从人多能干细胞制备间充质干细胞的方法及由此制备的间充质干细胞

摘要

本发明涉及一种从人多能干细胞制备间充质干细胞的方法，更具体地说，涉及一种制备间充质干细胞的方法，其中在无异种和无血清的环境中制备从一定大小的拟胚体分化的间充质干细胞，由此所述间充质干细胞表现出更高的安全性并长期保持其自身特性。根据本发明的从人多能干细胞制备间充质干细胞的方法采用无滋养细胞、无异种、无血清的培养环境，以解决外来动物源性材料的污染问题，并允许制备高度安全的间充质干细胞。此外，该方法利用球状拟胚体形成形状和大小均匀的成熟拟胚体，从而提高了对间充质干细胞的分化效率，并且即使在长期传代培养(例如20次或更多次传代)后仍表现出稳定保持间充质干细胞特性的优异效果，通过该传代可大量制备人多能干细胞来源的间充质干细胞。因此，本发明有利于将安全性和效率极佳的细胞治疗剂商业化。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从人多能干细胞制备间充质干细胞(MSC)的方法，更具体地，涉及一种制备间充质干细胞的方法，其中所述间充质干细胞表现出更高的安全性并长期保持其自身特性，甚至在利用无异种(xeno-free)和无血清的环境多次传代培养制备间充质干细胞和球形拟胚体以形成形状和大小均匀的成熟拟胚体时也是如此。

背景技术

干细胞是可以分化成构成生物组织的各种细胞的细胞，统称可以从胚胎、胎儿和成人的各个组织中获得的处于预分化阶段的未分化细胞。干细胞通过分化刺激(环境)分化成特定的细胞，通过细胞分裂可以复制(自我更新)与自身相同的细胞，因此具有增殖(扩张)的特性，这与分化完成和细胞分裂终止的细胞不同，并且其特征在于具有分化可塑性，因为干细胞可以在不同环境下或其他分化刺激下分化成不同的细胞。

干细胞根据其分化能力可分为多能干细胞(pluripotent)、专能干细胞(multipotent)和单能干细胞。多能干细胞是具有分化成所有细胞的潜能的多能细胞，胚胎干细胞(ESC)、经诱导的多能干细胞(iPSC)等对应于多能干细胞。成体干细胞可以作为多能和/或单能干细胞的示例。

胚胎干细胞是由胚泡(是胚胎发育的早期阶段)的内部细胞团形成的，具有分化成所有细胞的潜能，因此可以分化成任何组织细胞。胚胎干细胞是永生的，它们可以在未分化状态下培养，并且它们具有可传递给下一代的性状，因为它们可以制备与成体干细胞不同的生殖细胞(Thomson et al,Science,282:1145-1147,1998；Reubinoff et al,NatBiotechnol,18:399-404,2000)。

人类胚胎干细胞是通过在人类胚胎形成过程中仅分离和培养内部细胞团来制备的，目前，世界范围内制备的人类胚胎干细胞是从体外受精治疗后留下的冷冻胚胎获得的。尽管已经进行了各种尝试以使用可以分化成所有细胞的多能人类胚胎干细胞作为细胞治疗剂，但癌症的风险和免疫排斥的高屏障仍未得到完全控制。

同时，经诱导的多能干细胞(iPSCs)，包括在多能干细胞的概念中，是已经完全分化的成体细胞以各种方式去分化并恢复到多能干细胞状态(即分化的初始期)的细胞。迄今为止，据报道，去分化细胞在基因表达和分化能力方面表现出与胚胎干细胞(是多能干细胞)几乎相同的特征。然而，即使是iPSC，免疫排斥的风险可以用自体细胞排除，但癌症的风险仍然是一个有待解决的问题。

作为克服这个问题的替代方案，已经提出了没有癌症风险以及具有免疫调节功能的间充质干细胞。据报道，间充质干细胞是能够分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞和心肌细胞的多能细胞，并且还具有调节免疫应答的功能。尽管间充质干细胞可以从各种组织中分离和培养，但要明确定义间充质干细胞并不容易，因为每种来源的能力和细胞表面标志物略有不同。然而，当干细胞可以分化成骨细胞、软骨细胞和肌细胞，呈纺锤形，并表达CD73(+)、CD105(+)、CD34(-)和CD45(-)等基本细胞表面标志物时，这些干细胞通常被定义为间充质干细胞。

此外，为了将间充质干细胞用作细胞治疗剂，应满足再生医学和/或细胞疗法领域所需的最低细胞数(约1X10

作为这些成体来源的间充质干细胞的替代方案，已经提出了一种诱导人多能干细胞分化为间充质干细胞的方法。然而，迄今为止已知的方法是昂贵的，并且具有缺点，例如由特定细胞因子(例如，BMP)诱导的过程，这需要控制具有异种病原体风险的异种滋养细胞的浓度或诱导，又例如使用胎牛血清(FBS)。相关技术中诱导人多能干细胞向间充质干细胞分化的方法(WO 2011052818)存在通过使用滋养细胞而引入外来细胞的可能性，因为人多能干细胞是在异种滋养细胞上培养的，这可能是人类多能干细胞培养过程中的异种病原体问题。此外，由于担心在多能干细胞培养过程中使用牛血清或胎牛血清等动物源性血清引起人畜共患感染，因此有必要改进一种无异种和无血清的培养方法，使得在未来开发细胞治疗剂时不使用外来动物血清。

