一种具有抵御氧化应激反应作用的农产品的筛选和应用

摘要

本发明提供基于Keap1‑Nrf2‑ARE通路抵御氧化应激反应作用的农产品的筛选及应用，如下：选取农产品样品进行冻干、粉碎，在无水乙醇中充分溶解，过滤后浓缩得到农产品提取物，或在80～100℃水中充分溶解，过滤取上清，冻干后得到农产品提取物；培养肝癌细胞HepG2细胞系，测定所述的农产品提取物对细胞的活性的影响；再采用基因载体pGL4.37‑ARE与内对照报告基因载体pGL4.75共转染HepG2细胞，建立双荧光酶报告基因体系，测定细胞荧光素酶活性值。本发明将有助于开发抵御应激氧化反应的有效农产品食品原料，为提高农产品附加值，开发功能性食品提供理论依据。

说明书

技术领域

本发明涉及功能性食品技术领域，具体涉及具有抵御氧化应激反应作用的农产品的筛选和应用。

背景技术

氧化应激(oxidativestress)是指由于外界环境的刺激使机体内活性氧(ROS)增加，导致氧化/抗氧化动态平衡遭到破坏的一种应激反应。在正常情况下，机体内参与活性氧产生和清除的系统处于动态平衡。由于外界环境刺激或机体自身变化等原因，使ROS产生增多或其清除能力下降，机体就会出现氧化应激的症状。研究表明，长期或过强的氧化应激水平与多种人类疾病的发病机制有关，如酒精肝，心血管疾病、癌症、肥胖、糖尿病等。

已有流行病学研究表明，摄入水果、蔬菜能够降低多种疾病的发病风险、延缓疾病进程。具有抵御氧化应激反应作用的农产品，其中大部分自身具有还原效应，表现为与活性氧发生反应的“结合型”抗氧化天然活性物质，从而可以增强细胞自身抗氧化能力，保护机体免受氧化应激损伤的危害。

酒精性肝损伤是由长期大量饮酒引起的中毒肝脏疾病，非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD)主要指一类不以饮酒、药物或其他病毒为诱因的脂肪肝，其中包括简单的脂肪化和进展到肝炎期的非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)，如不加以有效的干预和治疗，可继发肝脏纤维化从而进展为肝硬化。酒精肝和NASH共同的主要致病机制为氧化应激，其中Nrf2是氧化应激的中枢因子，抗氧化酶和细胞保护蛋白的表达增强主要受Keap1-Nrf2-ARE信号通路的调控，而筛选具有抵御氧化应激反应的农产品并将其作为Keap1-Nrf2-ARE信号通路激活剂的相关应用鲜有报道。因此，筛选具有抵御氧化应激反应作用的农产品和应用是非常重要的。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提出筛选具有抵御氧化应激反应作用的农产品和应用，提供农产品作为功能性食品的新用途，开发农产品提取物作为体内抗氧化应激损伤剂，为其实际应用开辟新的道路；提供农产品生物活性物质作为体内抗氧化应激损伤剂以及在抵御氧化应激产品中的应用；所述农产品提取物能够用于激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路，促进抗氧化酶和细胞保护蛋白的表达。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种具有抵御氧化应激反应作用的农产品的筛选方法，步骤如下：

(1)选取农产品样品进行冻干、粉碎，在无水乙醇中充分溶解，过滤后浓缩得到农产品提取物，或在80～100℃水中充分溶解，过滤取上清，冻干后得到农产品提取物；

(2)培养肝癌细胞HepG2细胞系，测定步骤(1)所述的农产品提取物对细胞的活性的影响；

(3)再采用基因载体pGL4.37-ARE与内对照报告基因载体pGL4.75共转染HepG2细胞，建立双荧光酶报告基因体系，测定细胞荧光素酶活性值。

优选地，筛选出不会引起细胞毒性，并且可以激活Keap1-Nrf2-ARE通路的农产品提取物。

优选地，所述农产品为12种日本北海道农产品，所述农产品为土豆、去皮土豆、土豆皮、南瓜、百合根、胡萝卜、洋葱、米糠、红豆、大正金时豆、Kitarosso金时豆和甜菜。

优选地，所述步骤1中所述乙醇提取物是选取500～1000g的8种日本北海道农产品进进行冻干、粉碎，在1～2L无水乙醇中充分溶解，并振荡24h，乙醇处理农产品过滤掉滤渣后，使用旋转蒸发仪浓缩提取液制得乙醇提取物；所述8种日本北海道农产品为土豆、去皮土豆、土豆皮、南瓜、百合根、胡萝卜、洋葱和米糠。

优选地，所述步骤(1)中所述热水提取物是选取100～500g的4种日本北海道农产品分别为红豆、大正金时豆，Kitarosso金时豆和甜菜，将农产品进行冻干、粉碎，溶于500mL热水中蒸煮3～4h，过滤后取上清，其中甜菜进行脱糖处理，浓缩冻干后得到热水提取物。

