以放射性核素89Zr标记的心肌细胞在药动学中的示踪方法

摘要

本发明提供通过以放射性核素89Zr标记的心肌细胞在药动学中的示踪方法，具体包括向生物体提供包括放射性标记物的受试物，并进行示踪。监测iPSC来源心肌细胞在体内分布规律,通过标记物在细胞进入机体之后的动态分布和细胞疗效之间建立关系,从而有效提高细胞药物的临床疗效,降低风险,减少药物的相互作用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及以放射性核素

背景技术

诱导多能干细胞具有分化成各种功能性细胞的潜能，同样地，诱导多能干细胞通过调节相应的信号通路能够产生具有收缩功能的心肌细胞，具有稳定电生理特性的心肌细胞不仅可以用于研究心脏疾病的发病机理、筛选治疗心脏疾病的药物，甚至可以开展心肌细胞治疗心脏疾病的临床研究，进一步拓展心肌细胞在心肌梗死、心脏衰竭等疾病治疗中的贡献。心肌细胞作为药物治疗心脏疾病的机理尚未清楚，心肌细胞在体内的存活、滞留、增殖、迁移和分布也有待进一步研究，因此有必要对心肌细胞进行示踪标记。

人源心肌细胞具有与小分子、大分子等传统药物不同的生物学特性。传统药物的药代动力学评估药物吸收、分布、代谢的体系并不适于细胞药物的评估。因此无法监测人iPSC来源心肌细胞在体内分布、代谢、排泄规律，进一步的也无法提高细胞药物的临床疗效、降低风险、减少药物的相互作用。

现有的标记方法主要针对传统的药物，针对人源心肌细胞无法进行有效标记，难以有效在细胞药物进入机体之后的动态分布和细胞疗效之间建立关系。针对上述问题，本方案提出一种新的技术方案用于克服上述问题。

发明内容

本发明目的在于通过

向生物体提供受试物；

所述受试物中包括放射性标记物

通过摄取

进一步改进在于，所述心肌细胞由诱导多能干细胞分化而来。

一种对心肌细胞标记和示踪方法，具体方法如下：

S1、细胞复苏：按0.9％氯化钠注射液,20％人血白蛋白以特定比例制成细胞溶媒，细胞溶媒冲洗细胞冻存管，加入细胞重悬液后离心，随后加入细胞溶媒将细胞原液稀释备用；

S2、细胞核素标记：取

S3、受试物注射并生成结果：将受试物

进一步改进在于，S2步骤中制备

进一步改进在于，所述生物体为非人哺乳动物；所述非人哺乳动物可以为鼠、猴、牛、羊或狗。

进一步改进在于，S3步骤中PET显像包括四种分布图像，其中，G1猴、G2猴、KM鼠与NCG鼠分别对应第一图像、第二图像、第三图像与第四图像；并所述第一图像与第二图像监测的时间点一致，所述第三图像与第四图像监测的时间点一致。

进一步改进在于，还包括步骤S4，KM鼠的脏器离体检测，在受试物注射192h后对脏器离体检测并与PET放射物摄取量进行数据对比。

进一步改进在于，所述S1中的细胞原液指的复苏后心肌细胞。

进一步改进在于，所述S1步骤中，氯化钠注射液与人血白蛋白的为特定比例为3∶1。

进一步改进在于，所述标准摄取值(SUV)，确定SUV的方法包括：

确定r，其中r是在来自感兴趣区域(ROI)内通过PET扫描完成后进行图像重建，采用PMOD软件处理图像及数据，获得放射性活动浓度(μCi/g)；定义，放射性活度浓度(即单位体积的放射性活度值)；

确定s，其中s是所注射的受试物的给药剂量(μCi)；

确定w，所述生物体的体重(g)；即，

进一步改进在于，所述受试物的放射性化学纯度(RCP)不低于90％。

进一步改进在于，给药时，受试物稀释液为含5％HSA的生理盐水。

生物体指的是受试者，为非人哺乳动物。

需要说明的是，本发明实施例任一项实施方式所述的心肌细胞，及其所述示踪方法是以非疾病的诊断或治疗为目的。

由以上技术方案可知，本发明的技术方案提供了如下有益效果：

一方面，通过该方法能够实现体内示踪方法的稳定性，并可结合活体PET成像监测细胞在体内分布。另一方面，监测人iPSC来源心肌细胞在体内分布规律,进而通过标记物在细胞进入机体之后的动态分布和细胞疗效之间建立关系,将有效提高细胞药物的临床疗效,降低风险,减少药物的相互作用。