因此，本申请发明人为了解决与干细胞安全性和干细胞大规模生产有关的问题，以便将从人多能干细胞分化得到的间充质干细胞作为细胞治疗剂商品化，进行了深入研究，结果确认了，细胞安全性通过无异种和无血清环境而最大化，球形拟胚体可用于形成形状和大小均匀的成熟拟胚体，并且由其诱导分化的间充质干细胞甚至在重复传代培养后仍长时间保持间充质干细胞的特性，由此完成本发明。

发明内容

技术问题

本发明的一个目的是，提供一种通过制备间充质干细胞来制备来源于人类多能干细胞的间充质干细胞作为细胞治疗剂的方法，其中由外来细胞和外来动物来源的材料的污染引起的安全性问题得到解决，并且即使在重复传代培养后，间充质干细胞的特性也得以长期保持。

本发明的另一个目的是，提供由该方法制得的间充质干细胞和使用其的细胞治疗剂。

技术方案

为实现上述目的，本发明提供了一种由人多能干细胞制备维持长期传代培养稳定性的间充质干细胞的方法，该方法包括：

(a)在不含异种滋养细胞的无血清多能干细胞培养基中培养人多能干细胞以获得人多能干细胞集落并从集落中分离人多能干细胞；

(b)通过将分离的多能干细胞悬浮在拟胚体形成培养基中，形成单个的球状拟胚体，然后对分离的多能干细胞进行培养以使多能干细胞聚集；

(c)通过将拟胚体悬浮培养在拟胚体成熟培养基中，形成成熟拟胚体；

(d)通过将拟胚体贴壁培养在无异种和无血清的间充质干细胞培养基中，诱导分化为间充质干细胞；和

(e)使分化的间充质干细胞在无异种和无血清的间充质干细胞培养基中增殖和培养，同时保持间充质干细胞的特性。

本发明还提供由该方法制得的从人多能干细胞分化和诱导的间充质干细胞、以及包括所述间充质干细胞的细胞治疗剂。

附图说明

图1是现有多能干细胞来源间充质干细胞制备法(WO 2011052818)和本发明多能干细胞来源间充质干细胞的改进制备法的示意图。

图2显示了通过在不含异种饲养细胞的无血清多能干细胞培养基中培养人多能干细胞、并将它们均匀破碎成200μm×200μm大小而获得的人多能干细胞集落的照片(图2A)以及从中分离的细胞形态(图2B)。

图3显示了对多能性标志物OCT-4和SSEA-4进行免疫荧光染色以分析在无滋养细胞、无异种和无血清的培养环境中培养的多能干细胞的特性的结果。

图4的照片显示了现有制备方法(WO 2011052818)制备的拟胚体和本发明改进方法制备的拟胚体的大小和形态。

图5的照片显示了现有制备方法(WO 2011052818)制备的拟胚体和本发明改进方法制备的拟胚体分化为间充质干细胞的效率和细胞形态。

图6示出了在无滋养细胞、无异种和无血清的培养环境中培养的多能干细胞来源间充质干细胞的细胞表面标志物表达的分析结果。

图7示出了在无滋养细胞、无异种和无血清的培养环境中培养的多能干细胞来源的间充质干细胞的分化能力的分析结果。

图8示出了在无滋养细胞、无异种和无血清的培养环境中培养的多能干细胞来源的间充质干细胞的G-带核型的分析结果。

图9比较了现有的多能干细胞来源的间充质干细胞的制备方法(WO2011052818)制得的多能干细胞来源的间充质干细胞与本发明的多能干细胞来源的间充质干细胞的改进制备法制得的多能干细胞来源的间充质干细胞的第7代和第12代的细胞形态。

图10证实了现有多能干细胞来源的间充质干细胞制备法(WO 2011052818)和本发明的多能干细胞来源的间充质干细胞的改进制备法得到的多能干细胞来源的间充质干细胞分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的能力。

图11是制备间充质干细胞的方法的示意图，所述间充质干细胞来源于(A)西方胚胎干细胞和(B)亚洲经诱导的多能干细胞，它们通过在无滋养细胞、无异种和无血清的培养环境中形成成熟拟胚体而培养得到。

图12分析了(A)西方胚胎干细胞和(B)亚洲经诱导的多能干细胞的多能性，这些细胞在无滋养细胞、无异种和无血清的培养环境中培养得到。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。一般而言，本文使用的命名法是本领域众所周知的和常用的。

本文中，术语“干细胞”是指主细胞，其能够以非限制性方式再生以形成组织和器官的特化细胞。干细胞是可以发育的多能细胞或专能细胞。干细胞可以分裂成两个子代干细胞，或一个子代干细胞和一个衍生(“转运”)细胞，然后增殖成为成熟完整组织形式中的细胞。这样的干细胞可以通过各种方法分类。最常用的方法之一是根据干细胞的分化能力，干细胞可分为，能分化成三个胚层的多能干细胞、仅限于分化成特定胚层或高级胚层的专能干细胞、以及只能分化成特定胚层的单能干细胞。

本文中，术语“多能干细胞”是指具有能够分化成构成活体的所有三个胚层的多能性的干细胞，通常，胚胎干细胞(ESC)和经诱导的多能干细胞(iPSC)与其对应。成体干细胞可分为专能或单能干细胞。

本文中，术语“间充质干细胞”是指具有能够分化成细胞例如脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞和心肌细胞的专能性的干细胞。

本文中，术语“分化”是指细胞的结构或功能在细胞分裂、增殖和生长期间特化的现象。多能间充质干细胞分化为有限谱系的祖细胞(例如，中胚层细胞)，然后可以进一步分化为其他形式的祖细胞(例如，成骨细胞等)，然后可以分化为在特定组织(例如骨等)中发挥特征性作用的终末分化细胞(例如，脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等)。

