一种巨噬细胞的CRISPR/Cas9表观编辑系统、方法、编辑后的巨噬细胞和应用

摘要

本发明涉及一种巨噬细胞的CRISPR/Cas9表观编辑系统、方法、编辑后的巨噬细胞和应用，属于抗肿瘤技术领域。本发明所述巨噬细胞的CRISPR/Cas9表观编辑系统包括以下组分：PCP‑EZH2、sgRNA‑X‑PP7和dCas9；所述PCP‑EZH2为PCP基因和EZH2基因的融合基因；所述sgRNA‑X‑PP7为用于插入sgRNA的含PP7适配子茎环的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述编辑系统能够从多方面增强巨噬细胞的抗肿瘤效应，促进T细胞等免疫应答，抑制肿瘤生长，显著改善肿瘤的治疗效果。

说明书

技术领域

本发明涉及抗肿瘤技术领域，具体涉及一种巨噬细胞的CRISPR/Cas9 表观编辑系统、方法、编辑后的巨噬细胞和应用。

背景技术

肿瘤是危害人类健康的重要危险因素之一。其发病率仅次于心脑血管疾病，位居第二位。然而传统的放疗、化疗及靶向药物等治疗方式都很难做到完全抑制肿瘤的作用。近年来，肿瘤免疫治疗受到越来越广泛的关注。免疫治疗是与以往的传统治疗完全不同的一类全新肿瘤治疗模式，其主要机制是改变肿瘤微环境，从而使机体自身的免疫功能重新发挥作用，达到杀伤肿瘤细胞的目的。正常机体的免疫系统具有免疫监视功能，即能够识别、杀伤并及时清除体内包括肿瘤细胞在内的异常增生细胞。随着肿瘤的进展，多种免疫细胞可以参与抑制抗肿瘤免疫，从而促进肿瘤的生长、侵袭和转移。

肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-Associated Macrophages，TAMs)是肿瘤免疫微环境中所占比例最多的免疫细胞，参与了肿瘤的生成、增殖、转移和耐药等多种生物学行为。长久以来研究认为巨噬细胞的发育来源是成年之后的造血系统，即骨髓中的HSC和外周血中的单核前体细胞。随着遗传修饰小鼠的应用，研究发现了定植于组织中的成熟巨噬细胞，随着个体的发育，巨噬细胞分别来源于三种不同的途径(来自卵黄囊和胎肝中的红细胞祖细胞(Erythro-myeloid progenitor，EMP)，以及来自骨髓中的巨噬细胞/树突细胞祖细胞(macrophage/dendritic cell progenitor cells，MDP)。在肿瘤发展过程中，TAMs可能来源于胚胎或单核细胞来源的组织定植巨噬细胞，这些巨噬细胞可能在癌发生过程中发生表型和活化状态的变化(组织驻留TAMs)，或来自经历明显分化的单核细胞，最终成为促进肿瘤生长的巨噬细胞。

机体组织中的巨噬细胞具有表型可变和功能多样的重要特征，在不同的环境刺激下，巨噬细胞可极化成具有不同分子表型和功能的两个亚型：M1 型(经典活化型)和M2型(替代活化型)。M1巨噬细胞由IFNγ及其他促炎刺激因素诱导，其表型特点为白介素(interleukin,IL)12，IL-23，IL-10 等。M1型的主要功能是有效呈递抗原，特异性表达一氧化氮合成酶2 (NOS2)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、IL-6等标记分子。除此之外，M1型巨噬细胞可激活Th1反应，并且通常介导抗肿瘤反应。相反，M2型巨噬细胞由IL-10，糖皮质激素，IL-4和IL-13等因素诱导，其特异性表达精氨酸酶1(ARG1)、血管内皮生长因子(VEGF)、甘露糖受体(CD206)和TGF β等标记分子，这些表型参与受损组织的重塑和修复，寄生虫抗性，免疫调节和促肿瘤增殖。对于TAMs而言，肿瘤微环境中影响其极化的主要因素有三种：1)免疫相关信号是TAMs极化的关键决定因素；这些包括通过免疫细胞以及肿瘤和基质细胞本身在肿瘤部位释放的细胞因子，趋化因子和其他调节分子。值得注意的是，干细胞也可以是这些信号的来源(例如，通过神经胶质瘤干细胞释放POSTN)。2)代谢信号如乳酸(有氧糖酵解的副产物)也可以调控TAM影响肿瘤的发生发展。3)在自发(对于免疫原性肿瘤)或治疗诱发的肿瘤细胞死亡时释放的死亡信号可以激活TAMs，可以介导其促炎功能。

研究表明，表达经典巨噬细胞标记物的TAMs在不同环境下具有不同的功能，包括增加血管生成，引起肿瘤免疫抑制，增强肿瘤侵袭迁移等。其中， TAMs的主要致病活性是抑制肿瘤免疫应答。TAMs表达一系列抑制抗肿瘤免疫反应的效应分子；这包括细胞表面受体，细胞因子，趋化因子和酶。TAMs 表达PD-1和CTLA-4的配体，其在激活时抑制T细胞，NKT细胞和NK细胞的细胞毒性功能；TAMs表达死亡受体FAS和TRAIL的配体，其在靶细胞中触发caspase8依赖性细胞死亡(细胞凋亡)；TAMs表达与T细胞上的 ILT2和NK细胞上的CD94结合的配体从而抑制NK细胞和T细胞的功能；TAMs分泌细胞因子IL-10和TGFβ，从而抑制T细胞效应功能和诱导调节功能；TAMs还分泌趋化因子CCL5，CCL20，CCL22，从而募集nTreg细胞；TAMs分泌精氨酸酶I，其通过消耗精氨酸使T细胞中的TCR失活。综上，巨噬细胞可以作为建立肿瘤干预策略的新方向。

