一种区别检测半胱氨酸和同型半胱氨酸/谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法和应用

摘要

本发明公开一种区别检测半胱氨酸和同型半胱氨酸/谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法和应用，属于荧光探针技术领域。探针的分子式为C17H19N3O4S2，结构式如下：本发明荧光探针可以利用荧光光谱仪检测水环境中的半胱氨酸/同型半胱氨酸/谷胱甘肽，并且可以通过肉眼直接观察到探针颜色和荧光的变化；同时可以利用共聚焦荧光显微镜检测离体活细胞环境中的半胱氨酸/同型半胱氨酸/谷胱甘肽，并进行荧光成像。本发明探针合成简单，并且产率较高，实现了水溶液中区别检测半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽以及离体活细胞水平半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽的成像。

说明书

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种区别检测半胱氨酸和同型半胱氨酸/谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

生物硫醇包括半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽等，它们在生物的生理和病理过程中发挥着重要的作用。半胱氨酸是谷胱甘肽、乙酰辅酶和牛磺酸的前体，同时它也是生物体硫铁络合物中硫配体的提供者。当人体中的半胱氨酸水平异常时会引起生长缓慢、水肿、肝功能损伤、身体虚弱等症状。同型半胱氨酸在血浆中的总浓度又与某些先天性疾病和老年认知障碍有关，人体中同型半胱氨酸浓度过高有可能引起心血管疾病和阿尔茨海默氏病；谷胱甘肽是细胞内最多的非蛋白生物硫醇，在维持细胞生理功能中起着重要作用，包括细胞内的氧化还原反应、异物代谢、细胞内的信号传导等。因此，生物环境中硫醇的检测始终吸引着科学家们极大的兴趣。

当前检测小分子生物硫醇的方法有：毛细管电泳、质谱、高效液相色谱。然而，这些方法通常需要大量样品或昂贵的仪器并且不能应用于活细胞中。因此，方便廉价、能够定性定量分析生物硫醇，并且可以对生物样品进行实时检测的方法非常重要。在众多检测生物硫醇的方法中，因为荧光探针的非侵入性、活细胞成像、高灵敏度和选择性、高时空分辨率而得到广泛的应用。然而半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽结构和反应上的相似性，这也对区别检测它们带来了难度。因此，设计一个能区别检测半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽的荧光探针显得尤为重要。

发明内容

本发明通过分子设计，合成出了一种能区别检测半胱氨酸和同型半胱氨酸/谷胱甘肽的增强型荧光探针，简称探针2，并进一步提供了探针2的制备方法和应用。

一种区别检测半胱氨酸和同型半胱氨酸/谷胱甘肽的荧光探针，探针的分子式为C

一种区别检测半胱氨酸和同型半胱氨酸/谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)252mg取4-氯-7-绿磺酰-2，1，3-苯并二唑和73mg二乙胺溶解在二氯甲烷中，室温下反应过夜；反应完全后，用硅胶色谱柱进行纯化，得到化合物1；

(2)取100mg化合物1和48mg 4-甲氧基苯硫酚溶解在乙腈中，加入两滴三乙胺，室温下反应一个小时；反应完全后，用硅胶色谱柱进行纯化，得到终产品探针。

探针合成路线如下：

一种区别检测半胱氨酸和同型半胱氨酸/谷胱甘肽的荧光探针的应用，所述探针利用荧光光谱仪检测水环境中的半胱氨酸或者同型半胱氨酸或者谷胱甘肽；所述探针利用共聚焦荧光显微镜检测离体活细胞环境中的半胱氨酸或者同型半胱氨酸或者谷胱甘肽，以获取中间信息。

有益效果

本发明的优点：(1)探针合成简单，并且产率较高；(2)本发明实现了水溶液中区别检测半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽；(3)本发明实现了离体活细胞水平半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽的成像。

附图说明

图1为本发明实施例1中化合物1的

图2为本发明实施例1中化合物1的

图3为本发明实施例1中探针2的

图4为本发明实施例1中探针2的

图5为本发明实施例1中探针2的质谱图；

图6为本发明实施例2中探针2随不同量半胱氨酸的加入荧光谱图的变化情况图；其中:(A)从下至上，半胱氨酸浓度依次为0、10、30、50、70、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500μmol/L；(B)探针2与半胱氨酸在440nm激发，588nm处荧光强度的线性方程；