本文中，术语“拟胚体(EB)”是指为了诱导多能干细胞分化而生成的多能干细胞聚集体。在本发明中，“成熟拟胚体”是多能干细胞聚集体，即处于拟胚体通过悬浮培养反复分裂并变大的状态的拟胚体，本发明中的成熟拟胚体是用作诱导分化成间充质干细胞的材料。

本文中，术语“细胞治疗剂”是指通过使用从人分离、培养和特定操作(美国FDA规定)制备的细胞或组织用于治疗、诊断和预防目的的药物，具体而言，是指通过体外增殖，分选活体自体、同种异体和异种细胞，或通过以恢复细胞或组织的功能为目的的其他方法改变细胞的生物学特性等一系列操作，而用于治疗、诊断和预防目的的药物。细胞治疗剂根据细胞分化程度大致分为体细胞治疗剂和干细胞治疗剂，本发明特别涉及干细胞治疗剂。

在本发明中，为了解决与细胞安全性和大规模生产有关的问题，以便将人多能干细胞诱导分化成的间充质干细胞作为细胞治疗剂商业化，在无滋养细胞、无异种和无血清的环境中将人多能干细胞诱导分化成为间充质干细胞。此外，允许通过人类多能干细胞的细胞间聚集形成单个球状拟胚体，通过对这种拟胚体进行悬浮培养以形成形状和大小均匀的成熟拟胚体，使成熟拟胚体之间的质量差异最小化，由此改进分化为间充质干细胞的效率和一致性。如此制备的间充质干细胞显示出优异的效果：间充质干细胞的特性即使在反复长期传代培养20代或更多代后也能稳定保持。即，本发明提供了安全、且不受外来细胞和外来动物材料污染的人多能干细胞来源的间充质干细胞，使用球状拟胚体形成形状和大小均匀的成熟拟胚体，具有均匀的质量，并且可以大量生产，因为长期传代培养的稳定性极佳。因此，由本发明方法制备的具有增强的产能和安全性的间充质干细胞使得持续供应再生医学和细胞治疗领域所需的大量间充质干细胞成为可能。

因此，一方面，本发明涉及一种从人多能干细胞制备间充质干细胞的方法，该方法包括：

(a)在不含异种滋养细胞的无血清多能干细胞培养基中培养人多能干细胞以获得人多能干细胞集落、并从集落中分离人多能干细胞；

(b)通过将分离的多能干细胞悬浮在拟胚体形成培养基中，形成单个球状拟胚体，然后培养分离的多能干细胞以使多能干细胞聚集；

(c)通过在拟胚体成熟培养基中悬浮培养拟胚体，形成成熟拟胚体；

(d)通过在无异种和无血清的间充质干细胞培养基中贴壁培养拟胚体来诱导分化为间充质干细胞；和

(e)在无异种和无血清的间充质干细胞培养基中增殖和培养已分化的间充质干细胞，同时保持间充质干细胞的特性。

在下文中，将详细描述该方法的每个步骤。

(a)在不含异种滋养细胞的无血清多能干细胞培养基中培养人多能干细胞以获得人多能干细胞集落、并从集落中分离人多能干细胞

在本发明中，人多能干细胞可以是胚胎干细胞或经诱导的多能干细胞。人多能干细胞处于未分化状态。

通常，在相关技术中，在培养人多能干细胞时需要支持物来维持未分化状态，并且作为相关技术中的人多能干细胞支持物，已优先使用鼠胚胎来源的成纤维细胞。然而，由于人们认识到不同物种之间各种病原体的流入是尝试在临床上使用多能干细胞时的一个问题，因此对于各种人源细胞作为支持物的潜力已经被报道作为该问题的替代方案。但是不可能克服这些缺陷，因为还是不可能完全排除异源病原体，外来因子(例如bFGF、IGF、活化素(ACTIVIN)等)是维持未分化状态所必需，也不可能持续提供人源细胞用于长期培养，等等。

然而，在本发明的方法中，即使在没有异种滋养细胞的情况下使用包被有玻连蛋白的培养容器，并且在无血清培养基中培养人多能干细胞，也可以维持未分化状态。

在本发明中，步骤(a)中的多能干细胞优选是培养在包被有人源性细胞外基质(一种不含动物源性成分的细胞外基质)或能替代所述细胞外基质的合成材料的培养容器中的细胞，但不限于此。

人源细胞外基质优选玻连蛋白、胶原蛋白、或层粘连蛋白，不含除人以外的动物来源成分的细胞外基质优选不含动物成分的Matrigel，能替代所述细胞外基质的合成材料优选硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，但不限于此。

即，本发明方法的特征可以在于，其所有步骤都在不含异种滋养细胞、细胞因子和异种材料的培养基中进行。即，本发明方法的特征可以在于，其在无滋养细胞、无异种和无血清的环境中进行。

特别地，在本领域的方法(WO 2011052818)中，多能干细胞用培养在含FBS的培养基中的异种滋养细胞来培养，但是本发明的特征可以是，使用培养在不含异种滋养细胞的无血清培养基中的人多能干细胞。

此外，在相关技术中，含有KSR、NEAA、β-巯基乙醇和bFGF的DMEM/F12被用作多能干细胞培养基，但在本发明中，使用无血清的多能干细胞培养基。

在本发明中，步骤(a)中用于培养人多能干细胞的无血清培养基可以是TeSR-Essential 8(TeSR-E8)培养基、TeSR-2培养基或StemMACS iPS-Brew XF人培养基，但不限于此。