现有研究干预TAMs的方法有以下三个类型：第一种方法是对TAMs的消耗。其中，靶向CSF1-CSF1R轴是一种很有前景的策略，尤其是在高表达CSF1的肿瘤中，例如滑膜巨细胞瘤，这种靶向方式将作为一种有效的治疗思路。然而，由于长时间耗尽体内所有的巨噬细胞存在毒性作用，限制了药物剂量的增加，使该方法存在显著的局限性。另一种方法是应用二磷酸盐选择性地消耗TAMs。由于二磷酸盐是稳定的，并且它的结构与骨基质的焦磷酸酶相同，因此可以被破骨细胞快速代谢并抑制其再吸收。研究表明，将氯膦酸盐包裹在例如脂质体(clodrolip)中，由于它们的吞噬活性会优先被巨噬细胞摄取。会显著减少肺癌的骨转移和乳腺癌的肺转移的实验模型中的巨噬细胞肿瘤浸润，从而限制了肿瘤转移。第二种方法是抑制TAMs的募集。最常用的方式是对CCL2-CCR2轴的抑制，然而CCL2的抑制剂会引起单核细胞反馈性增加，并且会出现组织中巨噬细胞增殖，从而增加巨噬细胞的浸润。第三种方法是巨噬细胞的重构。该方式可以重新平衡肿瘤微环境的免疫浸润，并且可以克服巨噬细胞清除剂引起的长期毒性以及CCL2-CCR2抑制剂引起的反馈性巨噬细胞增多。重构巨噬细胞的方式众多，其中最具代表性的是抗CD47抗体的应用。CD47是一种调节细胞迁移，轴突延伸，细胞因子的产生和T细胞活化的蛋白。CD47与血小板反应蛋白1和信号调节蛋白- α(SIRPα；也称为SHPS1)相互作用，这种相互作用的结果是“不要吃我”信号，以防止自体细胞在稳态条件下的吞噬作用。肿瘤细胞中的CD47过表达，CD47的抗体可有效增强巨噬细胞的吞噬作用，进一步促进抗肿瘤免疫效应。然而，该类方法存在一个共同问题是，巨噬细胞在减少肿瘤的同时，也会消灭血液循环中的血细胞，引起贫血甚至是自身免疫系统疾病。因此，寻找一种新的靶向TAMs的方法是目前研究的重要方向。

肿瘤相关的巨噬细胞是肿瘤免疫微环境的重要组成部分，恢复巨噬细胞的抗肿瘤作用有望成为肿瘤治疗的重要方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种巨噬细胞的CRISPR/Cas9表观编辑系统、方法、编辑后的巨噬细胞和应用。本发明所述编辑系统能够从多方面增强巨噬细胞的抗肿瘤效应，促进T细胞等免疫应答，抑制肿瘤生长，显著改善肿瘤的治疗效果。

本发明提供了一种巨噬细胞的CRISPR/Cas9表观编辑系统，所述系统包括以下组分：PCP-EZH2、sgRNA-X-PP7和dCas9；所述PCP-EZH2为PCP 基因和EZH2基因的融合基因，所述PCP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示；所述EZH2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述sgRNA-X-PP7 为用于插入sgRNA的含PP7适配子茎环的基因，核苷酸序列如SEQID NO.1 所示；所述dCas9的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种靶向巨噬细胞特定基因的CRISPR/Cas9表观编辑系统，所述系统包括以下组分：PCP-EZH2、sgRNA-PP7和dCas9；所述 PCP-EZH2为PCP基因和EZH2基因的融合基因，所述PCP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述EZH2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4 所示；所述sgRNA-PP7为插入能靶向巨噬细胞特定基因的sgRNA的含PP7 适配子茎环的基因，还未插入靶向巨噬细胞特定基因的sgRNA的含PP7适配子茎环的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述dCas9的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种靶向巨噬细胞HIF1α启动子区的CRISPR/Cas9表观编辑系统，所述系统包括以下组分：PCP-EZH2、sgRNA-HIF1α-PP7和 dCas9；所述PCP-EZH2为PCP基因和EZH2基因的融合基因，所述PCP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述EZH2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述sgRNA-HIF1α-PP7为插入了靶向巨噬细胞HIF1α的sgRNA的含PP7适配子茎环的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述dCas9的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了基于上述技术方案所述系统的巨噬细胞的 CRISPR/Cas9表观编辑载体系统，所述载体系统包括：sgRNA-X-PP7表达载体或sgRNA-PP7表达载体或sgRNA-HIF1α-PP7表达载体和PCP-EZH2表达载体、dCas9表达载体。

本发明还提供了基于上述技术方案所述载体系统的巨噬细胞的编辑方法，包括以下步骤：将sgRNA-X-PP7表达载体或sgRNA-PP7表达载体或 sgRNA-HIF1α-PP7表达载体和PCP-EZH2表达载体、dCas9表达载体转染到巨噬细胞中。

本发明还提供了利用上述技术方案所述编辑方法制备得到的巨噬细胞。

本发明还提供了上述技术方案所述系统或上述技术方案所述载体系统在制备促进巨噬细胞向M1极化和/或增强巨噬细胞吞噬能力和/或恢复巨噬细胞杀伤肿瘤能力的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述系统或上述技术方案所述载体系统或上述技术方案所述巨噬细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述系统或上述技术方案所述载体系统或上述技术方案所述巨噬细胞在制备抑制肿瘤生长和/或减少肿瘤血管生成的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述系统或上述技术方案所述载体系统或上述技术方案所述巨噬细胞在制备解除肿瘤免疫抑制和/或促进免疫细胞对肿瘤的杀伤作用的药物中的应用。

