一种用于扩增SARS-CoV-2的CAMP引物组及试剂盒

摘要

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于扩增SARS‑CoV‑2的CAMP引物组及试剂盒。该引物组包括以下两种引物组中的一种或两种：针对SARS‑CoV‑2的S区及N区片段扩增的引物组。本发明还提供了用于检测SARS‑CoV‑2病毒的试剂盒。发明利用模拟DNA作为对照检测的过程中，无假阳性现象产生。本发明提供的引物灵敏度和特异性皆很高，所提供的可视化试剂盒将为现场检测提供极大便利，将其制备成为试剂盒可实现对SARS‑CoV‑2快速准确的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于扩增2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的CAMP引物组及试剂盒。

背景技术

SARS-CoV-2为经分离确认的一种新型冠状病毒，该病毒病原传播性强、传播迅速。在一项对41例疫情早期病例的临床研究发现，SARS-CoV-2患者进入ICU的重症患者占比率的31.7％，疾病总死亡率达到14.6％，对公共卫生安全造成极大的威胁。我国现已将其归为乙类法定传染病，并归为甲类传染病管理。由SARS-CoV-2引起的新型冠状病毒肺炎(Coronavirus disease 19,COVID-19)已经成为威胁全人类生命健康的恶行传染性疾病。根据世卫组织实时统计数据，截至北京时间2021年9月19日，全球累计确诊新型冠状病毒肺炎患者超2.28亿例，累计死亡人数超过460万例。新型冠状病毒正严重威胁着人类的生存健康，且可能会长久与人类共存。早期快速诊断新冠病毒感染者，对于限制病毒传播及病人的救治起着至关重要的作用。

截止2020年11月5日，国家药品监督管理局共批准新冠病毒核酸检测试剂24个，抗体检测试剂25个，抗原检测试剂2个。核酸检测试剂中，只有3个应用恒温检测的试剂，其中绝大部分都是应用荧光PCR法作为检测方法。荧光PCR核酸检测法，具备可靠性高等优点，但同时也存在着对试验设备要求高、操作流程复杂、检测时间长，依赖仪器判读结果等限制因素，使得这类检测试剂在经济欠发达地区以及机场、车站等特殊环境的推广使用有一定的困难。核酸恒温扩增技术相较于荧光PCR检测，除了同样具备高特异性和高灵敏度的优点，其操作简易，不依赖高端仪器，检测用时短，可通过肉眼直接判读检测结果的特性，是非常适合仪器设施较欠缺的现场快速检测应用的方法。目前市场上推广的核酸恒温检测类方法有RPA、LAMP等，均为国外专利，在限制了在我国市场的应用推广。

基于竞争性互补配对的核酸恒温扩增技术(Competitive annealing mediatedamplification of nucleic acids，CAMP)是中国科学院过程工程研究所开发的替代日本LAMP核酸扩增的方法(见EP3476938)。该方法在等温条件进行扩增，利用一组数量从2种到6种不同的特异性引物来与靶序列特异识别，30分钟左右完成反应，在反应体系中可以加入可视化染料，在反应结束后，通过肉眼观察试剂颜色判定结果。与其他基因检测方法(如荧光PCR、PCR等)相比，CAMP反应在恒温水浴锅内都可以完成，不需要价格高昂的仪器设备；肉眼可以判定反应结果，不需要通过操作步骤繁多且费时的凝胶电泳法来判定结果；操作简单，没有专业技能的人员也可以顺利完成试验，适合基层医疗机构及地方检验检疫部门的应用。并且，CAMP还可以大大缩短操作时间，减少样品污染机会，适合应用于COVID-19的快速诊断。

发明内容

本发明为了解决上述问题，提供了一种用于扩增SARS-CoV-2 CAMP引物组及试剂盒与应用，本发明提供的引物灵敏度和特异性皆很高，将其制备成为试剂盒可实现对SARS-CoV-2快速准确的检测。