(b)通过将分离的多能干细胞悬浮在拟胚体形成培养基中，形成单个球状拟胚体，然后培养分离的多能干细胞以使多能干细胞聚集；

在本发明中，其特征在于，使用形状和大小均匀的成熟拟胚体来诱导人多能干细胞向间充质干细胞的分化。在相关技术的方法中，难以期待一致的间充质干细胞分化效率，因为不可能产生形状和大小均匀的拟胚体，但在本发明中克服了这些技术局限，方法是，允许这些拟胚体进行细胞间聚集和悬浮培养，形成形状和大小均匀的成熟拟胚体，由此形成人多能干细胞的单个的球状体。如此一来，制备了优异的间充质干细胞，其提高了源自人多能干细胞的间充质干细胞的分化效率，并且即使在反复传代培养后也能长时间保持干细胞特性。

在相关技术的方法(WO 2011052818)中，多能干细胞在拟胚体形成期间被悬浮培养，但在本发明中，为了使得多能干细胞相互聚集形成单个球状拟胚体，多能干细胞被接种到培养容器的盖子上，然后将培养容器倒置悬滴培养24小时，使细胞在重力作用下聚集，形成的细胞聚集体即拟胚体被悬浮培养并成熟为成熟拟胚体。结果，如图1所示，形成了形状和大小均匀的成熟拟胚体，这些成熟拟胚体可以表现出一致的分化为间充质干细胞的效率和在传代培养过程中的稳定性。

由图4可知，现有技术的方法制备的成熟拟胚体的大小和形状不均匀，而本发明方法制备的成熟拟胚体大小均匀，为300～500μm，形状也恒定为球体(spheroid)。此外，可以看出，由如此制备的成熟拟胚体诱导的间充质干细胞分化具有恒定的分化效率和恒定的间充质干细胞大小。然而，由相关技术的方法制备的拟胚体诱导的间充质干细胞分化在分化效率和细胞形态上都不均匀(图5)。

此外，从形状和大小均匀的成熟拟胚体诱导的间充质干细胞分化到第20代时，出人意料地表现出间充质干细胞表面标志物CD29、CD44、CD73和CD105的表达达到90％或更多。此外发现，造血干细胞特异性表面标志物CD45、MHC II类标志物HLA-DR、和多能干细胞特异性表面标志物SSEA-3、TRA-1-60和TRA-1-81的表达在2％或更少。即，由于通过本发明的方法制备的间充质干细胞可以长期传代培养并保持高纯度，因此可以大量生产可用作细胞治疗剂的干细胞。当由相关技术的方法制备的间充质干细胞满足作为细胞治疗剂的使用标准时，细胞老化和修饰，不再适合实现作为细胞治疗剂的目的。最后，缺点是应用于临床试验的细胞和进行质量评估的细胞必然是不同。然而，由于本发明的间充质干细胞即使为了用作细胞治疗剂而经过长时间的重复传代培养也不会被修饰、并且保持间充质干细胞的质量特性，因此本发明的间充质干细胞对于商业化细胞治疗剂非常有用。

虽然控制类胚体大小的方法(KR10-2013-0013537)或通过悬滴法形成大小均匀的拟胚体的方法(KR10-2007-0075006)等是已知的，但也已知大小均匀的拟胚体的形成影响细胞分化效率，而对于由大小均匀的拟胚体诱导的间充质干细胞分化的衰老或细胞修饰的抑制效果完全未知。然而，在本发明中，确认形成了形状和大小均匀的成熟拟胚体，可以长期维持由其诱导的间充质干细胞分化的间充质干细胞特性，直到第20代。特别是，证实由相关技术的方法制备的拟胚体诱导的间充质干细胞分化中，CD105的表达在第6代下降43.6％，第12代下降26.6％(表2)。即，由相关技术的方法制备的干细胞到第20代时不能保持间充质干细胞的特性，但本发明通过形成大小均匀的拟胚体，使干细胞可以长时间保持间充质干细胞的特性，直到第20代。

因此，本发明通过采用无滋养细胞、无异种、无血清的培养环境，解决了外来动物源性材料的污染问题，制备了安全性高的间充质干细胞，同时制备了人多能干细胞来源的间充质干细胞，其通过利用球形拟胚体形成形状和大小均匀的成熟拟胚体而具有提高间充质干细胞分化效率的优异效果，并且即使在长期传代培养(例如20代或更多代)后也能稳定保持间充质干细胞特性。

本文中，“球状拟胚体”是指圆形的球状细胞聚集体，其中该球状形式通常表示为球状体形式。

在本发明中，任何能够诱导多能干细胞的细胞间聚集的培养方法都可以用于步骤(b)中的拟胚体。任何能够制备多能干细胞聚集体，即单个球状拟胚体的培养方法都是可能的并且不受限制。例如，步骤(b)中的拟胚体可以通过悬滴培养来形成，或者用V形管、圆形96孔板或锥形管进行培养。

在本发明中，任何能够诱导多能干细胞之间的细胞聚集的培养基都可以用作步骤(b)中的拟胚体形成培养基。例如，步骤(b)中的拟胚体形成培养基可以是Aggrewell EB形成培养基、Gibco Essential 6培养基、CTS Essential 6培养基或TeSR-E6。步骤(b)中的培养可以进行18～30小时，例如20～28小时、22～26小时，例如24小时。