本发明提供了一种巨噬细胞的CRISPR/Cas9表观编辑系统。本发明应用 CRISPR/Cas9表观遗传编辑技术，针对多个基因对巨噬细胞进行改造，将巨噬细胞作为基因递送的载体，使肿瘤微环境发生功能性的多元改变：1)抑制T细胞PD1表达，增强T细胞对肿瘤的杀伤作用；2)促进巨噬细胞向 M1型极化，增强其对肿瘤的杀伤作用；3)抑制肿瘤血管的生成；从而从多个方面增强巨噬细胞的抗肿瘤效应，促进T细胞免疫应答，抑制肿瘤生长，显著改善肿瘤的治疗效果。

本发明所述系统还具有以下有益效果：

(1)巨噬细胞来源广泛：巨噬细胞是肿瘤微环境中含量最多的免疫细胞，可来源于外周血或者骨髓；

(2)稳定性：表观遗传学水平稳定调控基因表达；

(3)无MHC限制性：巨噬细胞作为一类固有免疫细胞，无MHC限制性；

(4)发挥多元免疫效应：改造后的巨噬细胞可促进内源性巨噬细胞吞噬功能，抑制血管生成，解除肿瘤微环境的抑制效应，全方位抑制肿瘤进展。

附图说明

图1为本发明提供的CRISPR/Cas9-EZH2系统各载体结构示意图；

图2为本发明提供的CRISPR/Cas9-EZH2系统组成示意图；

图3为本发明提供的sgRNA序列示意图；

图4为本发明提供的验证CRISPR/Cas9-EZH2系统成功构建，其中，A 为WesternBlot检测dCas9和PCP-EZH2的表达；B为qRT-PCR检测sgRNA 的表达；C为感染表达CRISPR/dCas9-EZH2系统的病毒后，HIF1αmRNA 水平的表达变化；D为Western Blot检测感染表达CRISPR/dCas9-EZH2系统的病毒后，HIF1α蛋白水平的表达变化；

