青蛤丝裂原活化蛋白激酶p38 MAPK的cDNA全长序列及其应用

摘要

本发明公开了青蛤丝裂原活化蛋白激酶p38 MAPK的cDNA全长序列及其应用，该序列全长1781 bp，其中1101 bp为完整的开放阅读框，内含S‑Tkc结构域，编码367个氨基酸，理论分子量为42.31KDa。通过实时荧光定量PCR方法，研究青蛤不同组织中p38 MAPK基因表达的情况，结果表明，该基因在青蛤血淋巴中含量最高。同时，青蛤在鳗弧菌感染后特定时间段内血淋巴中该基因表达量其蛋白磷酸化水平显著提高，推测p38 MAPK参与的通路与个体免疫应答之间存在相关性。本发明可为了解青蛤在抵御病原微生物过程中发挥的免疫机制提供实验依据，并为最终解决青蛤增养殖中的病害防治问题奠定基础。

说明书

技术领域

本发明以青蛤为研究对象，确定了其丝裂原活化蛋白激酶p38 MAPK的cDNA全长序列，研究了该基因在鳗弧菌感染过程中表达量及蛋白磷酸化水平的变化情况，属于动物分子生物学、贝类免疫生物学技术领域。

背景技术

青蛤（

但随着国内水产品的集约化养殖规模不断扩大、养殖环境恶化及种质退化严重等问题, 在我国多地出现了由病毒、细菌、寄生原虫、类衣原体、类支原体等病原微生物诱发的青蛤大规模病害爆发及死亡现象，使近海地区贝类养殖业蒙受重大的经济损失。值得注意的是，由弧菌属细菌引起的弧菌病是在世界各地养殖鱼、虾、蟹及贝类等水产动物中普遍流行且危害最大的细菌性疾病，致病性弧菌被认为是海水养殖产业的“灾祸之源”，在感染的病原菌中占有相当大的比例，是引起水产养殖动物病害最严重的病原微生物之一。其中，鳗弧菌（

青蛤属于无脊椎动物类别中的贝类，不同于脊椎动物，青蛤不具备特异性免疫细胞与相关抗体，依靠先天性免疫系统抵御外来病原生物侵害，如通过血淋巴中细胞的吞噬及一些体液因子的作用来实现免疫功能。为增加青蛤对环境的抗逆性或对病原微生物（如鳗弧菌等）的有效防御，挖掘并研究其免疫系统相关基因、深入了解机体免疫应答过程中的具体机制刻不容缓。

Toll样受体 (Toll-like receptors, TLRs) 是非特异性免疫反应中一类重要的识别受体，用于识别拥有保守结构的病原体分子（如脂多糖、鞭毛蛋白、病毒双链RNA等）并开启下游信号传递。在哺乳动物中TLR介导的通路之一是依赖髓样分化蛋白88(MyD88)来进行信号传递的，下游分子如丝裂原活化蛋白激酶MAPK及核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）蛋白被相应激活以产生后续效应物，促进机体消除病原微生物。丝裂原活化蛋白激酶是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它作为介导细胞反应的一种重要信号系统,参与了细胞多种生化反应信号的识别、传递以及放大等处理过程。目前研究认为MAPK家族主要有4个亚类，分别是：细胞外信号调节激酶1/2 (extracellular signal-regulatedkinase, ERK1/2) 、氨基末端激酶 (Jun N-terminal kinase, JNK) 、p38 MAPK和ERK5。目前对此通路的研究在脊椎类动物如人类、小鼠等报道较多, 但在无脊椎动物中的报道较少。探索丝裂原活化蛋白激酶所参与的青蛤免疫应答机制能够为选育贝类新品种、开发疫苗提供理论依据, 减少其养殖过程中的大规模死亡现象, 从而推动沿海地区的经济发展。

本发明通过转录组测序，报道了一个青蛤在免疫应答过程中发挥潜在作用的丝裂原活化蛋白激酶亚类p38 MAPK的cDNA全长序列，为进一步研究青蛤及其他无脊椎动物在抵御病原微生物过程中发挥的免疫机制积累重要的实验依据，为最终解决青蛤在增养殖过程中出现的病害感染问题奠定理论基础。

发明内容

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种青蛤丝裂原活化蛋白激酶p38 MAPK的核苷酸序列，其特征在于该序列全长1781 bp，其中1101 bp为完整的开放阅读框，内含一个S-Tkc结构域，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。该序列编码367个氨基酸，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其理论分子量为42.31KDa，理论等电点为5.67，分子式为C