(c)通过将拟胚体在拟胚体成熟培养基中悬浮培养，形成成熟拟胚体；

步骤(c)是使拟胚体在悬浮培养的同时生长的步骤，并且在该步骤中获得的成熟拟胚体的特征在于具有均匀的形状和大小。

成熟拟胚体具有“均匀的形状和大小”是指，通过悬浮培养球状拟胚体获得的成熟拟胚体的形状和大小均匀。成熟拟胚体的形状是像拟胚体一样呈球形，成熟拟胚体的大小均匀，在所有成熟拟胚体平均大小的±15％以内。即，假设成熟拟胚体的平均大小为100％，则成熟拟胚体的最小大小在90％以内，成熟拟胚体的最大大小在120％以内，其大小相当均匀。优选地，成熟拟胚体大小均匀，为所有成熟拟胚体平均大小的±10％。在这种情况下，假设成熟拟胚体的平均大小为100％，则成熟拟胚体的最小大小为90％，成熟拟胚体的最大大小在110％以内。尽管成熟拟胚体的平均大小可能根据拟胚体的成熟培养条件和时期而变化，但适合于诱导分化成干细胞的成熟拟胚体的平均大小可以是350～450μm，例如，380～420μm。优选地，成熟拟胚体具有300～500μm的均匀大小。

在本发明中，步骤(c)中的悬浮培养使用用于拟胚体成熟的拟胚体成熟培养基进行。拟胚体成熟培养基可以使用通常已知的，并无特别限制。尽管不限于此，在本发明的示例性实施方式中，步骤(c)中的拟胚体成熟培养基可以是添加了敲除血清替代物(KSR)、非必需氨基酸(NEAA)和β-巯基乙醇的基础培养基。基础培养基可以是DMEM/F12、αMEM、Ham'sF12培养基或DMEM，但不限于此。

步骤(c)中的悬浮培养可以进行10～18天，例如12～16天，如14天，但不限于此。

(d)通过将拟胚体贴壁培养在无异种和无血清的间充质干细胞培养基中，诱导分化为间充质干细胞

在诱导从人多能干细胞向间充质干细胞分化的情况下，分化的诱导通常通过从外部添加细胞因子例如骨形态发生蛋白(BMP)等来起始，但在本发明中，证实了在不添加BMP等的情况下自然诱导了向间充质干细胞的分化。在相关技术的方法(WO 2011052818)中，含FBS的DMEM培养基被用于间充质干细胞的分化，含FBS的EGM2-MV培养基也被用于增殖培养。然而，在本发明中，间充质干细胞的增殖和培养是在无异种和无血清的环境中进行的。

在本发明中，步骤(d)中使用的间充质干细胞培养基可以是含有L-谷氨酰胺的无异种和无血清的培养基。所述培养基中L-谷氨酰胺的总浓度优选按照2～4mM使用，但不限于此。

步骤(d)中的无异种和无血清的间充质干细胞培养基的实例包括Stempro SFM无异种培养基、PRIME-XV MSC扩增XSFM培养基、Human Mesenchymal-XF Expansion培养基、MSC Nutristem XF培养基、StemMACS MSC扩增培养基试剂盒XF、人培养基、或含有5～20％人血小板裂解物代替FBS的培养基，但不限于此。

此外，在本发明中，步骤(d)中对分化为间充质干细胞的诱导可以是12～20天，例如14～18天，如16天，但不限于此。

在本发明的一个示例性实施方案中，间充质干细胞的分化在不含分化诱导因子和血清的Stempro MSC SFM无异种培养基中诱导。

(e)分化的间充质干细胞在无异种和无血清的间充质干细胞培养基中增殖和培养，同时保持间充质干细胞的特性

步骤(e)是被诱导分化的间充质干细胞的增殖和培养步骤。为了使含有人间充质干细胞的细胞治疗剂商品化，非常重要的是，在该步骤中获得的间充质干细胞是否确保足够量、同时保持间充质干细胞的特性(即间充质干细胞的特征)。

在本发明中，在被诱导分化的间充质干细胞的增殖培养中，间充质干细胞在未添加额外的分化诱导因子和胎牛血清(FBS)的无异种培养基中培养。

与步骤(d)一样，在本发明中，步骤(e)中使用的间充质干细胞培养基可以是含有L-谷氨酰胺的无异种和无血清的培养基。所述培养基中L-谷氨酰胺的总浓度优选按照2～4mM使用，但不限于此。

步骤(e)中的无异种和无血清的间充质干细胞培养基的实例包括Stempro SFM无异种培养基、PRIME-XV MSC扩增XSFM培养基、Human Mesenchymal-XF Expansion培养基、MSC Nutristem XF培养基、StemMACS MSC扩增培养基试剂盒XF、人培养基、或含有5～20％人血小板裂解物代替FBS的培养基，但不限于此。

在本发明的示例性实施方式中，未添加FBS的Stempro MSC SFM培养基被用作间充质干细胞增殖培养基，但本发明不限于此，不含异源材料如异源蛋白(无异种)的培养基可以使用。

如上所述，为了将间充质干细胞用作细胞治疗剂，首先需要供给足量的细胞，为此需要进行间充质干细胞的传代培养。但是，如果连续进行传代培养，则存在间充质干细胞老化和失去分裂能力、失去活性(分化能力)的问题。在这点上，在本发明中，证实了即使在无异种和无血清的培养基中离体(ex vivo)培养20代或更多代，间充质干细胞的特性和活性也可以维持(表1)。即，由本发明方法制备的间充质干细胞可以长期保持间充质干细胞的特性，因此可以通过大量生产作为细胞治疗剂使用。这些特性可以通过无异种和无血清的间充质干细胞制备环境和大小均匀的拟胚体的制备来实现。

间充质干细胞由均匀的梭形指纹图谱和基本细胞表面标志物如CD73(+)、CD105(+)、CD34(-)、CD45(-)等的表达水平定义，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。

在本发明中，步骤(e)中的间充质干细胞的特征可以是，具有能分化成选自由脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞和心肌细胞组成的组的细胞的专能性的间充质干细胞。