图5为本发明提供的CRISPR/Cas9-EZH2系统持续性验证，其中，A为实验流程图，B为qRT-PCR对CRISPR/Cas9-EZH2系统持续时间的检测；

图6为本发明提供的小鼠模型、肿瘤变化及小鼠生存情况图，A为构建 Luc+B16-F10荷瘤小鼠模型，于荷瘤后第12天注射巨噬细胞；B于荷瘤后第12天注射MΦ

具体实施方式

本发明提供了一种巨噬细胞的CRISPR/Cas9表观编辑系统，所述系统包括以下组分：PCP-EZH2、sgRNA-X-PP7和dCas9；所述PCP-EZH2为PCP 基因和EZH2基因的融合基因；所述PCP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示： ATGTCTCTCGAGATGCCCAAAAAGAAAAGAAAAGTGGGTAGTATGGGT TCCAAAACCATCGTTCTTTCGGTCGGCGAGGCTACTCGCACTCTGACT GAGATCCAGTCCACCGCAGACCGTCAGATCTTCGAAGAGAAGGTCGG GCCTCTGGTGGGTCGGCTGCGCCTCACGGCTTCGCTCCGTCAAAACGG AGCCAAGACCGCGTATCGCGTCAACCTAAAACTGGATCAGGCGGACGT CGTTGATTCCGGACTTCCGAAAGTGCGCTACACTCAGGTATGGTCGCA CGACGTGACAATCGTTGCGAATAGCACCGAGGCCTCGCGCAAATCGTT GTACGATTTGACCAAGTCCCTCGTCGCGACCTCGCAGGTCGAAGATCT TGTCGTCAACCTTGTGCCGCTGGGCCGTGGTGGCGGAGGGACTAGTGG AGGT，所述EZH2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示(EZH2CDS NM_001203247.1)： ATGGGCCAGACTGGGAAGAAATCTGAGAAGGGACCAGTTTGTTGGCG GAAGCGTGTAAAATCAGAGTACATGCGACTGAGACAGCTCAAGAGGT TCAGACGAGCTGATGAAGTAAAGAGTATGTTTAGTTCCAATCGTCAGA AAATTTTGGAAAGAACGGAAATCTTAAACCAAGAATGGAAACAGCGA AGGATACAGCCTGTGCACATCCTGACTTCTGTGAGCTCATTGCGCGGG ACTAGGGAGTGTTCGGTGACCAGTGACTTGGATTTTCCAACACAAGTC ATCCCATTAAAGACTCTGAATGCAGTTGCTTCAGTACCCATAATGTATTC TTGGTCTCCCCTACAGCAGAATTTTATGGTGGAAGATGAAACTGTTTTA CATAACATTCCTTATATGGGAGATGAAGTTTTAGATCAGGATGGTACTTT CATTGAAGAACTAATAAAAAATTATGATGGGAAAGTACACGGGGATAG AGAATGTGGGTTTATAAATGATGAAATTTTTGTGGAGTTGGTGAATGCC CTTGGTCAATATAATGATGATGACGATGATGATGATGGAGACGATCCTG AAGAAAGAGAAGAAAAGCAGAAAGATCTGGAGGATCACCGAGATGAT AAAGAAAGCCGCCCACCTCGGAAATTTCCTTCTGATAAAATTTTTGAA GCCATTTCCTCAATGTTTCCAGATAAGGGCACAGCAGAAGAACTAAAG GAAAAATATAAAGAACTCACCGAACAGCAGCTCCCAGGCGCACTTCCT CCTGAATGTACCCCCAACATAGATGGACCAAATGCTAAATCTGTTCAGA GAGAGCAAAGCTTACACTCCTTTCATACGCTTTTCTGTAGGCGATGTTT TAAATATGACTGCTTCCTACATCCTTTTCATGCAACACCCAACACTTATA AGCGGAAGAACACAGAAACAGCTCTAGACAACAAACCTTGTGGACCA CAGTGTTACCAGCATTTGGAGGGAGCAAAGGAGTTTGCTGCTGCTCTC ACCGCTGAGCGGATAAAGACCCCACCAAAACGTCCAGGAGGCCGCAG AAGAGGACGGCTTCCCAATAACAGTAGCAGGCCCAGCACCCCCACCAT TAATGTGCTGGAATCAAAGGATACAGACAGTGATAGGGAAGCAGGGAC TGAAACGGGGGGAGAGAACAATGATAAAGAAGAAGAAGAGAAGAAA GATGAAACTTCGAGCTCCTCTGAAGCAAATTCTCGGTGTCAAACACCA ATAAAGATGAAGCCAAATATTGAACCTCCTGAGAATGTGGAGTGGAGT GGTGCTGAAGCCTCAATGTTTAGAGTCCTCATTGGCACTTACTATGACA ATTTCTGTGCCATTGCTAGGTTAATTGGGACCAAAACATGTAGACAGGT GTATGAGTTTAGAGTCAAAGAATCTAGCATCATAGCTCCAGCTCCCGCT GAGGATGTGGATACTCCTCCAAGGAAAAAGAAGAGGAAACACCGGTT GTGGGCTGCACACTGCAGAAAGATACAGCTGAAAAAGGACGGCTCCT CTAACCATGTTTACAACTATCAACCCTGTGATCATCCACGGCAGCCTTG TGACAGTTCGTGCCCTTGTGTGATAGCACAAAATTTTTGTGAAAAGTTT TGTCAATGTAGTTCAGAGTGTCAAAACCGCTTTCCGGGATGCCGCTGC AAAGCACAGTGCAACACCAAGCAGTGCCCGTGCTACCTGGCTGTCCG AGAGTGTGACCCTGACCTCTGTCTTACTTGTGGAGCCGCTGACCATTG GGACAGTAAAAATGTGTCCTGCAAGAACTGCAGTATTCAGCGGGGCTC CAAAAAGCATCTATTGCTGGCACCATCTGACGTGGCAGGCTGGGGGAT TTTTATCAAAGATCCTGTGCAGAAAAATGAATTCATCTCAGAATACTGT GGAGAGATTATTTCTCAAGATGAAGCTGACAGAAGAGGGAAAGTGTAT GATAAATACATGTGCAGCTTTCTGTTCAACTTGAACAATGATTTTGTGG TGGATGCAACCCGCAAGGGTAACAAAATTCGTTTTGCAAATCATTCGGT AAATCCAAACTGCTATGCAAAAGTTATGATGGTTAACGGTGATCACAG GATAGGTATTTTTGCCAAGAGAGCCATCCAGACTGGCGAAGAGCTGTT TTTTGATTACAGATACAGCCAGGCTGATGCCCTGAAGTATGTCGGCATC GAAAGAGAAATGGAAATCCCTTGA；所述sgRNA-X-PP7为用于插入 sgRNA的含PP7适配子茎环的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示： GAAGACTTCACCGGAGACGGGATACCGTCTCTGTTTTAGAGCTATAAG GAGTTTATATGGAAACCCTTATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTT ATCAACTTGGCCTAAGGAGTTTATATGGAAACCCTTAGGCCAAGTGGC ACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGTTTAAGTCTTC；所述dCas9的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示 GAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGAGCGCCAGGCAAAAAAG AAAAAGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGCCATCGGCACCAACTC TGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGA AATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAAC CTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCAC CCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAAC CGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTG GACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGA GGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACG AGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGA AACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGG CCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCG ACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTG GTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAG CGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCA GACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAAT GGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAAC TTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAG CAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCG GCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACG CCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGG CCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGG ACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGT ACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACA TTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCA TCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAAC AGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCAT CCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCA GGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAA GATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGG AAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCA CCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAG AGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAG AAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCC CGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTT CAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACT TCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAG ATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTAT CAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGG AAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCG AGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATG AAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCG GAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCC TGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCC AGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGG CCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTG GTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACAT CGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGA AGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGA GCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGC TGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATA TGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATG TGGACCACATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACA ACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGGCCCGGGGCAAGAGCGACAA CGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGC AGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGA CCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTC ATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGC ACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAA GCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTC CGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAA CTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGC CCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGA CTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGG AAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGC GGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGAT AAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCA AGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCA AAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAA AGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACC GTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCC AAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGA AAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGG GCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACT CCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGT GAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCC CGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACT ACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGA TCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGC ACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGT TTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACAC CACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACG CCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGAC。

本发明还提供了一种靶向巨噬细胞特定基因的CRISPR/Cas9表观编辑系统，所述系统包括以下组分：PCP-EZH2、sgRNA-PP7和dCas9；所述 PCP-EZH2为PCP基因和EZH2基因的融合基因，所述PCP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述EZH2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4 所示；所述sgRNA-PP7为插入能靶向巨噬细胞特定基因的sgRNA的含PP7 适配子茎环的基因，还未插入靶向巨噬细胞特定基因的sgRNA的含PP7适配子茎环的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述dCas9的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。sgRNA-PP7中插入了能靶向巨噬细胞特定基因的 sgRNA后，能够特异靶向巨噬细胞效应基因的启动子区，增强巨噬细胞的抗肿瘤效应，促进T细胞等免疫应答，抑制肿瘤生长，显著改善肿瘤的治疗效果。