优选地，所述步骤(2)中所述细胞活性采用CCK-8法检测。与对照组相比，P＜0.05的细胞活力均显著下降，说明引起毒性。

优选地，所述步骤(3)使用lipofectamin3000转染试剂以1:100的比例同时转染ARE荧光素酶报告质粒pGL4.37和对照质粒pGL4.75，培养24h；培养结束后，各孔分别加入100～500μg/ml多种不同浓度的样品，以10μmol/L的Nrf2激活剂tBHQ作为阳性对照，培养24h；弃上清液，用Dual-Luciferase检测系统检测；通过萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性对比，得到相应荧光素酶活性值。与对照组相比，P＜0.05的荧光素酶活性显著提高，可以明显激活细胞中的Keap1-Nrf2-ARE通路，具有显著抵御氧化应激的活性。

本发明具有抵御氧化应激反应作用的农产品的应用，所述具有抵御氧化应激反应作用的农产品提取物用于Keap1-Nrf2-ARE信号通路的激活剂。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的研究显示，去皮土豆、南瓜、米糠以及甜菜提取物可以显著抵御氧化应激反应，并不引起细胞毒性。本发明的研究表明，在低浓度125μg/ml时，土豆，土豆皮和Kitarosso金时豆提取物有显著的细胞毒性，土豆、去皮土豆、土豆皮和红豆提取物显示出较强的抵御氧化应激反应活性。在中浓度250μg/ml时，土豆，土豆皮和Kitarosso金时豆提取物有显著的细胞毒性，土豆、去皮土豆、土豆皮、南瓜和Kitarosso金时豆提取物显示出较强的抵御氧化应激反应活性。在高浓度500μg/ml时，土豆、土豆皮、胡萝卜、红豆和Kitarosso金时豆提取物有显著的细胞毒性，土豆、去皮土豆、南瓜、米糠、Kitarosso金时豆和甜菜提取物显示出较强的抵御氧化应激反应活性。

(2)本发明开发了具有抵御氧化应激反应作用的农产品作为Keap1-Nrf2-ARE信号通路激活剂的新用途，可作为功能性食品用于氧化应激损伤相关疾病的防治。

附图说明

说明书各附图所表达的内容及图中的标记做出简要的说明；

图1为实施例1中农产品在浓度为125μg/ml时的活性图；其中，图(A)为细胞活性；图(B)为荧光素酶活性图。

图2为实施例1中农产品在浓度为250μg/ml时的活性图；其中，图(A)为细胞活性；图(B)为荧光素酶活性图。

图3为实施例1中农产品在浓度为500μg/ml时的活性图；其中，图(A)为细胞活性；图(B)为荧光素酶活性图。

图4为实施例1中土豆、土豆皮和Kitarosso金时豆在三个浓度(125μg/ml、250μg/ml、500μg/ml)的活性对比图；其中，图(A)为细胞活性对比图；图(B)为荧光素酶活性对比图。

图5为实施例1中去皮土豆、南瓜、米糠和甜菜在三个浓度(125μg/ml、250μg/ml、500μg/ml)的活性对比图；其中，图(A)为细胞活性对比图；图(B)为荧光素酶活性对比图。

(图中P为阳性对照DHMBA(3,5-dihydroxy-4-methoxybenzylalcohol)；1土豆；2去皮土豆；3土豆皮；4南瓜；5百合根；6胡萝卜；7洋葱；8米糠；9红豆；10大正金时豆；11Kitarosso金时豆；12甜菜；图中

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

一种具有抵御氧化应激反应作用的农产品的筛选方法，步骤如下：

步骤一：原料制备：

选取8种(土豆；去皮土豆；土豆皮；南瓜；百合根；胡萝卜；洋葱；米糠)500～1000g日本北海道农产品进行冻干、粉碎，在1～2L无水乙醇中充分溶解，并振荡24h，乙醇处理农产品过滤掉滤渣后，浓缩提取液得到乙醇提取物；

选取4种日本北海道农产品(红豆，大正金时豆，Kitarosso金时豆和甜菜)100～500g冻干、粉碎后，溶于500mL热水中蒸煮3～4h，过滤后取上清(甜菜进行脱糖处理)，浓缩冻干后得到热水提取物。

