott,W.G.And和Cowtan K.(2010)“Coot的特征和发展”《晶体学学报D区—生物晶体学》66,486-501.)。在每个ASU有2个分子的P12

帕尼单抗野生型CH1-Cκ和K147F-S183R-CH1-Cκ结构通过用以下进行的分子置换来解析：Phaser(McCoy,A.J.、Grosse-Kunstleve,R.W.、Adams,P.D.、Winn,M.D.、Storoni,L.C.和Read,R.J.(2007).Phaser晶体学软件(Phaser crystallographic software.)《应用晶体学杂志》,40(4),658-674.)，使用分别与EGFR(PDB编码5SX4)和已解析的野生型CH1-Cκ结构复合的帕尼单抗Fab片段的坐标，然后使用Coot进行迭代的手动模型构建(EmsleyP.、Lohkamp,B.、Scott,W.G.和Cowtan K.(2010)“Coot的特征和发展”《晶体学学报D区—生物晶体学》66,486-501.)以及Refmac5中的自动细化(Murshudov,G.N.、Skubak,P.、Lebedev,A.A.、Pannu,N.S.、Steiner,R.A.、Nicholls,R.A.、Winn,M.D.、Long,F.和Vagin,A.A.(2011)用于细化大分子晶体结构的REFMAC5,《晶体学学报D区—生物晶体学》67,355-367.)。对于野生型CH1-Cκ结构观察到平移非晶体学对称性，因此所述结构在ASU中在具有6个Fab分子的较低空间群(P12

由HC-A141D介导的λLC偏好

不希望受理论束缚，帕尼单抗A141D CH1-Cλ的增强λ偏好可能由HC-Asp141的侧链羧基与λLC-Thr116的侧链羟基之间形成的链间氢键介导(图36C)，其在帕尼单抗野生型CH1-Cλ中不能与HC-Ala141形成(图36A)。HC-Ala141周围的κLC区由疏水残基Phe116、Phe118和Leu135组成，而κLC-Phe116被λLC中的极性残基Thr116置换(图36B)。因此，通过A141D突变引入电荷可以通过破坏CH1-κLC界面疏水性而降低κ偏好，同时通过与λLC-Thr116的氢键化来稳定CH1-λLC配对。另外，不希望受理论束缚，κ偏好可以通过HC-Asp141与κLC-Phe116的空间位阻进一步减少，如通过帕尼单抗A141D CH1-Cλ和野生型CH1-κLC的比对所示(图36D)。

在HC-Asp141与λLC-Thr116之间的氢键中，在Asp141的侧链中的氢受体原子(O)与Thr116的侧链的氢供体原子(H)之间形成所述键。因此，在侧链中具有氢受体原子的另一个氨基酸也可以与λLC的Thr116形成氢键，提供λ偏好。基于谷氨酸的侧链也具有氢受体原子(O)并且谷氨酸在大小和形状上与天冬氨酸类似这一事实，谷氨酸可能与λLC的Thr116形成氢键，同时引起如图36D所示的与κLC的空间位阻，整体提供λ偏好。实际上，A141E取代提供了如以上实例中所展示的强λ偏好，证实了申请人的结构分析。

由HC-K147F-S183R介导的κLC偏好

观察到的帕尼单抗K147F-S183R CH1-Cκ的κ偏好可以通过CH1和Cκ界面处的两个新氢键介导。在帕尼单抗野生型CH1-Cκ结构中，由HC-Lys147和HC-Asp148协调的氢键网络隔离HC-Gln175，有助于基线κ配对偏好(图37A)。一种解释是，在此位置用苯丙氨酸取代CH1HC-Lys147破坏了此网络并且释放HC-Gln175侧链，所述HC-Gln175侧链通过与κLC-Gln160的甲酰胺氧的氢键合来与κLC相互作用，因此增加了κ偏好(图37B)。另外，不希望受理论束缚，HC-S183R取代导致HC-Arg183侧链的胍基与κLC-Thr178的羟基之间的另外氢键(图37B、图38C)。相反，不希望受理论束缚，在帕尼单抗野生型CH1-Cλ的HC-Ser183与λLC-Tyr178之间在HC 183位置处观察到的氢键合在K147F-S183R CH1和λLC的模拟配对中，通过HC-Arg183和λLC-Tyr178侧链的严重空间位阻消除，使有利于κLC的λ配对不稳定(图38B和38D)。

在HC-Arg183与κLC-Thr178之间的氢键中，在Arg183的侧链中的氢供体原子(H)与Thr178的侧链的氢受体原子(O)之间形成所述键。因此，在侧链中具有氢供体原子的另一个氨基酸也可以与κLC的Thr178形成氢键，提供κ偏好。如Arg的侧链等较大侧链可以帮助生成与λLC的Tyr178的空间位阻，从而提供另外的κ偏好。例如，赖氨酸和色氨酸两者的侧链具有含有氢供体原子(H)的大侧链。因此，裂解酶和色氨酸可能与κLC的Thr178形成氢键，并且可能经历如图38D所示的与λLC的空间位阻，整体提供κ偏好。苏氨酸的侧链也可以通过-OH的H原子充当氢供体。因此，申请人进一步设想，具有可以充当氢受体的相对大的侧链的氨基酸也可以与κLC的Thr178形成氢键，以提供κ偏好。例如，当置于HC的残基183处时，具有相对大的侧链(具有氢受体原子)的谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸或酪氨酸也可以提供κ偏好。事实上，残基183处的这些新提出的氨基酸取代中的大多数实际上在实例3中被鉴定为κ偏好(参见表3)。