本发明还提供了一种靶向巨噬细胞HIF1α启动子区的CRISPR/Cas9表观编辑系统，所述系统包括以下组分：PCP-EZH2、sgRNA-HIF1α-PP7和 dCas9；所述PCP-EZH2为PCP基因和EZH2基因的融合基因，所述PCP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述EZH2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述sgRNA-HIF1α-PP7为插入了靶向巨噬细胞HIF1α的sgRNA的含PP7适配子茎环的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示 CACCGACGTGGGCTGGGGTGGGGCCGTTTTAGAGCTATAAGGAGTTTA TATGGAAACCCTTATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACT TGGCCTAAGGAGTTTATATGGAAACCCTTAGGCCAAGTGGCACCGAGT CGGTGCTTTTTTTGTTT；所述dCas9的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。在本发明中，所述sgRNA-HIF1α-PP7为sgRNA-PP7中插入了能靶向巨噬细胞HIF1α启动子区的sgRNA序列(Mus-Hif1a-sgRNA，如表1所示)，本发明所述系统为靶向HIF1α启动子区的CRISPR/dCas9-EZH2系统，本发明构建的靶向HIF1α启动子区的CRISPR/dCas9-EZH2系统可将组蛋白H3K27甲基转移酶EZH2带至靶点，实现HIF1α启动子区组蛋白甲基化修饰，如图2 所示。本发明所述系统对巨噬细胞进行改造后，可促进内源性巨噬细胞吞噬功能，抑制血管生成，解除肿瘤微环境的抑制效应，全方位抑制肿瘤进展。

本发明还提供了基于上述技术方案所述系统的巨噬细胞的 CRISPR/Cas9表观编辑载体系统，所述载体系统包括：sgRNA-X-PP7表达载体或sgRNA-PP7表达载体或sgRNA-HIF1α-PP7表达载体和PCP-EZH2表达载体、dCas9表达载体。如图1所示，图1上图表示的是插入sgRNA的载体结构示意图，具体为插入了HIF1αsgRNA的载体结构示意图，中间的图为插入了dCas9的载体结构示意图，最下边的图为插入了PCP-EZH2的载体示意图。

本发明还提供了基于上述技术方案所述载体系统的巨噬细胞的编辑方法，包括以下步骤：将sgRNA-X-PP7表达载体或sgRNA-PP7表达载体或 sgRNA-HIF1α-PP7表达载体和PCP-EZH2表达载体、dCas9表达载体转染到巨噬细胞中。在本发明中，所述PCP-EZH2表达载体的骨架载体优选包括 pWPI载体(Addgene#12254)。在本发明中，所述dCas9表达载体的骨架载体优选包括pWPI载体(Addgene#12254)。本发明对PCP-EZH2表达载体和 dCas9表达载体的制备方法没有特殊的限定，采用常规表达载体制备方法进行制备即可。在本发明中，所述sgRNA-X-PP7表达载体或sgRNA-PP7表达载体或sgRNA-HIF1α-PP7表达载体的骨架载体优选包括lenti sgRNA(MS2)_Zeo backbone。在本发明中，所述sgRNA-X-PP7表达载体的制备方法优选包括：设计酶切位点(表2中标记下划线的序列：

本发明还提供了利用上述技术方案所述编辑方法制备得到的巨噬细胞。本发明制备得到的巨噬细胞吞噬功能得到提升，能够抑制血管生成，解除肿瘤微环境的抑制效应，全方位抑制肿瘤进展。

本发明还提供了上述技术方案所述系统或上述技术方案所述载体系统在制备促进巨噬细胞向M1极化和/或增强巨噬细胞吞噬能力和/或恢复巨噬细胞杀伤肿瘤能力的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述系统或上述技术方案所述载体系统或上述技术方案所述巨噬细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述系统或上述技术方案所述载体系统或上述技术方案所述巨噬细胞在制备抑制肿瘤生长和/或减少肿瘤血管生成的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述系统或上述技术方案所述载体系统或上述技术方案所述巨噬细胞在制备解除肿瘤免疫抑制和/或促进免疫细胞对肿瘤的杀伤作用的药物中的应用。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种巨噬细胞的CRISPR/Cas9表观编辑系统、方法、编辑后的巨噬细胞和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

构建基于CRISPR/Cas9表观编辑系统的巨噬细胞

首先设计对照基因以及能够结合在HIF1α启动子区域的sgRNA(表1)。用sgRNA-X-PP7序列(表2)替换lenti sgRNA(MS2)_Zeo backbone (Addgene##61427)质粒中的MS2适配子，将设计好的sgRNA(如表1所示，包括Mus-Hif1a-sgRNA和对照Mus-luciferase-sgRNA)分别连接到重组后的lenti sgRNA(PP7)_Zeo backbone质粒中，通过测序确认构建成功(图3)，图3为本发明提供的sgRNA序列示意图，说明sgRNA成功插入至lenti sgRNA(PP7)_Zeobackbone载体的sgRNA-X-PP7中。

表1 sgRNA序列

表2 sgRNA-X-PP7序列

其次，从lenti dCAS-VP64_Blast(Addgene#61425)质粒中扩增含有D10A 和H840A的dCas9并将其插入到pWPI载体中。表达PCP-EZH2序列的pWPI 质粒由南京金斯瑞公司合成。

构建得到靶向HIF1α启动子区的CRISPR/dCas9-EZH2载体系统：(1) sgRNAs靶向的目的基因座以及2×PP7适配子茎环；(2)含有D10A和H840A 的核酸酶无效的Cas9蛋白(dCas9)以及其后的核定位信号；(3)与PP7外壳蛋白(PCP)融合的EZH2。具体结构如图2所示，图2为CRISPR/Cas9-EZH2 系统组成示意图。PCP结合sgRNA-PP7的茎环结构，一个茎环可以结合两个PCP蛋白，即一个sgRNA-PP7结构可以结合四个PCP-EZH2。

