一种博兹曼军团菌分离培养基及其制备方法

摘要

本发明提供了一种博兹曼军团菌分离培养基及其制备方法，用于选择性分离培养博兹曼军团菌，属于微生物技术领域。其组成成分为：丙酮酸钠、酵母浸粉、α‑酮戊二酸、硝酸铁、活性炭、碳黑、L‑半胱氨酸盐酸盐、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、甘氨酸、溴甲酚紫、溴甲酚绿、琼脂、万古霉素、那他霉素、多粘菌素B、氢氧化钾，通过简单的溶解混合，高温灭菌，无菌灌装，制备成适合博兹曼军团菌分离培养的培养基。本发明的培养基通过简单的分离培养，能精确快速的筛选出博兹曼军团菌，具有高效性与专一性，原料易获取，有效降低成本，使用方便快捷，减少自配培养基所带来的污染风险和繁琐程序，适用于标准化和专业化研究。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，涉及一种博兹曼军团菌分离培养基及其制备方法。

背景技术

军团菌是一种常见的革兰氏阴性杆菌，广泛存在于天然淡水、饮用水以及人工水域中，尤其是在集中空调的冷却塔水中，是引起军团菌病和庞蒂亚热的主要病原体。目前已知的90%的军团菌病爆发是由嗜肺军团菌引起的，但是由非嗜肺军团菌引起的病例也引起了人们的重视。

博兹曼军团菌是军团菌的一种，能够引起博兹曼军团菌肺炎，患者除了肺部炎症外，还会发生肝、肾、心脏以及神经精神的损伤。1995年末至1996年初，北京顺义县某部新兵发生4例博兹曼军团菌肺炎；2000年1月在北京郊区某新兵训练营发生过一起博兹曼军团菌病爆发。该菌的繁殖速度慢，需要较长的培养时间，因此为实验室研究以及临床检验带来了不便。目前，需要一款能够快速有效分离培养博兹曼军团菌的培养基。

发明内容

本发明的目的在于提供一种博兹曼军团菌分离培养基及其制备方法。本发明中的分离培养基，是一次性预灌装无菌产品，使用方便、快捷、高效。将此分离培养基应用于医院的临床研究中，能够缩短成果转化时间，大大提高工作效率。

为了实现本发明的目的，采用以下技术方案：

一种博兹曼军团菌分离培养基，其特征在于：包括基础营养组分和添加剂；基础营养组分包括酵母浸粉、丙酮酸钠、α-酮戊二酸、活性炭、碳黑、硝酸铁、琼脂、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、L-半胱氨酸盐酸盐、溴甲酚紫、溴甲酚绿、氢氧化钾；所述添加剂包括甘氨酸、万古霉素、多粘菌素B和那他霉素。

进一步优选的技术方案：每升所述博兹曼军团菌分离培养基含有中含有6-8g酵母浸粉、2-4g丙酮酸钠、1-2g活性炭、0.01-1g碳黑、0.2-0.3g硝酸铁、0.8-1.2g α-酮戊二酸、16-18g琼脂、8.2g磷酸二氢钾、1.9g磷酸氢二钾、0.5-1g L-半胱氨酸盐酸盐、0.01-0.02g溴甲酚紫、0.01-0.02g溴甲酚绿、2.8g氢氧化钾，还包括添加剂3-5g甘氨酸、0.8-1mg万古霉素、5-10万U多粘菌素B和60-80mg那他霉素。

一种博兹曼军团菌分离培养基的制备方法，其特征在于称取6-8g酵母浸粉、2-4g丙酮酸钠、1-2g活性炭、0.01-1g碳黑、0.2-0.3g硝酸铁、0.8-1.2g α-酮戊二酸、16-18g琼脂、8.2g磷酸二氢钾、1.9g磷酸氢二钾、0.5-1g L-半胱氨酸盐酸盐、0.01-0.02g溴甲酚紫、0.01-0.02g溴甲酚绿，溶解于去离子水中，并以2.8g氢氧化钾调整pH为6.7-7.1，定容至1000mL；高温至118-125℃、高压至100-108kPa灭菌13-17分钟，冷却至40-60℃，加入3-5g甘氨酸、0.8-1mg万古霉素、5-10万U多粘菌素B和60-80mg那他霉素混匀，无菌灌装至一次性无菌培养皿中，高能辐照灭菌，制得所述博兹曼军团菌分离培养基。