本发明同时也公开了青蛤丝裂原活化蛋白激酶p38 MAPK核苷酸序列的特异性引物，引物序列如下：

本发明更进一步公开了青蛤丝裂原活化蛋白激酶p38 MAPK的核苷酸序列在用于解决青蛤增养殖中病害防治方面的应用。特别是：青蛤对外界环境中病原微生物的抵御能力。实验结果显示，p38 MAPK是青蛤免疫功能相关通路的重要分子之一，在一定程度上参与机体对外界病原微生物的抵御过程。

本发明更加详细的描述如下：

本发明公开的青蛤丝裂原活化蛋白激酶p38 MAPK的核苷酸序列，该序列全长1781bp（表1），其中1101 bp为完整的开放阅读框，内含一个S-Tkc结构域。该序列编码367个氨基酸（表2），其理论分子量为42.31KDa，理论等电点为5.67，分子式为C

本发明进一步公开了青蛤在正常生理状况下以及在鳗弧菌胁迫过程中其丝裂原活化蛋白激酶p38 MAPK的表达情况。利用实时荧光定量PCR方法，确定p38 MAPK基因在青蛤不同组织中的表达量。所述应用指的是：研究青蛤在鳗弧菌感染后的不同时间段内血淋巴中p38 MAPK基因表达的变化，以及蛋白磷酸化水平变化，评估该基因参与的通路与个体免疫应答之间的相关性。实验结果显示p38 MAPK基因在鳗弧菌刺激后的12-48小时转录水平显著提高，p38 MAPK蛋白磷酸化水平在鳗弧菌胁迫后的2-6小时显著上调。

研究结果可为探究青蛤在抵御有害病原微生物过程中发挥作用的免疫功能机制提供理论依据，为最终解决贝类增养殖中的病害防治问题奠定基础。

SEQ ID NO.1所示的青蛤丝裂原活化蛋白激酶p38 MAPK的cDNA全长：

AAAAAATCGAAACACCGACTGCTTACTTCAGATGAAAATCCGGAAGCTTTCCCAGAAAGGAGAAAATAAATATTTGAAAGAAAATAAAGACGATATTAGCACTGATCTCTAACAAATCCTTTCCTCTTTTGTGTGCATGCCATCTTTGAATGTCTAAATGTCGAATAAGCAAAAACTAAAAGACGGTTTTTACCGCGCTGAACTAAATAAGACGGTTTGGGAAGTACCCAGTCGATACCAATGTCTTAGCCCGGTAGGGTCAGGGGCTTACGGACAAGTATGCTCTGCTCTGGACAAAAAGACTGGCCATAAAGTGGCTATAAAGAAGTTGTCAAGACCATTCCAGTCAGCAATCCATGCAAAAAGAACATACAGGGAACTTCGCATGTTGAAACATATGCTACATGAAAATGTAATTGGTCTTCTAGATGTTTTCACACCAACAGAAACATTTGAAGATTTTGAAGAAGTATACTTGGTGACTGCTTTAATGGGAGCTGATATGAACAATATCATCAAAACACAGAGGCTGAGTGACGATCATGTACAGTTTCTTATTTATCAGGTTCTACGAGCTATGAAGTACATTCACTCAGCAGGTATTATTCATAGGGATTTGAAACCAAGCAATATAGCTGTGAATGAAGATTGTGAATTAAAGATTTTGGACTTTGGGTTGGCTCGTCATACAGATGATCAGATGACGGGTTATGTGGCGACACGTTGGTACAGGGCTCCAGAAATAATGCTCAACTGGATGCACTATAATCAAACAGTTGATGTGTGGTCAGTAGGCTGTATAATGGCAGAGATGTTAACTGGAAGACCTCTGTTCCCAGGAACTGACCACATAGATCAGTTAACTAGGATTCTTTCATTAGTGGGTACACCGACTGATGAACTTTTAACAAAGATCAGTAGCAACGAGGCTAGAAATTACATTAAGCAGTTGCCAAAGTGGGAGAAAAAAGATTTTAGGACTGTTTTCCAAGGTGCAAATCCCCATGCCATAGATTTGTTAGAGAGAATGTTAGATTTGGATGCTGACACACGTATAACAGCAGAGCAGGCTCTTGCACACCCTTACCTCAGACAGTATGCCGATCCAACAGATGAACCTACAGCCACAAAATATGATCAAACTTTTGAAGACTTGGAATTGAGTATACCAGAGTGGAGAAAGTTAGTGTATGACGAAGTGGTATCATTCACACCACCCCAGGATAATGATTCGATGGAAACAATGGTTCAGACAGACTAAGTCATAACCCGCCCACTGTGTATCTACTCCTCATCTTCTGTCATCATTGTGATCATCACGAGCAGCAGCAGTAGCAGCTAGCAGTAGAAGTAGAATTATTCTCGATGGAATCTATAACAGCAGCATGATTGATACTCAAACATTTTTTTTGTATTTCCAGAAAATAAAGAACATTCTTTTGTTTCAAGTCTCACACTGATATCATTTTCTTTCTTTCCCTTTAACACTTAAGTTATTGTCACAACATGCAGTCATAAGAAAATAAATGCACTGCAGCCTATGTGTTGAGGTCATCACTCATGTTTTTAAGATTAGGTTAGTCTTAACTGAAGGAAAATATTTTTCAAAGTTACATTATACACTAATTCACTTATGTCGTGTTGGCCCAGCTACCTCAATCGGTAGAGCATCTGATTGTCAATCTTGACAATCCTAGTTCAGTCCCCATCAGGGCCGGCAAAATTTCTCCGTGATAATTGATCTCAGACAATGCGTTTATAGGTCATTTGTCCCTCACCTC