同时转染以上质粒进入小鼠骨髓来源巨噬细胞，并筛选出稳定表达的细胞株。通过qRT-PCR检测sgRNA的表达，用Western Blot检测dcas9和 PCP-EZH2的表达；利用ChIP分析HIF1α启动子甲基化，通过qRT-PCR和 WesternBlot检测HIF1α在转染CRISPR/dCas9-EZH2前后的表达差异，从而确定CRISPR/dCas9-EZH2系统是否成功构建以及其在慢病毒共感染的细胞中是否稳定表达。图4为验证CRISPR/Cas9-EZH2系统成功构建，其中， A为WesternBlot检测dCas9和PCP-EZH2的表达，结果表明相较于对照组，感染表达CRISPR/Cas9-EZH2系统的病毒组，其dCas9及PCP-EZH2蛋白表达水平明显升高；B为qRT-PCR检测sgRNA的表达，结果发现，感染表达 lenti sgRNA(PP7)_Zeo backbone病毒组的sgRNA表达水平显著升高；C qRT-PCR表明感染表达CRISPR/dCas9-EZH2系统的病毒后，HIF1α在mRNA水平的表达显著下降；D为Western Blot检测感染表达CRISPR/ dCas9-EZH2系统的病毒后，HIF1α蛋白水平的表达明显降低。综上，本发明成功构建了靶向沉默HIF1α的CRISPR/Cas9-EZH2的表观编辑系统。

实施例2

构建好的靶向沉默HIF1α的表观编辑系统感染至原代巨噬细胞中，发现该系统对巨噬细胞HIF1α有至少3天的沉默作用。结果如图5所示，图5 为CRISPR/Cas9-EZH2系统持续性验证；其中，A为实验流程图，分别在感染后第0h，6h，12h，24h，36h，48h，72h检测HIF1α的表达。B为qRT-PCR 对CRISPR/Cas9-EZH2系统持续时间的检测。

实施例3

检测HIF1α表观沉默修饰对肿瘤相关巨噬细胞免疫调控功能的改变

将表观沉默系统感染至CoCl

实施例4

利用B16-F10黑色素瘤荷瘤模型在体内验证HERMs的治疗效果。

首先，将GFP转基因小鼠骨髓来源的巨噬细胞过继性注射至肿瘤内，检测巨噬细胞在肿瘤内的分布情况。流式及免疫荧光结果表明GFP小鼠骨髓来源的巨噬细胞可以在肿瘤组织中持续存在至少12天。本发明研究表明在荷瘤后第12天HIF1α的表达发生变化，因此本发明选择于第12天过继性注射HERMs，通过活体成像和大体形态观察HERMs注射后肿瘤大小的变化，并对小鼠进行生存分析，结果表示过继性注射HERMs可以显著抑制肿瘤生长。随后本发明通过免疫荧光及流式分析了HERMs对肿瘤免疫的改变，结果表明过继性注射HERMs显著增强效应T细胞的数量，抑制了Treg 的数量以及与肿瘤免疫抑制相关的PD1的表达。同时，过继性HERMs治疗可以显著减少肿瘤血管生成。综上，过继性HERMs治疗解除肿瘤免疫抑制，促进免疫细胞对肿瘤的杀伤作用，从而产生杀伤肿瘤的作用。

将表观编辑的巨噬细胞输注入B16-F10黑色素瘤小鼠体内，观察肿瘤变化及小鼠生存情况，结果如图6所示，其中，A为构建Luc+B16-F10荷瘤小鼠模型，于荷瘤后第12天注射巨噬细胞；B于荷瘤后第12天注射 MΦ

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国人民解放军空军军医大学

<120> 一种巨噬细胞的CRISPR/Cas9表观编辑系统、方法、编辑后的巨噬细胞和应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 177

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaagacttca ccggagacgg gataccgtct ctgttttaga gctataagga gtttatatgg 60

aaacccttat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttggcct aaggagttta 120

tatggaaacc cttaggccaa gtggcaccga gtcggtgctt tttttgttta agtcttc 177

<210> 2

<211> 4153

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaaaggccg gcggccacga aaaaggccga gcgccaggca aaaaagaaaa aggacaagaa 60