所述应用为用于博兹曼军团菌的特异性分离培养。

所述一次性无菌培养皿采用90*15 mm一次性无菌培养皿。

所述培养时间为24-168 h。

一种博兹曼军团菌的分离培养方法，利用上述的制备方法，制得分离培养基，将待分离的样本接种于分离培养基，得到博兹曼军团菌样本培养基，培养该样本培养基。

与现有技术相比，本发明的优点为：本发明提供了一种专门用于分离博兹曼军团菌的分离培养基配方，与其他军团菌分离培养基相比，本培养基不仅能够抑制其他细菌、真菌的生长，还能大大缩短目标菌株的培养时间，从而在较短时间内得到博兹曼军团菌的培养物，提高了分离效率；本发明通过简单的加工工艺，制得一次性预灌装产品，避免了自配培养基所带来的污染风险和繁琐程序。使用方便、快捷，极大地缩短了研究周期，提高了研发效率；将制得的培养基用于分离目标微生物，通过简单的培养步骤，能够准确的分离出目的菌种，具有较好的分离效果。

附图说明

图1（a）为本发明实施例1的培养基；

图1（b）为实施例1的对照组培养基；

图2（a）为本发明实施例2的培养基；

图2（b）为实施例2的对照组培养基；

图3（a）为本发明实施例3的培养基；

图3（b）为实施例3的对照组培养基。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚，以下将结合实施例对本发明的实施方案进行详细的描述。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行。所用仪器或试剂未注明生产厂商者，均为市售常规产品。

酵母浸粉、α-酮戊二酸和丙酮酸钠为微生物生长提供基本的碳氮源和能源；磷酸氢二钾、磷酸二氢钾能够使培养基的pH稳定在一定范围内；活性炭和碳黑具有解毒、收集二氧化碳和改变表面张力的作用；L-半胱氨酸盐酸盐和硝酸铁是军团菌的必需生长因子；氢氧化钾可以较好的调节培养基pH；琼脂作为凝固剂，是固体培养基的基本组分；溴甲酚紫和溴甲酚绿为酸碱指示剂；甘氨酸能够抑制杂菌的生长而不抑制军团菌的生长；万古霉素和多粘菌素B作为抗生素，可以有效的抑制大部分革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌的生长；那他霉素作为真菌抑制剂，可以有效的抑制真菌的生长。

一种博兹曼军团菌分离培养基的配方及培养方法，步骤如下：

1、分离培养基配方

6-8g酵母浸粉、2-4g丙酮酸钠、1-2g活性炭、0.01-1g碳黑、0.2-0.3g硝酸铁、0.8-1.2g α-酮戊二酸、16-18g琼脂、8.2g磷酸二氢钾、1.9g磷酸氢二钾、0.5-1g L-半胱氨酸盐酸盐、0.01-0.02g溴甲酚紫、0.01-0.02g溴甲酚绿、2.8g氢氧化钾，添加剂为3-5g甘氨酸、0.8-1mg万古霉素、5-10万U多粘菌素B和60-80mg那他霉素，溶剂为去离子水。

2、培养方法

（1）配制分离培养基

称取6-8g酵母浸粉、2-4g丙酮酸钠、1-2g活性炭、0.01-1g碳黑、0.2-0.3g硝酸铁、0.8-1.2g α-酮戊二酸、16-18g琼脂、8.2g磷酸二氢钾、1.9g磷酸氢二钾、0.5-1g L-半胱氨酸盐酸盐、0.01-0.02g溴甲酚紫、0.01-0.02g溴甲酚绿；溶解于去离子水中，并以2.8g氢氧化钾调整pH为6.7-7.1，定容至1000 mL；121℃、104kPa灭菌15分钟，冷却至50℃，加入过滤除菌的3-5g甘氨酸、0.8-1mg万古霉素、5-10万U多粘菌素B和60-80mg那他霉素混匀，无菌灌装至一次性无菌培养皿中，高能辐照灭菌，制得博兹曼军团菌分离培养基。

（2）接种

在超净工作台无菌条件下，将集中空调的冷却塔水样本接种到分离培养基上。

（3）培养

将接种好的分离培养基放到34-38℃的培养箱中，培育24-168小时。

实施例1

本实施例提供一种分离培养基的配方。

一种博兹曼军团菌分离的培养基和培养方法，步骤如下：

1、分离培养基配方如下：

8g酵母浸粉、2g丙酮酸钠、0.5g L-半胱氨酸盐酸盐、1.5g活性炭、1g碳黑、0.25g硝酸铁、1g α-酮戊二酸、16g琼脂、8.2g磷酸二氢钾、1.9g磷酸氢二钾、0.01g溴甲酚紫、0.01g溴甲酚绿、2.8g氢氧化钾，添加剂为3g甘氨酸、1mg万古霉素、8万U多粘菌素B和80mg那他霉素，溶剂为去离子水。

