一种具有氧化还原响应释药功能的生物抗氧化纳米涂层及其制备方法与应用

摘要

本发明公开一种具有氧化还原响应释药功能的生物抗氧化纳米涂层及其制备方法与应用。所述涂层包括在基材表面构建的纳米管载药体系以及在纳米管表面原位聚合形成由氧化还原响应官能团修饰的聚多巴胺构成的并使得至少部分纳米管管口被全部或部分包封的三维网状结构纳米复合涂层。

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有良好生物抗氧化功能的氧化还原响应释药功能的生物抗氧化纳米涂层及其制备方法与应用，属于生物医用技术领域。

背景技术

随着人口老龄化进程的加速，以及交通事故、疾病、自然灾害等造成的骨损伤事故的增多，人工植入材料的需求量日益增加。传统促进植入体周围骨组织修复的解决办法是口服或者静脉注射相应的药物，但此法会对人体正常的组织器官造成严重损伤。而局部给药可避免上述副作用的同时，为骨组织修复营造一个较好的再生微环境。

传统的药物释放，仅仅将药物以简单的范德华力或者共价键的形式结合在材料上，其主要的弊端是药物释放的速度非常快，无法满足长期释药的需求，而且大量药物进入人体后，会对周围的正常细胞造成严重损伤。与正常生理状态的骨缺损患者相比，患有系统性疾病(如糖尿病、高血压、骨质疏松等)的骨折或骨缺损患者体内，活性氧簇(主要包括过氧化氢分子、超氧根离子和羟基自由基)水平较高，导致机体氧化能力超过抗氧化能力，易在骨植入材料周围引发组织的氧化应激损伤，抑制成骨细胞活性，严重影响了术后骨组织的修复。因此，结合患者体内活性氧水平高的特点及其特殊的病理微环境，开发具有氧化还原响应型药物释放功能，同时具良好生物抗氧化性能的骨植入材料，对于促进氧化应激下骨修复并改善骨质量具有重要临床意义。

多巴胺因具有邻苯二酚基团和氨基官能团的类贻贝分泌粘附蛋白的特殊结构，水溶液中，能进行自发的氧化聚合-交联反应，可以在几乎任何一种固体材料表面都能形成紧密附着的复合层，具有良好的生物相容性，有利于成骨细胞在其表面粘附增殖。除此之外，其表面富含-NH

发明内容

为了解决上述现有技术中所存在的缺陷，本发明提供了一种具有氧化还原响应型生物释药功能且具生物抗氧化性能良好的生物涂层材料及其制备方法与应用。

第一方面，本发明提供了一种具有氧化还原响应释药功能的生物抗氧化纳米涂层。所述涂层包括在基材表面构建的纳米管载药体系以及在纳米管表面原位聚合形成由氧化还原响应官能团修饰的聚多巴胺构成的并使得至少部分纳米管管口被全部或部分包封的三维网状结构纳米复合涂层。

所述氧化还原响应官能团修饰的聚多巴胺为修饰甲酸二茂铁和β-CD@CeO

所述生物涂层，可有效避免药物暴释，提高基体(也可以称为“植入体”或“植入体材料”)的智能化和响应性，同时赋予涂层良好的生物抗氧化性能。与直接在材料表面装载药物相比，在活性氧水平比较高的情况下，聚多巴胺分子链上甲酸二茂铁官能团的疏水端被氧化为亲水端，二茂铁官能团带正电，由于分子链之间的存在较大的静电排斥作用，三维网络结构舒张，包封的管口被打开，所述涂层能根据周围氧化应激水平释放药物，有效避免药物暴释，避免材料周围局部药物浓度过高对正常组织造成损伤。另外，涂层具有良好的生物相容性和生物抗氧化性，能有效促进氧化应激环境中的骨组织修复，是一种潜在的生物医用材料，可用于硬组织修复与替换生物材料的研究与开发。

上述涂层中，β-CD@CeO

本发明中的CeO

较佳地，所述基材可采用包括纯钛、钛合金、不锈钢或钴铬钼合金等常用的医用金属或医用合金材料以及二氧化钛、氧化锆、氧化铝、氧化钽等金属氧化物材料。

较佳地，所述纳米管的长度为50～800nm，管径为20～150nm，壁厚为5～20nm。纳米管管径越大，长度越长，药物的负载量越大。

较佳地，所述纳米管为在基材表面原位生长的、作为所述药物储池的金属或金属氧化物纳米管。其开口结构垂直于基材表面，更加有利于前期药物的负载以及后期药物的响应型释放。

较佳地，所述纳米涂层的厚度为20～50nm。纳米涂层的厚度与多巴胺在材料表面自聚合的时间有关，自聚合的时间约长，涂层越厚。纳米涂层厚度低于限定厚度时，无法完全包封纳米管管口，易发生药物暴释现象，涂层高于限定厚度时，涂层的刺激响应性变差，无法及时将管内药物释放出来。