gtacagcatc ggcctggcca tcggcaccaa ctctgtgggc tgggccgtga tcaccgacga 120

gtacaaggtg cccagcaaga aattcaaggt gctgggcaac accgaccggc acagcatcaa 180

gaagaacctg atcggagccc tgctgttcga cagcggcgaa acagccgagg ccacccggct 240

gaagagaacc gccagaagaa gatacaccag acggaagaac cggatctgct atctgcaaga 300

gatcttcagc aacgagatgg ccaaggtgga cgacagcttc ttccacagac tggaagagtc 360

cttcctggtg gaagaggata agaagcacga gcggcacccc atcttcggca acatcgtgga 420

cgaggtggcc taccacgaga agtaccccac catctaccac ctgagaaaga aactggtgga 480

cagcaccgac aaggccgacc tgcggctgat ctatctggcc ctggcccaca tgatcaagtt 540

ccggggccac ttcctgatcg agggcgacct gaaccccgac aacagcgacg tggacaagct 600

gttcatccag ctggtgcaga cctacaacca gctgttcgag gaaaacccca tcaacgccag 660

cggcgtggac gccaaggcca tcctgtctgc cagactgagc aagagcagac ggctggaaaa 720

tctgatcgcc cagctgcccg gcgagaagaa gaatggcctg ttcggcaacc tgattgccct 780

gagcctgggc ctgaccccca acttcaagag caacttcgac ctggccgagg atgccaaact 840

gcagctgagc aaggacacct acgacgacga cctggacaac ctgctggccc agatcggcga 900

ccagtacgcc gacctgtttc tggccgccaa gaacctgtcc gacgccatcc tgctgagcga 960

catcctgaga gtgaacaccg agatcaccaa ggcccccctg agcgcctcta tgatcaagag 1020

atacgacgag caccaccagg acctgaccct gctgaaagct ctcgtgcggc agcagctgcc 1080

tgagaagtac aaagagattt tcttcgacca gagcaagaac ggctacgccg gctacattga 1140

cggcggagcc agccaggaag agttctacaa gttcatcaag cccatcctgg aaaagatgga 1200

cggcaccgag gaactgctcg tgaagctgaa cagagaggac ctgctgcgga agcagcggac 1260

cttcgacaac ggcagcatcc cccaccagat ccacctggga gagctgcacg ccattctgcg 1320

gcggcaggaa gatttttacc cattcctgaa ggacaaccgg gaaaagatcg agaagatcct 1380

gaccttccgc atcccctact acgtgggccc tctggccagg ggaaacagca gattcgcctg 1440

gatgaccaga aagagcgagg aaaccatcac cccctggaac ttcgaggaag tggtggacaa 1500

gggcgcttcc gcccagagct tcatcgagcg gatgaccaac ttcgataaga acctgcccaa 1560

cgagaaggtg ctgcccaagc acagcctgct gtacgagtac ttcaccgtgt ataacgagct 1620

gaccaaagtg aaatacgtga ccgagggaat gagaaagccc gccttcctga gcggcgagca 1680

gaaaaaggcc atcgtggacc tgctgttcaa gaccaaccgg aaagtgaccg tgaagcagct 1740

gaaagaggac tacttcaaga aaatcgagtg cttcgactcc gtggaaatct ccggcgtgga 1800

agatcggttc aacgcctccc tgggcacata ccacgatctg ctgaaaatta tcaaggacaa 1860

ggacttcctg gacaatgagg aaaacgagga cattctggaa gatatcgtgc tgaccctgac 1920

actgtttgag gacagagaga tgatcgagga acggctgaaa acctatgccc acctgttcga 1980

cgacaaagtg atgaagcagc tgaagcggcg gagatacacc ggctggggca ggctgagccg 2040

gaagctgatc aacggcatcc gggacaagca gtccggcaag acaatcctgg atttcctgaa 2100

gtccgacggc ttcgccaaca gaaacttcat gcagctgatc cacgacgaca gcctgacctt 2160

taaagaggac atccagaaag cccaggtgtc cggccagggc gatagcctgc acgagcacat 2220

tgccaatctg gccggcagcc ccgccattaa gaagggcatc ctgcagacag tgaaggtggt 2280

ggacgagctc gtgaaagtga tgggccggca caagcccgag aacatcgtga tcgaaatggc 2340

cagagagaac cagaccaccc agaagggaca gaagaacagc cgcgagagaa tgaagcggat 2400

cgaagagggc atcaaagagc tgggcagcca gatcctgaaa gaacaccccg tggaaaacac 2460

ccagctgcag aacgagaagc tgtacctgta ctacctgcag aatgggcggg atatgtacgt 2520

ggaccaggaa ctggacatca accggctgtc cgactacgat gtggaccaca tcgtgcctca 2580

gagctttctg aaggacgact ccatcgacaa caaggtgctg accagaagcg acaaggcccg 2640

gggcaagagc gacaacgtgc cctccgaaga ggtcgtgaag aagatgaaga actactggcg 2700

gcagctgctg aacgccaagc tgattaccca gagaaagttc gacaatctga ccaaggccga 2760

gagaggcggc ctgagcgaac tggataaggc cggcttcatc aagagacagc tggtggaaac 2820

ccggcagatc acaaagcacg tggcacagat cctggactcc cggatgaaca ctaagtacga 2880

cgagaatgac aagctgatcc gggaagtgaa agtgatcacc ctgaagtcca agctggtgtc 2940

cgatttccgg aaggatttcc agttttacaa agtgcgcgag atcaacaact accaccacgc 3000

ccacgacgcc tacctgaacg ccgtcgtggg aaccgccctg atcaaaaagt accctaagct 3060

ggaaagcgag ttcgtgtacg gcgactacaa ggtgtacgac gtgcggaaga tgatcgccaa 3120

gagcgagcag gaaatcggca aggctaccgc caagtacttc ttctacagca acatcatgaa 3180

ctttttcaag accgagatta ccctggccaa cggcgagatc cggaagcggc ctctgatcga 3240

gacaaacggc gaaaccgggg agatcgtgtg ggataagggc cgggattttg ccaccgtgcg 3300

gaaagtgctg agcatgcccc aagtgaatat cgtgaaaaag accgaggtgc agacaggcgg 3360

cttcagcaaa gagtctatcc tgcccaagag gaacagcgat aagctgatcg ccagaaagaa 3420

ggactgggac cctaagaagt acggcggctt cgacagcccc accgtggcct attctgtgct 3480

ggtggtggcc aaagtggaaa agggcaagtc caagaaactg aagagtgtga aagagctgct 3540

ggggatcacc atcatggaaa gaagcagctt cgagaagaat cccatcgact ttctggaagc 3600

caagggctac aaagaagtga aaaaggacct gatcatcaag ctgcctaagt actccctgtt 3660

cgagctggaa aacggccgga agagaatgct ggcctctgcc ggcgaactgc agaagggaaa 3720

cgaactggcc ctgccctcca aatatgtgaa cttcctgtac ctggccagcc actatgagaa 3780

gctgaagggc tcccccgagg ataatgagca gaaacagctg tttgtggaac agcacaagca 3840

ctacctggac gagatcatcg agcagatcag cgagttctcc aagagagtga tcctggccga 3900

cgctaatctg gacaaagtgc tgtccgccta caacaagcac cgggataagc ccatcagaga 3960

gcaggccgag aatatcatcc acctgtttac cctgaccaat ctgggagccc ctgccgcctt 4020

caagtacttt gacaccacca tcgaccggaa gaggtacacc agcaccaaag aggtgctgga 4080

cgccaccctg atccaccaga gcatcaccgg cctgtacgag acacggatcg acctgtctca 4140

gctgggaggc gac 4153

<210> 3

<211> 435

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtctctcg agatgcccaa aaagaaaaga aaagtgggta gtatgggttc caaaaccatc 60