应当理解，前述构思以及在下面更加详细地描述的额外构思的所有组合只要在这样的构思不相互矛盾的情况下都可以被视为本公开的发明主题的一部分。

结合附图从下面的描述中可以更加全面地理解本发明教导的前述和其他方面、实施例和特征。本发明的其他附加方面例如示例性实施方式的特征和/或有益效果将在下面的描述中显见，或通过根据本发明教导的具体实施方式的实践中得知。

附图说明

附图不意在按比例绘制。在附图中，在各个图中示出的每个相同或近似相同的组成部分可以用相同的标号表示。为了清晰起见，在每个图中，并非每个组成部分均被标记。现在，将通过例子并参考附图来描述本发明的各个方面的实施例，其中：

附图1为G1-M-01(以下简称G1)食蟹猴注射给予

附图2为G1、G2食蟹猴分别注射

附图3为KM小鼠注射

附图4为KM小鼠注射

附图5为NCG小鼠在注射

附图6为NCG小鼠在注射

附图7为KM小鼠在192h显像技术后生物分布与勾图数据对比图；(其中，生物分布：各脏器离体检测；勾图数据：PET活体检测)

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图,对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例,本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。除非另作定义,此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性,而只是用来区分不同的组成部分。同样,除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一个”“一”或者“该”等类似词语也不表示数量限制,而是表示存在至少一个。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现在“包括”或者“包含”前面的元件或者物件涵盖出现在“包括”或者“包含”后面列举的特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件,并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。“上”“下”“左”“右”等仅用于表示相对位置关系，当被描述对象的绝对位置改变后,则该相对位置关系也可能相应地改变。

定义：

PET 正电子断层扫描仪

PMOD 医学分析软件

％ID/g 每克组织的百分注射剂量率

SUV 标准摄取值

活度计 测量放射性核素活度的仪器

μCi 微居里，放射性活度的原用单位

ROI 指图像处理中的术语“感兴趣区”

RCP 放射性化学纯度

SUV 标准摄取值

主要材料与试剂：

iPSC-CM：南京艾尔普再生医学科技有限公司提供；

Oxine：于Sigma Aldrich公司购买；

食蟹猴，2只，由米度(南京)生物技术有限公司正常饲养；实验动物使用许可证：SYXK(苏)2017-0065。

KM鼠1只，NCG小鼠1只，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，由江苏省原子医学研究所实验动物中心清洁级环境IVC系统正常饲养。所有动物研究均严格遵守国家法律法规，所有动物实验均经江苏省原子医学研究所实验动物管理与伦理委员会批准。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。除非另外定义，本文所用的全部技术和科学术语都具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

实施例1、生物体标记区分

1)食蟹猴(非人灵长类动物)组织分布实验

正常食蟹猴2只，雄性，每只食蟹猴都有唯一的动物识别号，分别记为G1-M-01与G2-M-01。本试验中食蟹猴分组和给药方案，详见下表1：

表1

2)昆明(KM)小鼠组织分布实验

正常昆明(KM)小鼠1只，雄性，分别记为KM小鼠。本试验中KM小鼠给药方案，详见下表2：

表2

3)免疫缺陷小鼠(NCG小鼠)组织分布实验

正常NCG小鼠1只，雄性，本试验中NCG小鼠给药方案，详见下表3：

表3

实施例2、细胞复苏

(1)从液氮罐取出需要复苏的细胞原液，包括3组心肌细胞(iPSC-CM)，每组均为8×10

(2)在离心管中加入细胞溶媒，所述细胞溶媒按0.9％氯化钠注射液、20％人血白蛋白为3∶1的比例制成，充分混匀后备用；

(3)从干冰中取出细胞原液分别放入冻存管，迅速将冻存管的下1/2没入37℃±1℃水浴中，快速晃动1～2分钟至管中仅剩一小块冰时，将冻存管取出；

(4)用75％酒精擦拭冻存管表面后，使用移液器轻柔吹打5次左右，将每个冻存管中的全部液体分别转移至50mL离心管内；

(5)移液器取1ml细胞溶媒冲洗细胞冻存管，分别将冲洗液缓慢加入上述50ml离心管内；

(6)使用移液器，缓慢加入19mL细胞重悬液，15～25℃，300g离心5min；

(7)离心结束后吸除上清，细胞溶媒重悬后进行计数，加入细胞溶媒将细胞原液稀释至所需浓度，即完成给药制剂。

实施例3、细胞核素标记

取50ul

调节PH＝7，加入200ul HEPES和32.5ul Na

所述HEPES的浓度为0.1mol/L，Na

再加入5uL Oxine，所述Oxine的浓度为5ug/uL，得到

分别取出实施例1中的3组心肌细胞复苏液体，并每组细胞复苏液进行如下标记：

分别取

再用5％人血白蛋白重悬，300g离心1min，离心洗涤3次。

分别制得

受试物给药时稀释液为含5％HSA的生理盐水。

实施例4、注射及其PET显像

第一图像与第二图像在注射后1.5h、2h、4h、8h、24h、2d、3d、8d、14d、21d分别进行PET全身静态扫描。

第三图像与第四图像在注射后1h、4h、6h、16h、24h、40h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h进行PET显像检测。