2、培养方法

（1）配制分离培养基

称取8g酵母浸粉、2g丙酮酸钠、0.5g L-半胱氨酸盐酸盐、1.5g活性炭、1g碳黑、0.25g硝酸铁、1g α-酮戊二酸、16g琼脂、8.2g磷酸二氢钾、1.9g磷酸氢二钾、0.01g溴甲酚紫、0.01g溴甲酚绿，溶解于去离子水中，并以2.8g氢氧化钾调整pH为6.7-7.1，定容至1000mL；121℃、104kPa灭菌15分钟，冷却至50℃，加入过滤除菌的3g甘氨酸、1mg万古霉素、8万U多粘菌素B和80mg那他霉素混匀，无菌灌装至一次性无菌培养皿中，高能辐照灭菌，制得博兹曼军团菌分离培养基。

（2）接种

在超净工作台无菌条件下，将集中空调的冷却塔水样本接种到分离培养基上。

（3）培养

将接种好的分离培养基放到36℃的培养箱中，培育24-168小时。

3、设置对照

以GVPC琼脂培养基作为对照，在超净工作台无菌条件下，将从集中空调冷却塔出水口采集的水样接种到对照培养基上。将接种好的对照培养基放到36℃的培养箱中，培育24-168小时。

以上对照组未注明之处与本发明实施例1均相同。

结果见表1

表1本发明与对照组对博兹曼军团菌的分离培养效果的比较

注：+：菌落小；++菌落较大；+++菌落大

从表1可以看出，在本发明配制的培养基中，博兹曼军团菌生长良好，其它真菌以及细菌均不生长。对照组培养结果可以看出，博兹曼军团菌生长状态较差。图1（a）为本发明的培养基，菌落颜色与培养基颜色形成鲜明对比，且相同培养时间内，博兹曼军团菌生长迅速，菌落数量多，菌落大，易于计数和观察菌落特征。图1（b）为对照组培养基，博兹曼军团菌生长缓慢，菌落小，菌落数量少，且颜色对比不明显，不易于观察，不利于博兹曼军团菌的快速分离培养。

本实施例1为本发明的最佳实施例。

实施例2

本实施例提供一种分离培养基的配方。

一种博兹曼军团菌分离的培养基和培养方法，步骤如下：

1、分离培养基配方如下：

6g酵母浸粉、4g丙酮酸钠、2g活性炭、0.5g碳黑、0.2g硝酸铁、1.2g α-酮戊二酸、17g琼脂、8.2g磷酸二氢钾、1.9g磷酸氢二钾、0.7g L-半胱氨酸盐酸盐、0.015g溴甲酚紫、0.015g溴甲酚绿、2.8g氢氧化钾，添加剂为4g甘氨酸、0.8mg万古霉素、10万U多粘菌素B和72mg那他霉素，溶剂为去离子水。

2、培养方法

（1）配制分离培养基

称取6g酵母浸粉、4g丙酮酸钠、2g活性炭、0.5g碳黑、0.2g硝酸铁、1.2g α-酮戊二酸、17g琼脂、8.2g磷酸二氢钾、1.9g磷酸氢二钾、0.7g L-半胱氨酸盐酸盐、0.015g溴甲酚紫、0.015g溴甲酚绿；溶解于去离子水中，并以2.8g氢氧化钾调整pH为6.7-7.1，定容至1000mL；121℃、104kPa灭菌15分钟，冷却至50℃，加入过滤除菌的4g甘氨酸、0.8mg万古霉素、10万U多粘菌素B和72mg那他霉素混匀，无菌灌装至一次性无菌培养皿中，高能辐照灭菌，制得博兹曼军团菌分离培养基。

（2）接种

在超净工作台无菌条件下，将集中空调的冷却塔水样本接种到分离培养基上。

（3）培养

将接种好的分离培养基放到36℃的培养箱中，培育24-168小时。

3、设置对照

以GVPC琼脂培养基作为对照，在超净工作台无菌条件下，将从集中空调冷却塔出水口采集的水样接种到对照培养基上。将接种好的对照培养基放到36℃的培养箱中，培育24-168小时。