在本发明的示例性实施方案中，为了确认根据多能干细胞来源的间充质干细胞的传代培养的干细胞特征持久性(一致性)，比较分析了直至第20代的细胞表面标志物的变化。比较分析了第12代到第20代的间充质干细胞的表面标志物CD29、CD44、CD73和CD105，造血干细胞特异性表面标志物CD45，MHC II类标志物HLA-DR，以及多能干细胞表面标志物SSEA-3、TRA-1-60和TRA-1-81的表达，结果证实间充质干细胞表面标志物CD29、CD44、CD73和CD105的表达直到第20代都维持在90％以上(表1)。而在由相关技术的方法(WO2011052818)制备的多能干细胞来源间充质干细胞中，CD105的表达在第6代细胞中就显示低于50％，特别是证实了在第12代后，该表达降低至26.6％(表2)。即，由相关技术的方法制备的干细胞不能将间充质干细胞的特性保持到第20代，但本发明通过形成具有均匀形状和大小的成熟拟胚体，可以将间充质干细胞的特性长时间保持直至第20代。

CD105已知是间充质干细胞的特异性表面标志物之一，根据Duff SE等人2003年的报告，CD105在间充质干细胞的血管再生中起重要作用(The FASEB Journal 2003；17(9):984-992)。此外，CD105不仅在间充质干细胞分化为骨细胞后减少(Levi B等,The Journalof Biological Chemistry.2011；286(45):39497-39509)，而且在间充质干细胞分化为诸如骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等细胞后都会降低，并因此已知在维持间充质干细胞的干性(stemness)中起重要作用(Jin HJ等,BBRC 2009；381(4):676-681)。

在本发明中，步骤(e)中的间充质干细胞的特征可以是，表达CD29(+)、CD44(+)、CD73(+)和CD105(+)细胞表面标志物的间充质干细胞。

在本发明中，细胞表面标志物的表达优选在20代或更多代的间充质干细胞中维持在90％或更多，更优选CD105(+)细胞表面标志物在20代或更多代的间充质干细胞中的表达保持在90％或更多，但不限于此。

在本发明中，步骤(e)中的间充质干细胞的特征可以是CD34(-)、CD45(-)、HLA-DR(-)、TRA-1-60(-)和TRA-1-81(-)的间充质干细胞。

另一方面，本发明涉及由本发明方法制备的人多能干细胞分化而来的间充质干细胞。

尽管在种族起源(亚洲和西方)和类型(胚胎干细胞和经诱导的多能干细胞)上不同，但是由本发明方法制备的从人多能干细胞诱导分化的间充质干细胞都产生了相同的结果。本发明提供了一种标准化的分化诱导和增殖培养方法，其可通常用于从各种遗传来源的人多能干细胞产生间充质干细胞。即，本发明所述方法是可通用于诱导从具有各种遗传背景和/或培养环境的多能干细胞得到的间充质干细胞分化的方法。

在本发明的一个示例性实施方案中，间充质干细胞是使用在国家干细胞再生医学中心(National Center for Stem Cell Regenerative Medicine)的干细胞库(Stem CellBank)注册的SNUhES35/hES12011003胚胎干细胞作为人多能干细胞产生的，但本发明不限于此.

此外，在本发明的另一个示例性实施方案中，间充质干细胞使用在国家干细胞再生医学中心干细胞库作为西方胚胎干细胞注册的ESI-017/hES22014005和ESI-035/hES22014006产生的，但本发明不限于此，也可以使用ESI-049/hES22014007、ESI-051/hES22014008、ESI-053/hES22014009等胚胎干细胞。

在本发明的又一个示例性实施方案中，间充质干细胞是使用亚洲型经诱导的多能干细胞产生的，但本发明不限于此。

在又一方面，本发明涉及一种细胞治疗剂，其包含由本发明方法制备的人多能干细胞诱导分化的间充质干细胞作为活性成分。除了间充质干细胞之外，所述细胞治疗剂还可以包括注射用水。此外，所述细胞治疗剂可以包括用于冷冻的冷冻赋形剂。冷冻赋形剂优选为CryoStor10(CS10)或不含动物来源成分的STEM-CELLBANKER DMSO Free GMP级，但不限于此。通常，含有间充质干细胞的细胞治疗剂以1x10

实施例

在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于举例说明本发明，并且对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，本发明的范围不应被解释为受这些实施例的限制。

实施例1：从人多能干细胞制备间充质干细胞的方法

为了确认多能干细胞是否可以在无滋养细胞、无异种和无血清的环境中进行体外培养、并同时保持多能性，组织培养容器包被人玻连蛋白(它是人细胞外基质的成分)至终浓度10μg/mL，然后将未分化的人多能干细胞(韩国来源的胚胎干细胞：SNUhES35/hES12011003)用TeSR-2或TeSR-Essential 8(TeSR-E8)培养基(一种无异种和无血清的培养基)培养，获得多能干细胞的集落(图1左侧，ESC培养照片)。当汇合率达到60％(20个或更多集落)时，多能干细胞集落用EZPassage传代工具均匀破碎成约200μm x 200μm的大小(图2A)，并使用移液器转移到锥形管中，静置锥形管使细胞沉降，然后取出上清液。分离的多能干细胞被证实为具有约10～15μm大小(直径)的球形细胞(图2B)。

为了确认在无滋养细胞、无异种和无血清的环境中培养的多能干细胞的多能性，通过免疫荧光染色证实干细胞的多能性标志物OCT-4和SSEA-4的表达。

结果，在无细胞、无异种和无血清环境中培养的多能干细胞中指示多能性的标记物OCT-4和SSEA-4被表达。即，可以确认在无滋养细胞、无异种和无血清的环境中培养的多能干细胞保持多能性(图3)。