SEQ ID NO.2所示的青蛤丝裂原活化蛋白激酶p38 MAPK的氨基酸序列：

MSNKQKLKDGFYRAELNKTVWEVPSRYQCLSPVGSGAYGQVCSALDKKTGHKVAIKKLSRPFQSAIHAKRTYRELRMLKHMLHENVIGLLDVFTPTETFEDFEEVYLVTALMGADMNNIIKTQRLSDDHVQFLIYQVLRAMKYIHSAGIIHRDLKPSNIAVNEDCELKILDFGLARHTDDQMTGYVATRWYRAPEIMLNWMHYNQTVDVWSVGCIMAEMLTGRPLFPGTDHIDQLTRILSLVGTPTDELLTKISSNEARNYIKQLPKWEKKDFRTVFQGANPHAIDLLERMLDLDADTRITAEQALAHPYLRQYADPTDEPTATKYDQTFEDLELSIPEWRKLVYDEVVSFTPPQDNDSMETMVQTD。

附图说明

图1为青蛤丝裂原活化蛋白激酶p38 MAPK中S-Tkc结构域的重组蛋白表达结果；

图2为青蛤在正常生理状况下p38 MAPK基因在不同组织中的表达情况；

图3为青蛤在鳗弧菌感染后的不同时间段内（0h，3h，6h，12h，24h，48h，96h）血淋巴中p38 MAPK基因表达的变化；

图4为青蛤在鳗弧菌感染后的不同时间段内（0h，1h，2h，6h）血淋巴中p38 MAPK 蛋白磷酸化水平的变化。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂（Oligotex mRNA Kits、TransScript®RT等）均有市售。

实施例1

获得青蛤丝裂原活化蛋白激酶p38 MAPK的cDNA序列

实验材料于天津市王顶堤海鲜市场购买所得，选取外部特征基本一致，生理状态相同的青蛤样本。在实验室海水中暂养三到五天（暂养水温21℃-24℃，密度1.02-1.04g/cm

按QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits试剂盒分离mRNA。采用第二代IlluminaMiSeq测序仪, pair end双端模式完成青蛤转录组测序, 利用De novo RNA-seq analysis技术分析相关基因代谢途径和功能注释后通过筛选得p38 MAPK基因的类似序列。将获得的类似基因全长cDNA序列与GenBank中的核酸数据库作BLASTX分析后用生物信息学软件获取各项基本特征。

实施例2

不同组织中cDNA合成

提取青蛤的血淋巴、鳃、外套膜、肝脏和闭壳肌五个组织，各个组织组织均准确称取50 mg，同时使用一次性注射器从青蛤闭壳肌中抽取血淋巴0.5 ml，以实施例1中所述的操作进行总RNA提取。在EP管内加入5X M-MLV buffer 2.4 μl、总RNA 8.0 μl、Rnase抑制剂0.6 μl、RNase-free Dnase 1.0 μl，混匀后在37℃水浴锅中放置30分钟后加入1 μl Stopsolution，水浴锅65℃加热10分钟，以此去除体系中的DNA。每个离心管中加入2.5 μl 2×Oligo dT。水浴锅70℃加热5分钟，冰盒上放置2分钟。上述反应完成后，取一消毒的0.2 ml离心管，加入以下反应体系（25 μl体系)：5X M-MLV buffer 2.6 μl，dNTP 5.0 μl，M-MLV反转录酶 1.0 μl，RNA抑制剂 0.5 μl，RNase-free Water 15.9 μl，混匀后离心，水浴锅中42℃加热1小时后，再95℃加热5分钟。产物立即使用或保存于-20℃冷冻。