以上对照组未注明之处与本发明实施例1均相同。

结果见表2

表2本发明与对照组对博兹曼军团菌的分离培养效果的比较

注：+：菌落小；++菌落较大；+++菌落大

从表2可以看出，本发明配制的培养基博兹曼军团菌生长良好，其它真菌以及细菌均不生长。从对照组培养结果可以看出，博兹曼军团菌的生长状态较差。图2（a）为本发明的培养基，菌落颜色与培养基颜色形成对比明显，且相同培养时间内，博兹曼军团菌生长迅速，菌落数量多，菌落大，易于计数，方便观察菌落特征。图2（b）为对照组培养基，博兹曼军团菌生长缓慢，菌落小，菌落数量少，且颜色对比不明显，不易于观察，不利于博兹曼军团菌的快速分离培养。由上述结果可以看出，实施例2培养效果比实施例1略差，菌落数量较实施例1少，但仍明显优于对照组，可以起到一定的分离博兹曼军团菌的效果。

实施例3

本实施例提供一种分离培养基的配方。

一种博兹曼军团菌分离的培养基和培养方法，步骤如下：

1、分离培养基配方如下：

7g酵母浸粉、3g丙酮酸钠、1g活性炭、0.01g碳黑、0.3g硝酸铁、0.8g α-酮戊二酸、18g琼脂、8.2g磷酸二氢钾、1.9g磷酸氢二钾、1g L-半胱氨酸盐酸盐、0.02g溴甲酚紫、0.02g溴甲酚绿、2.8g氢氧化钾，添加剂为5g甘氨酸、0.9mg万古霉素、5万U多粘菌素B和60mg那他霉素，溶剂为去离子水。

2、培养方法

（1）配制分离培养基

称取7g酵母浸粉、3g丙酮酸钠、1g活性炭、0.01g碳黑、0.3g硝酸铁、0.8g α-酮戊二酸、18g琼脂、8.2g磷酸二氢钾、1.9g磷酸氢二钾、1g L-半胱氨酸盐酸盐、0.02g溴甲酚紫、0.02g溴甲酚绿，溶解于去离子水中，并以2.8g氢氧化钾调整pH为6.7-7.1，定容至1000 mL；121℃、104kPa灭菌15分钟，冷却至50℃，加入过滤除菌的5g甘氨酸、0.9mg万古霉素、5万U多粘菌素B和60mg那他霉素混匀，无菌灌装至一次性无菌培养皿中，高能辐照灭菌，制得博兹曼军团菌分离培养基。

（2）接种

在超净工作台无菌条件下，将集中空调的冷却塔水样本接种到分离培养基上。

（3）培养

将接种好的分离培养基放到36℃的培养箱中，培育24-168小时。

3、设置对照

以GVPC琼脂培养基作为对照，在超净工作台无菌条件下，将从集中空调冷却塔出水口采集的水样接种到对照培养基上。将接种好的对照培养基放到36℃的培养箱中，培育24-168小时。

以上对照组未注明之处与本发明实施例1均相同。

结果见表3

表3本发明与对照组对博兹曼军团菌的分离培养效果的比较

注：+：菌落小；++菌落较大；+++菌落大

从表3可以看出，本发明配制的培养基博兹曼军团菌生长良好，其它真菌以及细菌均不生长。从对照组培养结果可以看出，博兹曼军团生长状态较差。图3（a）为本发明的培养基，相同培养时间内，博兹曼军团菌生长迅速，菌落数量较多，菌落较大，易于计数和观察菌落特征。图3（b）为对照组培养基，博兹曼军团菌生长缓慢，菌落小，菌落数量少，不易于观察计数，不利于博兹曼军团菌的快速分离培养。由上述结果可以看出，实施例3培养效果比实施例1略差，相较于实施例1，菌落数量少，菌落小，无颜色上的明显对比，但仍明显优于对照组，可以起到一定的分离博兹曼军团菌的效果。

综上所述，本发明实施例提供的分离培养基，通过添加活性炭和碳黑吸收军团菌生长时产生的过氧化物和超氧化物等毒性产物，通过添加硝酸铁和L-半胱氨酸盐酸盐提供军团菌生长的必需因子，通过添加那他霉素抑制真菌的生长，添加万古霉素、甘氨酸和多粘菌素B抑制其他细菌的生长，从而得到能够有效分离、培养博兹曼军团菌的培养基。该培养基具有较高的实用性和推广应用价值。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。