将一定体积的悬浮有多能干细胞的拟胚体形成培养基(Aggrewell EB FormationMedium)接种到培养皿的盖子上，然后悬滴培养以形成细胞聚集体，即拟胚体。将拟胚体再接种到拟胚体成熟培养基中，然后悬浮培养，以形成具有一定大小的成熟拟胚体。

具体而言，将拟胚体形成培养基(Aggrewell EB Formation Medium)(浓度为每20个人多能干细胞集落400μl)放入装有分离的多能干细胞的锥形管中进行悬浮，使分离的多能干细胞通过移液成为拟胚体形成培养基中的单个细胞。将20μl悬浮有多能干细胞的拟胚体形成培养基接种到组织培养容器的盖子上，然后将组织培养容器倒置，在37℃的5％CO

形成的拟胚体用胚状成熟培养基(DMEM/F12、20％敲除血清替代物(KSR)、0.1mM非必需氨基酸(NEAA)、0.1mMβ-巯基乙醇)在培养皿中悬浮培养14天，每2～3天更换培养基(见图1)。

结果，可以确认，具有恒定形状和300～500μm均匀大小的成熟拟胚体形成球形体(图4右侧，改进方法的照片)。

培养了14天的成熟拟胚体附着在包被了不含异种物的底物CellStart

为了诱导分化为间充质干细胞和初始培养，在不传代培养的情况下培养16天，每2至3天更换一次培养基。

经显微镜确认由贴壁的成熟拟胚体分化的间充质干细胞充分增殖后，进行传代培养。

此外，将如此制得的多能干细胞来源的间充质干细胞进行传代培养，并用StemProMSC SFM无异种培养基在培养箱中以37℃、5％CO

图5比较了现有技术制备方法(WO2011052818)制得的拟胚体与本发明改进方法制得的拟胚体分化为间充质干细胞的效率和细胞形态。根据本发明的方法，可以根据拟胚体的均匀形状和大小确认，分化为间充质干细胞的效率和细胞形态是恒定的(图5的底部)。然而，由相关技术的方法制得的拟胚体诱导分化的间充质干细胞在分化效率和细胞形态上并不均匀(图5顶部)。

实施例2：多能干细胞衍生的间充质干细胞的表征

为了确认实施例1的方法制得的多能干细胞来源的间充质干细胞是否具有间充质干细胞的特性，使用流式细胞仪分析细胞表面标志物，并分析间充质干细胞是否可以分化成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。

图6示出了在无滋养细胞、无异种和无血清的培养环境中培养的多能干细胞来源的间充质干细胞的细胞表面标志物表达的分析结果。

结果，证实了作为间充质干细胞特异性表面标志物的CD73和CD105在多能干细胞来源的间充质干细胞中阳性表达，还证实了与免疫应答相关的MHC II类细胞表面标志物HLA-DR的表达以及造血干细胞特异性细胞表面标志物CD34和CD45的表达为阴性。

另外，为了确认是否掺入了多能干细胞，作为确认多能干细胞特异性细胞表面标记物TRA-1-60的表达的结果，确认了所制得的多能干细胞来源的间充质干细胞的TRA-1-60表达为阴性(图6)。

为了分析实施例1的方法制得的多能干细胞来源的间充质干细胞的分化能力，诱导14天使其分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞，然后通过特异性化学染色法验证每种分化能力。

经过14天的脂肪细胞诱导分化后的油红-O染色结果证实，制得的多能干细胞来源间充质干细胞分化成脂肪细胞，经过14天的骨细胞分化诱导后的茜素(Alizarin)-红-S和碱性磷酸酶染色证实，制得的多能干细胞来源间充质干细胞分化成骨细胞。进而，经过14天的软骨细胞分化诱导后的阿新(Alcian)蓝染色结果证实，制得的多能干细胞来源间充质干细胞分化为软骨细胞(图7)。

这表明，实施例1制得的多能干细胞来源间充质干细胞具有类似于一般间充质干细胞的分化能力。

进行G带核型分析(Saccone et al,Proc Natl Acad Sci USA,89:4913-4917,1992)以确认实施例的方法制得的多能干细胞来源间充质干细胞的分化过程中是否发生染色体异常。

结果，在制得的多能干细胞来源间充质干细胞中确认46XY的正常核型，表明实施例1制得的多能干细胞来源间充质干细胞的分化过程未引起染色体异常(图8)。

为了确认实施例1的方法制得的多能干细胞来源的间充质干细胞在传代培养中的干细胞特征持久性(一致性)，在培养容器中进行连续传代培养，以便比较式分析直到第20代的细胞表面标志物的变化。

间充质干细胞表面标志物CD29、CD44、CD73和CD105，造血干细胞特异性表面标志物CD45，MHC II类标志物HLA-DR，以及多能干细胞特异性表面标志物SSEA-3、TRA-1-60和TRA-1-81的表达在第12代至第20代的细胞中进行了比较分析(表1)。

结果证实，在实施例1的方法制得的多能干细胞来源的间充质干细胞中，间充质干细胞表面标志物CD29、CD44、CD73和CD105的表达从第12代到第20代是维持在90％或更多。此外，证实了造血干细胞特异性表面标志物CD45，MHC II类标志物HLA-DR，和多能干细胞特异性表面标志物SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-81的表达维持阴性。

这些结果表明，实施例1的方法制得的多能干细胞来源间充质干细胞直到第20代都保持了间充质干细胞的特性，可以说多能干细胞来源的间充质干细胞具有高利用价值，不仅对于未来使用间充质干细胞的治疗剂的大规模培养，而且对于通过基因导入开发细胞功能增强的干细胞治疗剂，都是一种重要的细胞资源。