实施例3

青蛤 p38 S-Tkc MAPK结构域部分重组质粒的构建与蛋白表达

如图1所示，体外构建并表达p38 S-Tkc MAPK结构域，具体方法包括以下步骤：

（1）表达重组质粒的构建

根据转录组测序得到S-Tkc结构域序列设计正反向引物，设计基因特异性引物，以cDNA为模板，应用ExTaq Premix进行PCR扩增，采用1%琼脂糖凝胶电泳进行验证，使用GelExtraction Kit回收试剂盒（购于康为世纪）进行目的片段回收。应用BamHI/HindIII两种限制性内切酶酶切，与表达载体pET-28a进行过夜连接（16℃）。将10μl连接产物加入到100μl感受态细胞中，冰上放置30分钟。30分钟后迅速放入42℃水浴锅中热激90s，在迅速转移到冰盒上放置2分钟。无菌环境下向离心管中加入200 μl LB液体培养基，37℃，220 rpm，培养1小时，随后观察离心管中菌液浑浊程度，混匀后吸取100-150 μl菌液涂在LB液体培养基上（培养基含氨苄青霉素）。在恒温培养箱内培养1小时后，将平板倒置过夜培养。在长出菌落的平板上随机挑选3-5个单克隆菌落，挑取单菌落到1 ml LB液体培养基中（含氨苄青霉素），摇床设置37℃，220 rpm，4h培养该单菌落。培养完成后进行扩增筛选，若PCR扩增能得到一条大小与结构域大小一致的特异性条带，说明连接成功，可以将样品送测序，剩余的加入甘油保种备用。

（2）S-Tkc重组蛋白的诱导表达

取测序正确的重组质粒 10 μl，加入 100 μl Transetta (DE3) 表达菌中进行转化，挑取单克隆进行扩大培养，37℃震荡培养直至 OD 值为 0.6 后。取1 ml菌液放到离心管中作为对照，剩余菌液加入终浓度为 0.1 mM 的 IPTG 进行诱导表达，摇床中37℃，220rpm诱导对应蛋白表达，诱导期间每1个小时从菌液中取出1 ml放入离心管中，取4次。将取出的0-4小时的样品在10000 rpm下离心1分钟，离心后弃上清液收集底部沉淀的菌体。向收集的菌体中加入80 μl的 DEPC水，用移液枪反复吹打混匀后再加入20 μl 的SDS-PAGE电泳Loading Buffer混匀，在水浴锅中100℃加热10分钟。处理好的样品在冰箱中4℃保存用于实验。取10 μl样品进行SDS-PAGE电泳，使用考马斯亮蓝染液对电泳胶进行染色，先低温加热5分钟再振荡40分钟。把胶取出后转移到脱色液中，微波炉里高温加热10秒，每震荡10分钟换一次脱色液，直到胶片比较干净。实验结果表明，诱导后大约在32KD处产生了1条明显的特异性电泳带，这与最初的理论计算结果相一致。持续诱导发现3小时后，特异性条带的亮度及宽度基本不再变化，推测该蛋白的表达量不再增加，最终确定最佳诱导时间为3小时。

实施例4

获得青蛤丝裂原活化蛋白激酶p38 MAPK在不同组织中的表达情况

如图2所示，利用荧光定量PCR技术，确定p38 MAPK在不同组织中的表达情况。

（1）引物设计：根据所得p38 MAPK基因的全长序列，使用Primer 5软件设计适用于实时荧光PCR检测的特异性引物，引物序列如下：

（2）实时荧光定量PCR：运用SYBR Green嵌合荧光法进行RT-PCR分析。使用ABI7500设备进行PCR反应。以上述实施例2中合成的cDNA为模板，用上述（1）中所设计的特异性引物，进行实时荧光PCR扩增反应，实时荧光定量PCR过程应该选用的程序和体系依据试剂的说明书（TAKARA SYBR® Premix DimerEraser™）进行。扩增体系（20 μl）包含：10 μlSYBR Green Master mix, 1 μl former primer, 1 μl reverse primer, 4 μl cDNA模板和 4 μl ddH