步骤二：细胞培养方法及CCK-8实验模型的建立：

1、细胞培养方法

为了评估不同农产品活性物质对抵御细胞氧化应激的影响，建立肝癌细胞HepG2细胞系，用DMEM培养基(含10％(v/v)牛血清FBS和1％抗生素)置于5％CO

2、CCK-8细胞活力实验

使用CCK-8试剂盒考察高、中、低浓度的农产品提取物对HepG2细胞活力的影响。取对数生长期的HepG2细胞，以4×10

计算细胞存活率:细胞存活率(％)＝(As－Ab/Ac－Ab)×100％

其中As代表实验孔的吸光度，Ab代表空白孔的吸光度，Ac代表对照孔的吸光度

步骤三：双荧光素报告基因检测实验：

取对数生长期的HepG2细胞，以4×10

诱导表达倍数＝(药物诱导的Luciferase/药物诱导的Renilla)/(基培对照组的Luciferase/基培对照组的Renilla)。

选取实施例1制备的农产品提取物都采用CCK-8法测定细胞活性和采用基因载体pGL4.37-ARE与内对照报告基因载体pGL4.75共转染HepG2细胞，建立双荧光酶报告基因体系测定细胞荧光素酶活性，得到图1～5。由图1A可知，在提取物浓度为125μg/ml时，与对照组相比，土豆、土豆皮和Kitarosso金时豆的细胞活力均显著下降，其中土豆皮对细胞的毒性最强(P＜0.01)；图1B显示了在相同浓度(125μg/ml)下各提取物的荧光素酶活性，与对照组相比，土豆、去皮土豆、土豆皮和红豆的荧光素酶活性显著提高，可以明显激活细胞中的Keap1-Nrf2-ARE通路，其中土豆皮具有极显著抵御氧化应激的活性(P＜0.01)。但由于土豆皮的细胞毒性较强，推断土豆皮抗氧化活性是由细胞毒性引起的。另外，去皮土豆和红豆可以显著提高荧光素酶活性(P＜0.05)并不引起细胞毒性，说明去皮土豆和红豆可能通过Keap1-Nrf2-ARE通路发挥抵御氧化应激作用。综上所述，在125μg/ml浓度下去皮土豆和红豆的荧光素酶活性较强且不引起细胞毒性，发挥抵御氧化应激反应的效果。

由图2A可知，在提取物浓度为250μg/ml时，与对照组相比，同样土豆、土豆皮和Kitarosso金时豆的细胞活力均显著下降，其中土豆皮对细胞的毒性最强(P＜0.01)；图2B显示了在相同浓度(250μg/ml)下各提取物的荧光素酶活性，与对照组相比，土豆、去皮土豆、土豆皮、南瓜和Kitarosso金时豆的荧光素酶活性显著提高(P＜0.05)，其中土豆、去皮土豆、土豆皮和南瓜具有极其显著特性(P＜0.01)，都明显优于对照组。其中去皮土豆和南瓜不引起细胞毒性。综上所述，在250μg/ml浓度下，去皮土豆和南瓜的荧光素酶活性较强且不引起细胞毒性，发挥抵御氧化应激反应的效果。

由图3A可知，在提取物浓度为500μg/ml时，与对照组相比，土豆、去皮土豆、土豆皮、胡萝卜、红豆和金时豆(Kitarosso)的细胞活性均显著下降，其中，土豆、土豆皮、胡萝卜、红豆和金时豆(Kitarosso)对细胞的毒性较强(P＜0.01)；图3B展示了在相同浓度(500μg/ml)下各提取物的荧光素酶活性，与对照组相比，土豆、去皮土豆、南瓜、米糠、Kitarosso金时豆和甜菜的荧光素酶活性显著提高(P＜0.05)，其中土豆、去皮土豆、南瓜和米糠具有极其显著特性(P＜0.01)，都明显优于对照组，值得一提的是南瓜明显优于阳性对照组；综上所述，在500μg/ml浓度下，南瓜、米糠和甜菜的荧光素酶活性较强且不引起细胞毒性，发挥抵御氧化应激反应的效果。

由图4A可知，在低、中、高三个浓度下，土豆、土豆皮和Kitarosso金时豆都呈现显著的浓度依赖性，其细胞活性都随浓度的升高而降低，三个平行组相比较，土豆皮的细胞活性最低，证明其毒性最高，其中所有实验组都具有显著性(P＜0.05)；图4B荧光素酶活性图显示土豆随浓度的升高荧光素酶活性升高，土豆皮和Kitarosso金时豆随浓度升高呈现先升高后降低的趋势，其中除Kitarosso金时豆外在浓度为125μg/ml时无显著性外，其余实验组都具有显著性(P＜0.05)；以上实验结果证明土豆、土豆皮和Kitarosso金时豆的荧光素酶活性可能由于细胞毒性引起。

由图5A可知，去皮土豆、南瓜、米糠和甜菜在所有低、中、高浓度下均无明显降低细胞活性的表现，这就表明这些农产品无明显细胞毒性；由图5B荧光素酶活性图显示：随浓度上升，去皮土豆、南瓜、米糠和甜菜的荧光素酶活性都呈升高趋势，其中南瓜在浓度为500μg/ml时的荧光素酶活性最强，明显高于阳性对照组。通过以上结果可以得知去皮土豆、南瓜和米糠的乙醇提取物和甜菜的脱糖热水提取物能激活Keap1-Nrf2-ARE通路，可能具有可以改善酒精肝和非酒精性肝炎的症状的作用，可以深入进行研究。

以上实施例对本发明的产品及方法进行了详细介绍，本文中应用了具体例对本发明的主要步骤及实施方式进行了阐述，上述实施例只是帮助理解本发明的方法及核心原理。对于本领域的技术人员，依据本发明的核心原理，在具体实施中会对各条件和参数根据需要而变动，综上所述，本说明书不应理解为对本发明的限制。