一种具有抗氧化活性的大豆分离蛋白抗氧化肽序列

摘要

本发明公开了一种具有抗氧化活性的大豆分离蛋白抗氧化肽序列，其特征在于它的序列：氨基端‑PDIEHPETM‑羧基端。本发明从大豆分离蛋白中提取到抗氧化肽的结构序列，并通过合成同一序列肽，进一步证明该序列的肽确实是具有抗氧化活性，将多肽作为抗氧化活性物质添加到日常膳食中不但可以作为自由基清除剂清除人体中的有害自由基，还可以作为营养物质被人体吸收利用，这对于那些营养缺乏、消化能力差、体弱多病者有重要的意义。

说明书

技术领域：

本发明属于多肽技术领域，涉及一种具有抗氧化活性的大豆分离蛋白抗氧化肽序列。

背景技术：

研究显示，当机体氧自由基过量时会对机体造成一系列的氧化损伤，尤其是当机体处于衰老、生病或疲劳状态时，自由基的平衡状态就可能被破坏，对机体造成一系列氧化性损伤，严重时甚至可能会引发或加重细胞、组织乃至全身机体的生理紊乱与病理变化。

大豆蛋白经水解后生成的大豆活性肽具有一定的抗氧化能力，这是因为水解使氨基酸活性基团暴露出来，因此小分子大豆肽生物活性更高。大豆肽对于抑制体内自由基的过度积累和清除自由基保持机体自由基平衡状态具有重要作用，从而对延缓机体衰老，减少自由基引起的疾病的发生起到一定的功效。天然抗氧化剂在医药、化妆品、保健品和食品与饲料添加剂等方面应用前景广阔，筛选具有强抗氧化活性的天然资源已成为食品科学、生物学、医学等研究的新趋势。而从大豆分离蛋白中获得具有抗氧化活性的抗氧化肽序列，对其今后的开发应用具有广泛的意义。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种具有抗氧化活性的大豆分离蛋白抗氧化肽序列，该序列具有抗氧化功能。

本发明是通过如下技术手段来实现的：一种具有抗氧化活性的大豆分离蛋白抗氧化肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

本发明通过酶法制备获得该具有抗氧化活性的大豆分离蛋白抗氧化肽序列，具体制备过程如下：选大豆分离蛋白，采用碱性蛋白酶酶解提取，得酶解液，将酶解液经分离纯化，收集分子量<3KD的多肽液，得到的肽液含具有抗氧化活性的大豆分离蛋白抗氧化肽。

其中碱性蛋白酶酶解提取时，酶解温度选45-65℃，底物浓度3g/100mL-7g/100mL，酶与底物比(E/S)6-14％，pH为7-12，时间为1-6h。酶解结束后高温灭火蛋白酶，调节pH为4.5沉淀未酶解大豆分离蛋白，离心收集上清液。

最优条件为温度51℃，底物浓度5.2g/100mL，E/S为12.43％，pH为12，经碱性蛋白酶酶解4h，得到的多肽液抗氧化活性最高。

酶解液分离纯化处理时优选超滤离心管10KD和3KD进行分离纯化。酶解液脱盐处理时优选C18柱。

经过RP-HPLC、Q Exactive质谱仪进行质谱分析，本发明制备获得上述肽液中所含的肽段分子量为1067.4594Da，分析该肽的序列为：Pro-Asp-Ile-Glu-His-Pro-Glu-Thr-Met。

因此，本发明申请人采用人工合成上述具有抗氧化活性的大豆分离蛋白抗氧化肽序列，经DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率分析发现，该人工合成的大豆分离蛋白抗氧化肽序列具有较好抗氧化性。抗氧化能力高于天然提取肽，低于谷胱甘肽。

附图说明：

图1是大豆分离蛋白经酶解后分离纯化的抗氧化肽序列质谱图。

具体实施方式：

实施例1

本实施例提供的具有抗氧化活性的大豆分离蛋白抗氧化肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，其通过从大豆分离蛋白中提取获得，具体提取过程如下：

选用碱性蛋白酶酶解大豆分离蛋白，酶解条件为酶解温度51℃、底物浓度5.2g/100mL、E/S为12.43％、pH为12，酶解时间4h。酶解结束后高温灭火蛋白酶，调节pH为4.5沉淀未酶解大豆分离蛋白，离心收集上清液。用超滤离心管10kD和3kD进行分离纯化，收集分子量<3KD的多肽液用C18柱进行脱盐处理，即得到具有抗氧化活性的抗氧化肽。

将该大豆分离蛋白酶解得到的肽液经过RP-HPLC、Q Exactive质谱仪进行质谱分析，本发明制备获得上述肽液中所含的肽段分子量为1067.4594Da，分析该肽的序列为：Pro-Asp-Ile-Glu-His-Pro-Glu-Thr-Met，如图1。

实施例2

本发明人工合成大豆分离蛋白抗氧化肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，其通过人工合成，人工合成大豆分离蛋白抗氧化肽序列采用多肽合成仪合成。

实施例3

大豆分离蛋白抗氧化肽序列的应用，以DPPH自由基、ABTS自由基清除能力的IC50值为抗氧化指标，分析实例1中大豆分离蛋白抗氧化肽(Pro-Asp-Ile-Glu-His-Pro-Glu-Thr-Met)和实例2中人工合成大豆分离蛋白抗氧化肽(Pro-Asp-Ile-Glu-His-Pro-Glu-Thr-Met)的这些指标，并且以谷胱甘肽与抗坏血酸为对照，结果如下表1中所示：

表1实施例1和实施例2中大豆分离蛋白抗氧化肽序列和对照谷胱甘肽与抗坏血酸的抗氧化能力分析。

从表1中可以看出，经DPPH自由基、ABTS自由基清除能力，实例2中合成肽的IC50值比天然提取肽低，说明合成肽的抗氧化能力更强，但没有谷胱甘肽与抗坏血酸的抗氧化活性高。

其中DPPH自由基清除能力测定、ABTS自由基清除能力测定过程如下：

(1)DPPH自由基清除能力测定：

取2mL样品与2mLDPPH(2×10

式中：A0－对照组吸光度；

Ai－样品组吸光度；

Aj－空白组吸光度。

(2)ABTS自由基清除能力测定：

将ABTS与过硫酸钾溶液1:1混合，避光12h，生成ABTS自由基阳离子，再用磷酸缓冲液(pH＝6.6)进行稀释，调734nm处吸光值为(0.7±0.2)；取0.2mL不同浓度样品溶液与2mLABTS工作液混合，温室避光反应6min，于734nm处测吸光值Ai。同时以磷酸缓冲液代替ABTS工作液作空白实验测定其吸光度值为Aj，以蒸馏水代替样品溶液作对照实验测定其吸光度值A0。ABTS自由基的清除率用下式计算：

式中：A0－对照组吸光度；

Ai－样品组吸光度；

Aj－空白组吸光度。

以上列举具体实施对本发明进行说明。需要指出的是，以上实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明的提示做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。