纳米管载药体系可以负载药物或者纳米酶。所述药物可以是促进骨组织修复的药物。所述促进骨组织修复的药物包括但不限于降钙素、阿仑膦酸钠、雷奈酸锶等。

第二方面，本发明提供了上述具有氧化还原响应释药功能的生物抗氧化纳米涂层的制备方法。所述制备方法包括以下步骤：

步骤(1)，通过阳极氧化法在基材表面形成管状纳米结构；

步骤(2)，通过真空负压法在步骤(1)所得纳米管状结构中负载药物或纳米酶，获得表面构建纳米管载药体系的基材；

步骤(3)，将表面构建纳米管载药体系的基材置于含有多巴胺单体的缓冲溶液中，通过氧化聚合反应获得三维网状结构纳米复合涂层。

该制备方法具有成本低、操作简单、可重复性好、应用范围广等优点。

上述缓冲溶液中多巴胺单体的浓度为1mg/mL-3mg/mL。由于游离态多巴胺不稳定且容易被氧化，可使用盐酸多巴胺替换游离多巴胺作为多巴胺单体。

较佳地，所述缓冲溶液还包括浓度为0.5～1mg/mL的甲酸二茂铁和浓度为0.5～1mg/mL的β-CD@CeO

在可选的实施方式中，甲酸二茂铁在使用之前应对其-COOH官能团进行活化，例如使用EDC和NHS配成的Tris-HCl缓冲溶液进行活化12～24h。

较佳地，所述阳极氧化的电压为10～30V，氧化时间为15～60分钟。

较佳地，通过真空负压法在步骤(1)所得纳米管状结构中负载药物或纳米酶的具体过程为：将表面形成管状纳米结构的基材浸没在药物溶液中并真空干燥。在可选的实施方式中，药物溶液的浓度为15～30mg/L。

较佳地，通过紫外辐照使多巴胺单体发生氧化聚合反应。

本发明采用操作简单、可规模化生产的溶液反应法，在基材表面原位氧化聚合得到了具有氧化还原响应型药物释放的纳米生物涂层，从而获得良好生物抗氧化功能的骨植入材料，将有望应用各种病理微环境下的骨修复治疗。

第三方面，本发明提供上述具有氧化还原响应释药功能的抗氧化纳米生物涂层在制备硬组织修复与替换生物材料中的应用。

附图说明

图1中的a为Ti基材，直接释药型纳米涂层(TiO

图2中的a为单体多巴胺(DA)，直接释药型纳米涂层(TiO

图3为直接释药型纳米涂层(TiO

图4为TiO

图5为直接释药型纳米涂层(TiO

图6为正常和氧化应激状态下，不同纳米涂层材料表面成骨细胞内活性氧物质的共聚焦荧光染色观察照片。

具体实施方式

通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

本发明中通过在骨植入体材料表面构建管状纳米结构并进行药物负载；对单体多巴胺进行功能化官能团修饰，使其具有氧化还原响应的特殊功能；功能化后多巴胺单体在上述植入体材料表面迅速发生氧化聚合，交联形成聚多巴胺的三维网状结构的纳米复合涂层。

本发明中多巴胺单体之间通过邻苯二酚键和-NH

作为优选，通过酰胺化反应在多巴胺单体上修饰甲酸二茂铁和(贝塔环糊精)β-CD修饰的纳米CeO

β-CD是具有亲水外腔和疏水内腔的特殊穴窍结构，甲酸二茂铁的疏水端和β-CD的疏水内腔可以通过主-客作用识别相结合，共同组成具有氧化还原响应作用的开关。活性氧水平升高时，甲酸二茂铁上的二价亚铁离子被迅速氧化为带正电的三价铁鎓离子，疏水端变为亲水端，β-CD剥离。

纳米CeO

因此，在多巴胺交联自聚合的同时将甲酸二茂铁以及β-CD功能化纳米CeO

以下示例性说明本发明所述涂层的制备方法。可依次采用阳极氧化法、真空负压载药法，紫外辐照氧化法等制备。

在基材表面构建纳米管状结构，获得表面覆盖纳米管状结构的基材。该纳米管状结构可作为涂层的药物储池。通过在植入体(也可以称为“基材”)表面构建纳米结构增大比表面积，可以增大药物的负载量。例如，选用医学常用金属钛作为基材，以金属铂片作为阴极，以钛或钛合金作为阳极，以氟化铵溶液和丙三醇组成的混合溶液作为电解质溶液进行所述阳极氧化在Ti基材表面制备TiO