图7为本发明实施例2中探针2随不同量同型半胱氨酸的加入荧光谱图的变化情况图；其中:(A)从下至上，同型半胱氨酸浓度依次为0、10、30、50、70、100、150、200、250、300、400、500、600、800、1000、1200、1500μmol/L；(B)探针2与同型半胱氨酸在395nm激发，521nm处荧光强度的线性方程；

图8为本发明实施例2中探针2随不同量谷胱甘肽的加入荧光谱图的变化情况图；其中:(A)从下至上谷胱甘肽浓度依次为0、10、30、50、70、100、150、200、300、400、500、600、700、800、1000、1200μmol/L；(B)探针2与谷胱甘肽在395nm激发，521nm处荧光强度的线性方程；

图9为本发明实施例3中探针2与半胱氨酸在588nm以及与同型半胱氨酸/谷胱甘肽在521nm处随时间变化的荧光强度变化图；

图10为本发明实施例4中探针2对不同干扰分析物的选择性和干扰分析物对待测物的竞争性柱状荧光数据图；其中(A)探针2对干扰分析物选择性及干扰分析物对半胱氨酸的竞争性柱状荧光数据图(B)探针2对干扰分析物选择性及干扰分析物对同型半胱氨酸的竞争性柱状荧光数据图；

图11为本发明实施例5中探针2在不同pH下与半胱氨酸在588nm处的荧光强度图以及与同型半胱氨酸/谷胱甘肽在521nm处的荧光强度图；

图12为本发明实施例6中探针2与HeLa细胞存活率实验结果图；

图13为本发明实施例7中探针2与HeLa细胞中半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽响应的荧光成像图；其中：(A1-A4)是加入5μmol/L探针2孵育20分钟后的荧光成像，(B1-B4)是加100μmol/L的N-乙基马来酰亚胺(NEM)处理30分钟,再用5μmol/L的探针2孵育20分钟后的荧光成像；(C1-C4)是再加500μmol/L的半胱氨酸孵育60分钟后的荧光成像；(D1-D4)是再加500μmol/L的同型半胱氨酸孵育60分钟后的荧光成像；(E1-E4)是再加500μmol/L的谷胱甘肽孵育60分钟后的荧光成像；激发波长为488nm和543nm，标尺为20微米。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不限于此。

实施例1

化合物1的合成：

取4-氯-7-绿磺酰-2，1，3-苯并二唑(252mg，1mmol)和二乙胺(73mg，1mmol)溶解在二氯甲烷中，室温下反应过夜。反应完全后，以二氯甲烷/石油醚(1/1，v/v)为洗涤剂，用硅胶色谱柱进行纯化，得到白色固体，即化合物1(182mg，收率63.4％)。

探针2的合成：

取化合物1(100mg，0.35mmol)和4-甲氧基苯硫酚(48mg，0.35mmol)溶解在乙腈中，加入两滴三乙胺，室温下反应一个小时。反应完全后，以二氯甲烷/石油醚(1/1，v/v)为洗涤剂，用硅胶色谱柱进行纯化，得到黄色固体，即探针2(80mg，收率59.2％)

合成路线如下：

实施例2

探针2与不同当量半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽反应的荧光光谱变化

取实施例1制备的探针2溶于DMSO中，制成浓度为1mmol/L探针母液；分别将半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽配制成浓度为10mmol/L的母液。从探针母液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，加入720μLDMSO，再加入PBS水溶液(浓度25mmol/L，pH7.4)，最后再分别加入不同当量(0-150eq)的半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽母液，PBS溶液和生物硫醇溶液补充至3mL，配置成探针浓度为10μmol/L，含25％DMSO的测试溶液。用荧光光谱仪测试探针分别与不同当量半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽反应液的荧光光谱变化(半胱氨酸的激发波长在440nm,同型半胱氨酸和谷胱甘肽的激发波长在395nm)，荧光光谱变化情况如图6所示。由图6A,6B可见，随着半胱氨酸加入当量的逐渐增加，探针2溶液在588nm处的荧光峰值逐渐增强。且探针荧光强度和半胱氨酸浓度在10-400μmol/L具有良好的线性关系，当荧光强度达到最大值时，比探针空白液的荧光强度增强201倍。如图7A,7B所示，随着同型半胱氨酸加入当量的逐渐增加，探针2溶液在521nm处的荧光峰值逐渐增强,且探针荧光强度和同型半胱氨酸浓度在50-500μmol/L具有良好的线性关系，当荧光强度达到最大值时，比探针空白液的荧光强度增强32倍。如图8A,8B所示，随着谷胱甘肽加入当量的逐渐增加，探针2溶液在521nm处的荧光峰值逐渐增强，且探针荧光强度和谷胱甘肽浓度在30-200μmol/L具有良好的线性关系，当荧光强度达到最大值时，比探针空白液的荧光强度增强31倍。