本发明的用于扩增SARS-CoV-2的CAMP引物组，包括针对SARS-CoV-2的S区片段扩增的引物组和/或针对SARS-CoV-2的N区片段扩增的引物组。

优选地，所述引物组针对的片段包括针对如SEQ ID NO.13所示的SARS-CoV-2的S区片段和如SEQ ID NO.14所示的SARS-CoV-2的N区片段。其中，所述针对SARS-CoV-2的S区片段扩增的引物组包括三对引物，分别为：S-F2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，S-R2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；以及，S-NF：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，S-NR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；S-LF：其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，S-LR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.6。

所述针对SARS-CoV-2的N区片段扩增的引物组包括三对引物，分别为：N-F2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，N-R2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；以及，N-NF：其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，N-NR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；N-LF：其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；N-LR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

本发明提供的CAMP引物组针对SARS-CoV-2的特异保守区域(靶基因)，由上述的各自所针对的6条引物组成，包括序列内引物(NF/NR)一组、外引物(F2/R2)一组，环引物(LF/LR)。其中，NF/NR分别为上下游内部引物，由F2区和F1c区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1c区与靶基因5’端的F1c区域序列相同。F2/R2分别为上下游外部引物，由F2区组成，并与靶基因的F2c区域互补。具体核苷酸序列如下表1所示：

表1核苷酸序列

本发明的用于检测SARS-CoV-2的试剂盒，包括上述的CAMP引物组。优选可以将CAMP引物组放入超纯水中制成工作液。所述引物组的工作液可以为含1～20μM的F2、R2引物及5～80μM的NF、NR引物的混合液。

根据本发明所述的试剂盒，其中，还包括CAMP反应液和CAMP显色液。进一步地，所述CAMP反应液包括：Bst聚合酶、AMV反转录酶、CAMP反应缓冲液和超纯水。其中，CAMP反应缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH

具体地，所述CAMP反应液体系中各组分如下：

CAMP反应液(25μL体系，溶剂为超纯水)

20mM Tris-HCl pH8.8

10mM KCl

10mM(NH

2～20mM MgSO

0.1～0.5％Triton X-100

0.2～1M甜菜碱

1～1.6mM dNTP

5～10U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)

5～10U AMV反转录酶(NEW ENGLAND Biolabs)

CAMP显色液可优选SYBR green I，Eva green，羟基萘酚蓝(HNB)和铬黑T(EBT)等中的一种。

在进行检测时，例如可以使用10～15μL的引物组工作液与CAMP反应液组成25μL的检测混合液。CAMP显色液加入量可以是100～150μmol/L检测混合液。

本发明还提供了一种非疾病诊断目的SARS-CoV-2病毒检测方法，包括以下步骤：

1)取核酸样本、所述CAMP引物组的工作液与CAMP反应液、超纯水、CAMP密封液混合，制得扩增反应液；

2)取制得的扩增反应液，先在35～45℃反应20～80min，优选37℃，然后在60～65℃反应20～80min，优选63℃反应60min，根据显色结果判断样品是否含有SARS-CoV-2病毒。

根据本发明所述的检测方法，其中，所述CAMP引物组的工作液中，引物S-F2与S-R2的浓度均为0.2～0.4μM，引物S-NF与S-NR的浓度均为1～2μM，引物S-LF与S-LR的浓度均为1～2μM；引物N-F2与N-R2的浓度均为0.2～0.4μM，引物N-NF与N-NR的浓度均为1～2μM，引物N-LF与N-LR的浓度均为1～2μM；

本发明还提供了上述CAMP引物组用于制备检测SARS-CoV-2病毒的产品中的应用。

本发明还提供了上述用于检测SARS-CoV-2的CAMP试剂盒的应用，尤其是在非疾病诊断目的的SARS-CoV-2病毒检测中的应用。

竞争性互补配对的核酸恒温扩增技术(Competitive annealing mediatedamplification of nucleic acids，CAMP)是2020年4月刚刚获得欧洲专利授权的新的核酸等温扩增方法(见EP3476938)。该方法在63～65℃等温条件进行扩增，利用一组数量从2种到6种不同的特异性引物来与靶序列特异识别，30分钟左右完成反应，在反应体系中可以加入可视化染料，在反应结束后，通过肉眼观察试剂颜色判定结果。本申请针对SARS-CoV-2的S和N蛋白编码序列进行特异引物设计，双基因检测，可以有效避免因病毒发生基因突变而发生的漏检情况的发生。在对人员或环境进行SARS-CoV-2病毒进行检测筛查过程中，只要有一个基因检测表现阳性，那么就显示该样本有可能感染该病毒，从而需进行进一步的确认检测，可以有效避免假阴性检测结果的出现，为确诊和防疫提供更高效的检测方法。