利用表面覆盖纳米管状结构的基材负载药物或纳米酶。例如，选用雷奈酸锶作为促进骨组织修复的药物释放模型，以酒精为溶剂，配置成浓度为15～30mg/L的溶液，通过真空负压法，将阳极氧化后的Ti基材，浸没在雷奈酸锶的酒精溶液中，真空干燥24h。

配制包括甲酸二茂铁、β-CD功能化纳米CeO

β-CD@CeO

Tris-HCl缓冲溶液的配置，50mL 0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)和50mL0.1mol/L盐酸的混合溶液，用0.1mol/L HCl和0.1mol/L NaOH将溶液的pH调节到7～9.2。

用Tris-HCl缓冲溶液分别配置15mL 10mg/mL的EDC和NHS混合溶液，加入10mg的甲酸二茂铁，持续搅拌，羧酸活化12～24h，获得活化好的甲酸二茂铁溶液。

取10mL活化好的甲酸二茂铁溶液，5mLβ-CD@CeO

将载药后的基材浸没在活化溶液中，通过氧化聚合获得三维网状结构纳米复合涂层。可采用紫外辐照的方法使得多巴胺单体迅速在基材表面迅速氧化聚合。例如，将载药后的Ti基材浸没在上述溶液中，在紫外灯的辐照下，多巴胺迅速在在材料表面氧化聚合，紫外灯功率为48W，灯源距离混合溶液液面约5cm，紫外光照射10～30min。

本发明的纳米涂层具有氧化还原响应释放药物或纳米酶的功能，在溶液环境下随着周围活性氧含量升高，可释放促骨生成的药物或具生物抗氧化功能的纳米酶，降低活性氧对成骨细胞的氧化损伤，提高成骨细胞活性，促进周围骨组织再生。一些实施方式中，药物氧化应激响应型药物的缓释周期可长达27～30天。

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。以下通过下述具体实施例进一步说明本发明，应理解，下述实施例仅用于进一步说明本发明，不能理解为对本发明保护范围的限制。本领域的技术人员根据本发明的内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述实施例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

实施例

A.直接释药型纳米涂层的制备

首先，将钛片裁剪为20mm×10mm×0.2mm的小片，并对裁剪后的小片进行清洗处理(乙醇-水-乙醇-去离子水，每次15min)；然后，采用双电极模式，导电金属铂作为阴极、医用金属钛片作为阳极，电解质溶液为包含氟化铵水溶液和丙三醇的混合溶液，氟化铵的质量分数约为0.015％，丙三醇与水的体积比约为1:1。采用恒电压模式，20V电压下阳极氧化20min，将阳极氧化后的钛片用去离子水清洗干净，真空干燥24h。以酒精为溶剂，配置成浓度为20mg/L的溶液，通过真空负压法，将阳极氧化后的Ti基材，浸没在雷奈酸锶的酒精溶液中，真空干燥24h后，得到直接释药型的载药涂层，简记为TiO

由图1可知，阳极氧化后钛植入体表面TiO

由图2的FTIR图可知，在600～700cm

由图3的SEM图，我们可以清楚地看到规整的开口向上的TiO

B.聚多巴胺改性释药纳米涂层的制备

首先，将钛片裁剪为20mm×10mm×0.2mm的小片，并对裁剪后的小片进行清洗处理(乙醇-水-乙醇-去离子水，每次15min)；然后，采用双电极模式，导电金属铂作为阴极、医用金属钛片作为阳极，电解质溶液为包含氟化铵水溶液和丙三醇的混合溶液，氟化铵的质量分数约为0.015％，丙三醇与水的体积比约为1:1。采用恒电压模式，20V电压下阳极氧化20min，将阳极氧化后的钛片用去离子水清洗干净，真空干燥24h。以酒精为溶剂，配置成浓度为20mg/L的溶液，通过真空负压法，将阳极氧化后的Ti基材，浸没在雷奈酸锶的酒精溶液中，真空干燥24h后，得到直接释药型的生物涂层。

接下来，配置Tris-HCl缓冲溶液，取50mL 0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)和50mL 0.1mol/L盐酸溶液混合。用0.1mol/L HCl和0.1mol/L NaOH将溶液的pH调节到7～9.2范围内。取15mL的Tris-HCl缓冲溶液，加入30mg的盐酸多巴胺，用0.1mol/L NaOH将溶液的pH调至8.5，将载药后涂层浸没在上述溶液中，在紫外灯的辐照下，多巴胺迅速在在材料表面氧化聚合，紫外灯功率为48W，灯源距离混合溶液液面约5cm，紫外光照射时间为20min，得到聚多巴胺改性后的纳米释药涂层，简记为TiO