结果发现，刺激后的p38 MAPK基因在青蛤组织中普遍表达，其中血淋巴中表达量最高，其次为肝，鳃中最少。其中该基因血淋巴中的表达量与其他四个组织具有显著性差异（p＜0. 01）。血淋巴作为无脊椎动物先天性免疫的必要防线，是机体发挥免疫功能的所在地，相对较高的表达量说明p38 MAPK很有可能是青蛤个体的免疫应答过程中的重要一环。

实施例5

青蛤丝裂原活化蛋白激酶p38 MAPK在鳗弧菌胁迫下的表达情况

如图3所示，利用荧光定量PCR技术，确定青蛤在鳗弧菌胁迫过程中其血淋巴中p38MAPK表达量变化情况。

（1）青蛤刺激实验

每一个实验组与对照组分别选取9只青蛤，在个体闭壳肌内使用一次性注射器注射50 μl鳗弧菌悬液 (OD600=0.4, 1×10

（2）鳗弧菌刺激后血淋巴中的p38 MAPK基因表达特征

按照实施例4中的步骤，对青蛤在鳗弧菌刺激下血淋巴内p38 MAPK基因的时序性表达进行分析。

结果发现，在刺激后的12-48小时内，p38 MAPK基因在血淋巴中的表达量显著提高（p＜0. 01），在48-96小时内逐步下调至生理水平。实验结果表明，p38 MAPK很有可能是青蛤免疫功能相关通路的重要分子之一，能够参与机体对外界病原微生物的抵御过程。

实施例6

青蛤丝裂原活化蛋白激酶p38 MAPK在鳗弧菌胁迫下的磷酸化水平变化

如图4所示，p38 MAPK蛋白在鳗弧菌刺激下的磷酸化情况

（1）青蛤刺激实验

每一个实验组与对照组分别选取9只青蛤，在个体闭壳肌内使用一次性注射器注射50 μl鳗弧菌悬液 (OD600=0.4, 1×10

（2）蛋白层次的磷酸化水平检测实验

将抽取的血淋巴进行离心，500×

结果发现，青蛤个体在受到鳗弧菌胁迫的情况下，p38 MAPK蛋白磷酸化水平在短时间内显著提高（2-6小时），说明此激酶通路在一定程度上参与了青蛤抵抗外来物质的免疫应答过程。

在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津师范大学

<120> 青蛤丝裂原活化蛋白激酶p38 MAPK的cDNA全长序列及其应用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1781

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaaaaatcga aacaccgact gcttacttca gatgaaaatc cggaagcttt cccagaaagg 60