以上所有扫描时间点原则上与理论时间保持一致，如果有偏差，允许的偏差范围如下:0-4h(含0h及4h)时间点，偏差控制在±5min；4-24h时间点，偏差控制在±10min；≥24h(含24h)时间点，偏差控制在±5％。可实时观测，并减少误差。使用γ计数仪检测反射量，检测细胞组织分布情况

实施例4、勾画主要组织脏器，获取放射性摄取值

PET扫描完成后进行图像重建，采用PMOD软件处理图像及数据，勾画感兴趣区域(ROI)，食蟹猴的感兴趣区域(ROI)包括心脏、肝脏、脾脏、肾脏、全脑、肌肉、膝关节、骨髓和生殖腺等脏器；KM小鼠感兴趣区域(ROI)包括心脏、肺脏、肝脏、脾脏和骨髓；NCG小鼠感兴趣区域(ROI)包括肺脏、肝脏，骨髓和肌肉。获得感兴趣区域(ROI)的放射性活度浓度(即单位体积的放射性活度值)。根据给药剂量计算各脏器每克组织的百分注射剂量率(简称％ID/g值)，或根据动物体重计算各脏器的标准摄取值(简称SUV值)。公式如下：

所述标准摄取值(SUV)，确定SUV方法详细如下：

确定r，其中r是在来自感兴趣区域(ROI)内通过PET扫描完成后进行图像重建，采用PMOD软件处理图像及数据，获得放射性活动浓度(μCi/g)；

确定s，其中s是所注射的受试物的给药剂量(μCi)；

确定w，所述生物体的体重(g)；即，

附图2描述的为标准摄取值(SUV)；附图3、附图5、附图7描述的均为每克组织的百分注射剂量率(简称％ID/g值)，其理论意义一致。

实施例5、PET显像结果与放射性摄取值

G1食蟹猴注射

G2食蟹猴注射给予

从放射性摄取值及其变化趋势来看，食蟹猴G1、G2分别注射

肝脏和脾脏的SUV-平均值(mean)值G1食蟹猴高于G2食蟹猴，且G1食蟹猴肝脏和脾脏的SUV-mean值大体呈现先升后降的趋势，而G2食蟹猴变化不明显；

G1食蟹猴肺的SUV-mean值高于G2食蟹猴，且G1食蟹猴肺的SUV-mean值呈现逐渐下降的趋势，而G2食蟹猴变化不明显；

G1食蟹猴肾脏的SUV-mean低于G2食蟹猴，且G1食蟹猴肾脏的SUV-mean值大体呈现先升后降的趋势，而G2食蟹猴呈现逐渐下降的趋势；

G1食蟹猴肺骨关节的SUV-mean高于G2食蟹猴，两者均呈现先升后降的趋势。详见附图2。

通过对诱导多能干细胞分化的心肌细胞进行标记，将标记后的心肌细胞注入食蟹猴动物体内，借助动物活体成像仪检测细胞注射后放射性标记信号在动物体内的分布，并基于组织中PET扫描图，示踪细胞的体内过程。与单注射

通过附图4可知，KM小鼠注射

通过附图3可知，KM小鼠注射

上述结果表明这种标记后的心肌细胞注入动物体内，放射性摄取值变化趋势同样较为明显。可在生物体内示踪，且具有正常的生物活性，准确反映该细胞的变化过程或分布情况。

通过附图6可知，NCG小鼠心肌注射

通过附图5可知，NCG小鼠心肌注射

实施例6、细胞组织分布(KM小鼠)

小鼠在192h显像结束后立即处死，取KM鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、关节，使用γ计数仪检测反射量，检测细胞组织分布情况。生物分布：各脏器离体检测；勾图数据：PET活体检测。详细参照附图7。

KM小鼠注射

PET勾画摄取值约为离体心脏摄取值的2倍，PET勾画摄取值约与离体肝脏摄取值没有明显差异，离体脾脏摄取值约为PET勾画摄取值的5倍，离体肺脏摄取值约为PET勾画摄取值的2倍，PET勾画摄取值与离体关节摄取值没有明显差异。见附图7。

综上，本发明实现了对于细胞的早期分布，疗效预测，可视化检测等研究。监测人iPSC来源心肌细胞在体内分布规律，在细胞药物进入机体之后的动态分布和细胞疗效之间建立关系,将有效提高细胞药物的临床疗效,降低风险,减少药物的相互作用。放射性同位素标记是稳定的体内示踪方法，结合活体PET成像分析，为监测细胞在体内分布提供有效作用。

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。