如上所述，用Phe取代Lys147破坏了Lys147和Gln175之间的氢键，从而释放Gln175，用于与κLC的Gln160形成氢键，并且因此有助于κ偏好。因此，将Lys147用侧链不含氢供体或受体原子的另一个氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸，取代也可能有助于κ偏好。事实上，残基147处的这些新提出的氨基酸取代中的大多数实际上在实例3中被鉴定为κ偏好(参见表3)。

序列表

<110> 阿迪马布有限责任公司

<120> 被工程化用于优先轻链配对的CH1结构域变体和包括所述CH1结构域变体的多特异性抗体

<130> 1160430.002413

<150> 62/908,367

<151> 2019-09-30

<160> 189

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

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Lys Val Glu Pro Lys

100

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

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20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 122

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SAD9612_P01_D03

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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys

100

<210> 123

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<400> 123

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 124

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SAD9612_P01_H03

<400> 124

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Val Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

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<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<400> 125

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

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<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> S 4

AD9612_P01_A02

<400> 126

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1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Val Ser Thr Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<400> 127

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1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

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50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

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85 90 95

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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1 5 10 15

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20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SAD10791_P01_C07

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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Lys Asp Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Asp Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

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<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ser Asp Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

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35 40 45

Gly Val His Thr Phe Ser Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

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85 90 95

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100

<210> 132

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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1 5 10 15

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20 25 30

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

35 40 45

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50 55 60

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

65 70 75 80

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85 90 95

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100

<210> 133

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SAD10791_P02_F07

<400> 133

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Leu Asp Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 134

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<400> 134

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1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ile Asp Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 135

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> A140V; A141D

<400> 135

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Val Asp Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 136

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<400> 136

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Tyr Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 137

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<400> 137

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Phe Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Arg Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 138

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<400> 138

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Phe Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 139

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> K147F S183Y

<400> 139

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Phe Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Tyr Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 140

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> A141D

<400> 140

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Asp Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 141

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> A141D; S181K

<400> 141

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Asp Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Lys

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 142

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> A141D; S181K; K218A

<400> 142

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Asp Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Lys

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Ala

100

<210> 143

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> A141D; S181K; K218P

<400> 143

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Asp Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Lys

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Pro

100

<210> 144

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> A141E

<400> 144

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Glu Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 145

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> A141E; S181K

<400> 145

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Glu Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Lys

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 146

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> A141K

<400> 146

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Lys Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 147

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> A141K; S181K

<400> 147

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Lys Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Lys

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 148

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> A141K; S181K; K218E

<400> 148

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Lys Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Lys

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Glu

100

<210> 149

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> A141K; S181K; K218P

<400> 149

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Lys Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Lys

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Pro

100

<210> 150

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> P127G; G138R; A141T; F170G; S176R; S181L

<400> 150

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Gly Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Arg Thr Ala Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Gly Pro Ala Val Leu Gln Arg Ser Gly Leu Tyr Leu

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 151

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> S131R; A141E; S181K

<400> 151

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Arg Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Glu Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Lys

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 152

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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1 5 10 15

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20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Asp Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Val

50 55 60

Leu Ser Ser Arg Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Asp Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

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35 40 45

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65 70 75 80

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85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Glu Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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35 40 45

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65 70 75 80

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<210> 164

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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20 25 30

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35 40 45

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65 70 75 80

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100

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<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

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<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Glu Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 167

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<400> 167

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Glu Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Ser Ala Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Val

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 168

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<400> 168

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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Glu Met Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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100

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 170

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> A141K; S181K; K218D

<400> 170

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Lys Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

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35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Lys

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Asp

100

<210> 171

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<400> 171

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Val Ala Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Val

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

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85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 172

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<400> 172

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

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Ser Thr Ser Arg Gly Thr Ala Glu Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Glu Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Val

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 173

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> F126R; S131V; T139V; A141E; K218E

<400> 173

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Arg Pro Leu Ala Pro Val Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Val Ala Glu Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Glu

100

<210> 174

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<400> 174

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Val Pro Leu Ala Pro Val Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Pro Gly Gly Thr Ala Asp Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

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85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 175

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> F126V; S131V; S136P; G137R; A141D

<400> 175

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Val Pro Leu Ala Pro Val Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Pro Arg Gly Thr Ala Asp Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 176

<211> 102

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> F126V; S131V; A141D; K218S

<400> 176

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Val Pro Leu Ala Pro Val Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Asp Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Ser Ser

100

<210> 177

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> F126V; S131V; K133S; A141K; K218A

<400> 177

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Val Pro Leu Ala Pro Val Ser Ser

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Lys Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Ala

100

<210> 178

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> A141E; V185R

<400> 178

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Glu Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Arg Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 179

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> A141E; T187R

<400> 179

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Glu Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Arg Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 180

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<400> 180

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

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