实施例3

探针2与半胱氨酸/同型半胱氨酸/谷胱甘肽随时间变化的荧光变化

从实施例2荧光探针母液中取出30μL加入到5mL离心管当中，加入720μLDMSO，之后再加入1950μL的PBS水溶液(浓度25mmol/L，pH7.4)，最后加入300μL浓度为10mmol/L的半胱氨酸/同型半胱氨酸/谷胱甘肽母液，配制成探针浓度为10μmol/L，半胱氨酸/同型半胱氨酸/谷胱甘肽浓度为1mmol/L，含25％DMSO的测试溶液。分别用440nm的激发波长激发半胱氨酸和395nm的激发波长激发同型半胱氨酸和谷胱甘肽，测试其随时间变化的荧光光谱。由图9可见，随着时间增加，588nm和521nm处的荧光强度逐渐变大，半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽分别在150、100、100分钟左右达到最大荧光强度。

实施例4

探针2对不同干扰分析物的选择性和竞争性研究

从实施例2荧光探针母液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，再加入720μLDMSO和1800μL的PBS水溶液(浓度25mmol/L，pH7.4)，最后分别加入450μL浓度为10mmol/L的分析物：AcO

实施例5

探针2与半胱氨酸/同型半胱氨酸/谷胱甘肽在不同pH下的荧光变化

从实施例2荧光探针母液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，加入720μLDMSO，分别补充1950μL的不同pH的PBS水溶液(浓度25mmol/L，pH为4、5、6、7、7.4、8、9、10)，最后再分别加入300μL浓度为10mmol/L的半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽母液，配制成探针浓度为10μmol/L，半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽浓度为1mmol/L，含25％DMSO的测试溶液。分别用440nm的激发波长激发半胱氨酸和395nm的激发波长激发同型半胱氨酸和谷胱甘肽，测试其随pH变化的荧光光谱。由图11可见，在pH4-6时探针2的荧光强度很弱，随着pH的增加，588nm和521nm处的荧光强度逐渐变大，并且在pH为8左右达到平台值。

实施例6

探针2的细胞存活率实验

取对数生长期的细胞以5-10×10

细胞相对存活率(％)＝(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100％。实验重复6次，数据表示为mean±SD。

如图12所示，当探针2的浓度达到20μM时，细胞的存活率依旧很高，由此表明探针2对细胞的毒性不高。

实施例7

探针2与细胞中半胱氨酸/同型半胱氨酸/谷胱甘肽的荧光成像

从实施例2荧光探针母液中取出5μL加入到育有HeLa细胞的培养皿(含1mLPBS培养基)中，探针浓度为5μmol/L，孵育20分钟，作为空白组；在其中一组用100μmol/L的N-乙基马来酰亚胺(NEM)处理30分钟，再用5μmol/L的探针孵育20min，作为对照组。另取三组事先用100μmol/L的N-乙基马来酰亚胺处理30min，用PBS洗涤3次后，再用5μmol/L的探针孵育20min，之后分别加入半胱氨酸(Cys)500μmol/L、谷胱甘肽(GSH)500μmol/L、同型半胱氨酸(Hcy)500μmol/L孵育60min。随后分别用共聚焦显微镜对空白组、对照组和实验组进行荧光成像，分别使用激发波长为543nm的光源激发，收集红色通道的荧光，和488nm的激发光源激发，收集绿色通道的荧光。结果如图13所示。在空白组的荧光成像中，有较弱的荧光出现；在对照组中，观察不到明显的荧光；而在实验组中，分别观察到明显的红色和绿色荧光。实验结果说明探针2可以通过共聚焦显微镜检测细胞环境中的半胱氨酸、谷胱甘肽和同型半胱氨酸，具有潜在的实际应用价值。

需要说明的是，上述实施例仅仅是实现本发明的优选方式的部分实施例，而非全部实施例。显然，基于本发明的上述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例，都应当属于本发明保护的范围。