表1

实施例3：不同制备方法得到的多能干细胞来源间充质干细胞的特性比较

从相同的多能干细胞经过不同的制备间充质干细胞的方法制得两种多能干细胞来源的间充质干细胞，用显微镜比较了这两种干细胞的细胞形态。对制备的多能干细胞来源间充质干细胞的第7代和第12代进行了形态学比较。

证实通过现有方法(WO2011052818)制备的多能干细胞来源的间充质干细胞和通过上述实施例制备的多能干细胞来源的间充质干细胞均具有纺锤形，并且细胞形态直到第7代都保持相似。然而，在现有方法制备的多能干细胞来源的间充质干细胞的情况下，在第12代出现细胞聚集现象。

然而，证实通过上述实施例制备的多能干细胞来源的间充质干细胞即使在第12代后也很好地保持了纺锤形细胞形态(图9)。

如实施例3-1，比较了现有方法(WO2011052818)制备的多能干细胞来源的间充质干细胞和本发明制备的多能干细胞来源的间充质干细胞的细胞表面标志物的表达。

证实在通过本发明的方法制备的多能干细胞来源的间充质干细胞中，作为间充质干细胞特异性细胞表面标志物的CD29、CD44、CD73、CD105的表达为90％或更多，并且直到第6、8和12代都呈阳性。此外，证实了造血干细胞特异性细胞表面标志物CD34和CD45、MHC II类标志物HLA-DR、和多能干细胞特异性细胞表面标记物TRA-1-60的表达为阴性(表2)。

相比之下，在现有方法制备的多能干细胞来源的间充质干细胞中，除了CD105之外的剩余细胞表面标志物的表达与本发明方法制备的多能干细胞来源的间充质干细胞的表达直至第6、8和12代都维持相似，但发现CD105的表达在第6代的细胞中低于50％，特别是证实在第12代后该表达降低至26.6％(表2)。

表2

如实施例3-1，比较了现有方法(WO2011052818)制备的多能干细胞来源的间充质干细胞和本发明制备的多能干细胞来源的间充质干细胞分化成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的能力。

已证实，本发明方法制备的多能干细胞来源的间充质干细胞比现有方法制备的多能干细胞来源的间充质干细胞具有更高的分化成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的能力(图10)。

实施例4：根据多能干细胞类型的差异比较间充质干细胞

为了确认本发明方法制备的间充质干细胞是否因多能干细胞的来源种族而异，将西方胚胎干细胞(ESI-017/hES22014005、ESI-035/hES22014006)培养在无滋养细胞、无异种和无血清的环境中。

以与实施例1-1相同的方式，组织培养容器使用作为人细胞外基质组分的人玻连蛋白包被至终浓度为10μg/mL，然后未分化的西方多能干细胞用TeSR-2培养基(一种无异种和无血清的培养基)培养(图11A)。

为了确认在无饲养细胞、无异种和无血清环境中培养的多能干细胞的多能性，通过免疫荧光染色确认了干细胞多能性标志物OCT-4和SSEA-4的表达，结果，在西方多能干细胞中表达了显示多能性的OCT-4和SSEA-4。此外，通过确认碱性磷酸酶的表达可以看到，所培养的西方多能干细胞维持了多能性(图12A)。

另外，为了从培养的西方多能干细胞诱导间充质干细胞分化，使用与实施例1-2相同的方法和培养基形成成熟拟胚体，如此培养14天的成熟拟胚体采用与实施例1-3相同的方法和培养基分化成间充质干细胞。在显微镜下确认从贴壁的成熟拟胚体分化的间充质干细胞充分增殖后，对间充质干细胞进行传代培养，在37℃和5％CO

因此，可以确认本发明方法制备的间充质干细胞不因多能干细胞的来源种族而异。

为了确认本发明方法制备的间充质干细胞是否因多能干细胞的类型而不同，经诱导的多能干细胞(iPSC)在无滋养细胞、无异种和无血清的环境中培养。

以与实施例1-1相同的方式，组织培养容器使用作为人细胞外基质的组分的人玻连蛋白包被至终浓度为10μg/mL，然后未分化的诱导的多能干细胞用TeSR-2培养基(一种无异种和无血清的培养基)培养(图11B)。

通过免疫荧光染色确认干细胞的多能性标志物OCT-4和SSEA-4的表达，以确认在无滋养细胞、无异种和无血清环境中培养的多能性干细胞的多能性，结果，显示多能性的OCT-4和SSEA-4在诱导的多能干细胞中表达。即，可以看出培养的诱导的多能干细胞保持多能性(图12B)。

此外，为了从培养的诱导的多能干细胞诱导间充质干细胞的分化，以与实施例1-2相同的方式形成成熟拟胚体，并且以与实施例1-3相同的方式将如此培养14天的成熟拟胚体分化为间充质干细胞。在显微镜下确认从贴壁的成熟拟胚体分化的间充质干细胞充分增殖后，对间充质干细胞进行传代培养，在37℃和5％CO

因此，可以确认本发明方法制备的间充质干细胞不因多能干细胞的种类而异。

尽管已经详细描述了本发明的特定部分，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，这样的具体描述仅仅是优选实施方案，本发明的范围不受此限制。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物来定义。

产业适用性

本发明的从人多能干细胞制备间充质干细胞的方法采用无滋养细胞、无异种、无血清的培养环境，解决了外源性动物源性材料的污染问题，该方法利用球状拟胚体形成形状和大小均匀的成熟拟胚体，因此即使经过长期的传代培养，也可以大量制备出特性不变的间充质干细胞。因此，本发明有利于将安全性和效率极佳的细胞治疗剂商业化。