本发明基于CAMP技术，针对SARS-CoV-2的S和N特异保守区域分别设计2组条引物。本发明提供的引物组敏感性高、特异性强，由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中含有的SARS-CoV-2。并且，由于本发明提供的引物组具有极高的特异性，在CAMP扩增所需时间短，进一步缩短了检测的时间，简化了操作。由于本发明提供的方法或试剂盒无需昂贵的仪器、也无需复杂的操作就可完成对SARS-CoV-2的快速准确检测，因此，适用于COVID-19爆发时，专业程度不高的机场、海关、口岸、社区等地的现场快速检测。本发明所提供的可视化试剂盒将为现场检测提供极大便利，将其制备成为试剂盒可实现对SARS-CoV-2快速准确的检测。

附图说明

图1为本发明实施例1中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图2为本发明实施例2中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图3为本发明实施例3中的凝胶电泳图。

图4为本发明实施例4中的可视化检测结果示意图。

本发明获得“中国博士后科学基金新冠肺炎疫情防控专项资助(特别资助)，资助编号：2020T130116ZX”。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，具体可参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1应用Eva Green验证对SARS-CoV-2S的扩增反应

Eva Green同SYBR Green I类似，是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对PCR等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，EvaGreen发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，Eva Green的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链DNA数量。

反应溶液组合(25μL)

20mM Tris-HCl pH8.8

10mM KCl

10mM(NH

14mM MgSO

0.1％Triton X-100

1M甜菜碱

1.25mM dNTP

8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)

1X Eva Green(Biotum)

引物：

200nM S-F2/SEQ ID NO.l

200nM S-R2/SEQ ID NO.2

1600nM S-NF/SEQ ID NO.3

1600nM S-NR/SEQ ID NO.4

800nM S-LF/SEQ ID NO.5

800nM S-LR/SEQ ID NO.6

靶:SARS-CoV-2-S dsDNA/SEQ ID NO.13

同时设置无靶的对照组。

设置ABI StepOne real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例2应用Eva Green验证对SARS-CoV-2N的扩增反应

Eva Green同SYBR Green I类似，是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对PCR等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，EvaGreen发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，Eva Green的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链DNA数量。

反应溶液组合(25μL)

20mM Tris-HCl pH8.8

10mM KCl

10mM(NH

14mM MgSO

0.1％Triton X-100

1M甜菜碱

1.25mM dNTP

8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)

1X Eva Green(Biotum)

引物：

200nM N-F2/SEQ ID NO.7

200nM N-R2/SEQ ID NO.8

1600nM N-NF/SEQ ID NO.9

1600nM N-NR/SEQ ID NO.10

800nM N-LF/SEQ ID NO.11

800nM N-LR/SEQ ID NO.12

靶:SARS-CoV-2-N dsDNA/SEQ ID NO.14

同时设置无靶的对照组。

设置ABI StepOne real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图2所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例3两种2019新冠病毒(SARS-CoV-2)基因目标片段扩增产物的凝胶电泳检测

将实施例1和2中获得的扩增产物经过回收之后进行凝胶电游检测。样品于90mV在GelRed(Biotum)预染的1％琼脂糖凝胶(TAE溶解)电泳1小时。结果在图3中显示，各泳道的标记数字分别对应样品如下：