由图2可知，TiO

由图3可以明显的看到，TiO

C.氧化还原响应型纳米涂层的制备

首先，将钛片裁剪为20mm×10mm×0.2mm的小片，并对裁剪后的小片进行清洗处理(乙醇-水-乙醇-去离子水，每次15min)；然后，采用双电极模式，导电金属铂作为阴极、医用金属钛片作为阳极，电解质溶液为包含氟化铵水溶液和丙三醇的混合溶液，氟化铵的质量分数约为0.015％，丙三醇与水的体积比约为1:1。采用恒电压模式，20V电压下阳极氧化20min，将阳极氧化后的钛片用去离子水清洗干净，真空干燥24h。

配置5mL 1.0M的硝酸铈溶液和10mL 1.0M的β-CD的水溶液，将上述溶液混合均匀后，逐滴加入30mL的氢氧化铵溶液中，25℃，搅拌24h。4000转/分钟，离心30分钟，重复两次，取上清液，用2000MCO的透析膜进行透析，得到β-CD修饰的CeO

配置Tris-HCl缓冲溶液，取50mL 0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)和50mL0.1mol/L盐酸溶液混合。用0.1mol/L HCl和0.1mol/L NaOH将溶液的pH调节到7～9.2范围内。分别配置15mL 10mg/mL的EDC和NHS混合溶液，加入10mg的甲酸二茂铁，持续搅拌，羧酸活化12h。

取10mL活化好甲酸二茂铁的溶液，5mLβ-CD@CeO

由图1对XRD衍射峰进行分析，对比CeO

图2中我们可以看到，多巴胺在材料表面聚合形成聚多巴胺的同时，涂层在1520cm

由图3的SEM图可知，纳米CeO

D.氧化还原响应型释药纳米涂层的制备

首先，将钛片裁剪为20mm×10mm×0.2mm的小片，并对裁剪后的小片进行清洗处理(乙醇-水-乙醇-去离子水，每次15min)；然后，采用双电极模式，导电金属铂作为阴极、医用金属钛片作为阳极，电解质溶液为包含氟化铵水溶液和丙三醇的混合溶液，氟化铵的质量分数约为0.015％，丙三醇与水的体积比约为1:1。采用恒电压模式，20V电压下阳极氧化20min，将阳极氧化后的钛片用去离子水清洗干净，真空干燥24h。以酒精为溶剂，配置成浓度为20mg/L的溶液，通过真空负压法，将阳极氧化后的Ti基材，浸没在雷奈酸锶的酒精溶液中，真空干燥24h后，待用。

配置5mL 1.0M的硝酸铈溶液和10mL 1.0M的β-CD的水溶液，将上述溶液混合均匀后，逐滴加入30mL的氢氧化铵溶液中，25℃，搅拌24h。4000转/分钟，离心30分钟，重复两次，取上清液，用2000MCO的透析膜进行透析，得到β-CD修饰的CeO

配置Tris-HCl缓冲溶液，取50mL 0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)和50mL0.1mol/L盐酸溶液混合。用0.1mol/L HCl和0.1mol/L NaOH将溶液的pH调节到7～9.2范围内。分别配置15mL 10mg/mL的EDC和NHS混合溶液，加入10mg的甲酸二茂铁，持续搅拌，羧酸活化12h。

取10mL活化好甲酸二茂铁的溶液，5mLβ-CD@CeO

由图1对XRD衍射峰进行分析，由右图对衍射峰的局部放大图可知，TiO

图2中我们可以看到，多巴胺在材料表面聚合形成聚多巴胺的同时，涂层在1520cm

由图3的SEM图可知，纳米CeO

E.氧化还原响应型药物释放能力检测

将装载药物雷奈酸锶的三种材料TiO

由图4中锶离子的浓度变化曲线可知，TiO

F：氧化应激刺激下涂层表面亲水性检测

使用接触角测量仪检测材料分别在正常和氧化应激状态下的接触角的变化。正常组，采用去离子水；氧化应激组，则采用浓度为0.3mmol/L的H

由图5可知，正常和氧化应激情况下，TiO

G：正常和氧化应激状态下成骨细胞内活性氧水平检测

收集生长状态良好的MC3T3-E1细胞，消化并调整细胞悬液浓度。取1mL细胞悬液(20000个细胞/mL)种植在各孔材料表面并根据实验方案，部分孔加入终浓度为0.3mM H

由图6可知，正常情况下，TiO

本发明提供的具氧化还原响应释药功能的生物抗氧化纳米涂层，具有智能化响应性的特点，能有效避免药物暴释，其良好的生物相容性和生物抗氧化性能，能有效降低骨细胞的氧化应激损伤，并促进氧化应激环境下骨组织的修复。