gttctttcgg tcggcgaggc tactcgcact ctgactgaga tccagtccac cgcagaccgt 120

cagatcttcg aagagaaggt cgggcctctg gtgggtcggc tgcgcctcac ggcttcgctc 180

cgtcaaaacg gagccaagac cgcgtatcgc gtcaacctaa aactggatca ggcggacgtc 240

gttgattccg gacttccgaa agtgcgctac actcaggtat ggtcgcacga cgtgacaatc 300

gttgcgaata gcaccgaggc ctcgcgcaaa tcgttgtacg atttgaccaa gtccctcgtc 360

gcgacctcgc aggtcgaaga tcttgtcgtc aaccttgtgc cgctgggccg tggtggcgga 420

gggactagtg gaggt 435

<210> 4

<211> 2241

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgggccaga ctgggaagaa atctgagaag ggaccagttt gttggcggaa gcgtgtaaaa 60

tcagagtaca tgcgactgag acagctcaag aggttcagac gagctgatga agtaaagagt 120

atgtttagtt ccaatcgtca gaaaattttg gaaagaacgg aaatcttaaa ccaagaatgg 180

aaacagcgaa ggatacagcc tgtgcacatc ctgacttctg tgagctcatt gcgcgggact 240

agggagtgtt cggtgaccag tgacttggat tttccaacac aagtcatccc attaaagact 300

ctgaatgcag ttgcttcagt acccataatg tattcttggt ctcccctaca gcagaatttt 360

atggtggaag atgaaactgt tttacataac attccttata tgggagatga agttttagat 420

caggatggta ctttcattga agaactaata aaaaattatg atgggaaagt acacggggat 480

agagaatgtg ggtttataaa tgatgaaatt tttgtggagt tggtgaatgc ccttggtcaa 540

tataatgatg atgacgatga tgatgatgga gacgatcctg aagaaagaga agaaaagcag 600

aaagatctgg aggatcaccg agatgataaa gaaagccgcc cacctcggaa atttccttct 660

gataaaattt ttgaagccat ttcctcaatg tttccagata agggcacagc agaagaacta 720

aaggaaaaat ataaagaact caccgaacag cagctcccag gcgcacttcc tcctgaatgt 780

acccccaaca tagatggacc aaatgctaaa tctgttcaga gagagcaaag cttacactcc 840

tttcatacgc ttttctgtag gcgatgtttt aaatatgact gcttcctaca tccttttcat 900

gcaacaccca acacttataa gcggaagaac acagaaacag ctctagacaa caaaccttgt 960

ggaccacagt gttaccagca tttggaggga gcaaaggagt ttgctgctgc tctcaccgct 1020

gagcggataa agaccccacc aaaacgtcca ggaggccgca gaagaggacg gcttcccaat 1080

aacagtagca ggcccagcac ccccaccatt aatgtgctgg aatcaaagga tacagacagt 1140

gatagggaag cagggactga aacgggggga gagaacaatg ataaagaaga agaagagaag 1200

aaagatgaaa cttcgagctc ctctgaagca aattctcggt gtcaaacacc aataaagatg 1260

aagccaaata ttgaacctcc tgagaatgtg gagtggagtg gtgctgaagc ctcaatgttt 1320

agagtcctca ttggcactta ctatgacaat ttctgtgcca ttgctaggtt aattgggacc 1380

aaaacatgta gacaggtgta tgagtttaga gtcaaagaat ctagcatcat agctccagct 1440

cccgctgagg atgtggatac tcctccaagg aaaaagaaga ggaaacaccg gttgtgggct 1500

gcacactgca gaaagataca gctgaaaaag gacggctcct ctaaccatgt ttacaactat 1560

caaccctgtg atcatccacg gcagccttgt gacagttcgt gcccttgtgt gatagcacaa 1620

aatttttgtg aaaagttttg tcaatgtagt tcagagtgtc aaaaccgctt tccgggatgc 1680

cgctgcaaag cacagtgcaa caccaagcag tgcccgtgct acctggctgt ccgagagtgt 1740

gaccctgacc tctgtcttac ttgtggagcc gctgaccatt gggacagtaa aaatgtgtcc 1800

tgcaagaact gcagtattca gcggggctcc aaaaagcatc tattgctggc accatctgac 1860

gtggcaggct gggggatttt tatcaaagat cctgtgcaga aaaatgaatt catctcagaa 1920

tactgtggag agattatttc tcaagatgaa gctgacagaa gagggaaagt gtatgataaa 1980

tacatgtgca gctttctgtt caacttgaac aatgattttg tggtggatgc aacccgcaag 2040

ggtaacaaaa ttcgttttgc aaatcattcg gtaaatccaa actgctatgc aaaagttatg 2100

atggttaacg gtgatcacag gataggtatt tttgccaaga gagccatcca gactggcgaa 2160

gagctgtttt ttgattacag atacagccag gctgatgccc tgaagtatgt cggcatcgaa 2220

agagaaatgg aaatcccttg a 2241

<210> 5

<211> 162

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caccgacgtg ggctggggtg gggccgtttt agagctataa ggagtttata tggaaaccct 60

tatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttgg cctaaggagt ttatatggaa 120

acccttaggc caagtggcac cgagtcggtg ctttttttgt tt 162

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caccgagttc gcgacattca ttctt 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaacaagaat gaatgtcgcg aactc 25

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caccgacgtg ggctggggtg gggcc 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaacggcccc accccagccc acgtc 25