1：SARS-CoV-2-S的CAMP扩增产物。

2：SARS-CoV-2-N的CAMP扩增产物。

实施例4两种2019新冠病毒基因目的片段的可视化检测

羟基萘酚蓝(HNB)是应用于CAMP技术中可视化检测的指示剂。其原理为：当发生核酸体外扩增反应时，反应体系内会产生大量不溶物焦磷酸镁，从而导致体系内镁离子减少。HNB在扩增体系的溶液中可以因镁离子浓度的不同而显示蓝色或紫罗兰色，因此通过观察反应体系溶液颜色的变化可以监测有无扩增反应发生。当CAMP未发生扩增反应时，体系中镁离子浓度高，反应液呈紫罗兰色；当CAMP发生扩增反应时，体系中镁离子浓度低，反应液呈蓝色。结果如图4所示。

通过以下这些引物组合和试剂进行两种2019新冠病毒基因检测的反应溶液。

反应溶液组合(25μL)

20mM Tris-HCl pH8.8

10mM KCl

10mM(NH

14mM MgSO

0.1％Triton X-100

1M甜菜碱

1.25mM dNTP

8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)

120μM HNB；

以上为可视化检测的所共用的试剂，下述为针对各DNA片段所使用的引物及靶序列：

1)SARS-CoV-2-S基因检测引物：

200nM S-F2/SEQ ID NO.l

200nM S-R2/SEQ ID NO.2

1600nM S-NF/SEQ ID NO.3

1600nM S-NR/SEQ ID NO.4

800nM S-LF/SEQ ID NO.5

800nM S-LR/SEQ ID NO.6

靶:SARS-CoV-2-S dsDNA/SEQ ID NO.13

2)SARS-CoV-2-N基因检测引物：

200nM N-F2/SEQ ID NO.7

200nM N-R2/SEQ ID NO.8

1600nM N-NF/SEQ ID NO.9

1600nM N-NR/SEQ ID NO.10

800nM N-LF/SEQ ID NO.11

800nM N-LR/SEQ ID NO.12

靶:SARS-CoV-2-N dsDNA/SEQ ID NO.14

结果判断：蓝色为阳性，紫色为阴性。结果在图4中显示，各反应管的标记数字分别对应样品如下：

1：SARS-CoV-2-S基因检测的阳性结果

2：SARS-CoV-2-S基因检测无靶对照组的阴性结果。

3：SARS-CoV-2-N基因检测的阳性结果。

4：SARS-CoV-2-N基因检测无靶对照组的阴性结果。

本发明的工艺参数(如温度、时间等)区间上下限取值以及区间值都能实现本法，在此不一一列举实施例。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 中国科学院过程工程研究所

<120> 一种用于扩增SARS-CoV-2的CAMP引物组及试剂盒

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

ccgcatcatt ttccactttt a 21

<210> 2

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<212> DNA

<213> Artificial

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<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

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<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 4

gcgttatagc ttggaattct aacgacttcc taaacaatct atacagg 47

<210> 5

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<212> DNA

<213> Artificial

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taattacaaa tgaatctgca t 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 6

cttgattcta aggttggtgg 20

<210> 7

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<212> DNA

<213> Artificial

<400> 7

ccgcatcatt ttccactttt a 21

<210> 8

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<212> DNA

<213> Artificial

<400> 8

ggtgtgctac cggcctgata g 21

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 9

attctagcag gagaagttcc cccctcatca cgtagtcgca acag 44

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 10

ggggaacttc tcctgctaga atcagcagca gatttcttag tgacag 46

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 11

ctgcctggag ttgaatttc 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

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aaaggccaac aacaacaagg 20

<210> 13

<211> 2100

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 13

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60

agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120

aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180

aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240

aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300

ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360

aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420

ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480

tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540

ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600

tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660

tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720

ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780

ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840

gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900

tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620

ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680

cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740

acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800

ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860

cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920

aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980

gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040

cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100

<210> 14

<211> 770

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 14

gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt caagcctctt 60

ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc agcagtaggg 120

gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct ttgctgctgc 180

ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa caacaaggcc 240

aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa aaacgtactg 300

ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa caaacccaag 360

gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat tggccgcaaa 420

ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt ggcatggaag 480

tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat gacaaagatc 540

caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac aaaacattcc 600

caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa gccttaccgc 660

agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg gatgatttct 720

ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 770