agaaaataaa tatttgaaag aaaataaaga cgatattagc actgatctct aacaaatcct 120

ttcctctttt gtgtgcatgc catctttgaa tgtctaaatg tcgaataagc aaaaactaaa 180

agacggtttt taccgcgctg aactaaataa gacggtttgg gaagtaccca gtcgatacca 240

atgtcttagc ccggtagggt caggggctta cggacaagta tgctctgctc tggacaaaaa 300

gactggccat aaagtggcta taaagaagtt gtcaagacca ttccagtcag caatccatgc 360

aaaaagaaca tacagggaac ttcgcatgtt gaaacatatg ctacatgaaa atgtaattgg 420

tcttctagat gttttcacac caacagaaac atttgaagat tttgaagaag tatacttggt 480

gactgcttta atgggagctg atatgaacaa tatcatcaaa acacagaggc tgagtgacga 540

tcatgtacag tttcttattt atcaggttct acgagctatg aagtacattc actcagcagg 600

tattattcat agggatttga aaccaagcaa tatagctgtg aatgaagatt gtgaattaaa 660

gattttggac tttgggttgg ctcgtcatac agatgatcag atgacgggtt atgtggcgac 720

acgttggtac agggctccag aaataatgct caactggatg cactataatc aaacagttga 780

tgtgtggtca gtaggctgta taatggcaga gatgttaact ggaagacctc tgttcccagg 840

aactgaccac atagatcagt taactaggat tctttcatta gtgggtacac cgactgatga 900

acttttaaca aagatcagta gcaacgaggc tagaaattac attaagcagt tgccaaagtg 960

ggagaaaaaa gattttagga ctgttttcca aggtgcaaat ccccatgcca tagatttgtt 1020

agagagaatg ttagatttgg atgctgacac acgtataaca gcagagcagg ctcttgcaca 1080

cccttacctc agacagtatg ccgatccaac agatgaacct acagccacaa aatatgatca 1140

aacttttgaa gacttggaat tgagtatacc agagtggaga aagttagtgt atgacgaagt 1200

ggtatcattc acaccacccc aggataatga ttcgatggaa acaatggttc agacagacta 1260

agtcataacc cgcccactgt gtatctactc ctcatcttct gtcatcattg tgatcatcac 1320

gagcagcagc agtagcagct agcagtagaa gtagaattat tctcgatgga atctataaca 1380

gcagcatgat tgatactcaa acattttttt tgtatttcca gaaaataaag aacattcttt 1440

tgtttcaagt ctcacactga tatcattttc tttctttccc tttaacactt aagttattgt 1500

cacaacatgc agtcataaga aaataaatgc actgcagcct atgtgttgag gtcatcactc 1560

atgtttttaa gattaggtta gtcttaactg aaggaaaata tttttcaaag ttacattata 1620

cactaattca cttatgtcgt gttggcccag ctacctcaat cggtagagca tctgattgtc 1680

aatcttgaca atcctagttc agtccccatc agggccggca aaatttctcc gtgataattg 1740

atctcagaca atgcgtttat aggtcatttg tccctcacct c 1781

<210> 2

<211> 367

<212> PRT

<213> p38 MAPK氨基酸序列

<400> 2

Met Ser Asn Lys Gln Lys Leu Lys Asp Gly Phe Tyr Arg Ala Glu Leu

1 5 10 15

Asn Lys Thr Val Trp Glu Val Pro Ser Arg Tyr Gln Cys Leu Ser Pro

20 25 30

Val Gly Ser Gly Ala Tyr Gly Gln Val Cys Ser Ala Leu Asp Lys Lys

35 40 45

Thr Gly His Lys Val Ala Ile Lys Lys Leu Ser Arg Pro Phe Gln Ser

50 55 60

Ala Ile His Ala Lys Arg Thr Tyr Arg Glu Leu Arg Met Leu Lys His

65 70 75 80

Met Leu His Glu Asn Val Ile Gly Leu Leu Asp Val Phe Thr Pro Thr

85 90 95

Glu Thr Phe Glu Asp Phe Glu Glu Val Tyr Leu Val Thr Ala Leu Met

100 105 110

Gly Ala Asp Met Asn Asn Ile Ile Lys Thr Gln Arg Leu Ser Asp Asp

115 120 125

His Val Gln Phe Leu Ile Tyr Gln Val Leu Arg Ala Met Lys Tyr Ile

130 135 140

His Ser Ala Gly Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Ile Ala

145 150 155 160

Val Asn Glu Asp Cys Glu Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu Ala Arg

165 170 175

His Thr Asp Asp Gln Met Thr Gly Tyr Val Ala Thr Arg Trp Tyr Arg

180 185 190

Ala Pro Glu Ile Met Leu Asn Trp Met His Tyr Asn Gln Thr Val Asp

195 200 205

Val Trp Ser Val Gly Cys Ile Met Ala Glu Met Leu Thr Gly Arg Pro

210 215 220

Leu Phe Pro Gly Thr Asp His Ile Asp Gln Leu Thr Arg Ile Leu Ser

225 230 235 240

Leu Val Gly Thr Pro Thr Asp Glu Leu Leu Thr Lys Ile Ser Ser Asn

245 250 255

Glu Ala Arg Asn Tyr Ile Lys Gln Leu Pro Lys Trp Glu Lys Lys Asp

260 265 270

Phe Arg Thr Val Phe Gln Gly Ala Asn Pro His Ala Ile Asp Leu Leu

275 280 285

Glu Arg Met Leu Asp Leu Asp Ala Asp Thr Arg Ile Thr Ala Glu Gln

290 295 300

Ala Leu Ala His Pro Tyr Leu Arg Gln Tyr Ala Asp Pro Thr Asp Glu

305 310 315 320

Pro Thr Ala Thr Lys Tyr Asp Gln Thr Phe Glu Asp Leu Glu Leu Ser

325 330 335

Ile Pro Glu Trp Arg Lys Leu Val Tyr Asp Glu Val Val Ser Phe Thr

340 345 350

Pro Pro Gln Asp Asn Asp Ser Met Glu Thr Met Val Gln Thr Asp

355 360 365

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccaatgtctt agcccggtag g 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtaagggtgt gcaagagcc 19