一种用于中国仓鼠卵巢细胞克隆形成的培养基

摘要

本发明提供了一种用于中国仓鼠卵巢细胞克隆形成的培养基，本发明提供的培养基不含血清、不含动物来源的组分，本发明所提供的克隆培养基，能够使CHO细胞的克隆成团更紧密、扩散少，并且克隆的生长速度快，能够更高效地挑选出适合生产使用目的的表达克隆。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种用于中国仓鼠卵巢细胞克隆形成的培养基。

背景技术

现有生物制品的生产，根据其生产目的、成本控制等多种因素，选择不同种类的生物制品的生产表达系统。常用的生产表达生物制品的表达系统有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。

大肠杆菌表达系统特点在于遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达的产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强、及适用范围广。

酵母表达系统的特点是酵母是一种单细胞低等真核生物，具有翻译后修饰功能，且酵母的培养条件简单，生长繁殖迅速，能够耐受较高的流体静压，用于生物制品表达，可以大规模生产，有效降低成本。

昆虫表达系统也属于真核表达系统，昆虫细胞表达系统原理是通过转座作用将转移载体组件定点转座到能在大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体上，通过抗性和蓝白斑筛选到重组穿梭质粒，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒，将病毒上清浸染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白。其表达的蛋白可以有正确的折叠、二硫键的搭配，具有蛋白翻译后的加工修饰，也可以容纳大分子的插入片段，能够同时表达多个基因，但是缺点是外源蛋白表达处于极晚期病毒启动子的调控下。

哺乳动物细胞表达系统在蛋白的起始信号、加工、分泌、糖基化方面具有独特优势，适合表达完整的大分子蛋白，由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远远胜过其他表达系统，更接近于天然蛋白质。

哺乳动物细胞表达系统中，中国仓鼠卵巢细胞（CHO，Chinese hamster ovarycells）表达系统是目前较为广泛的生物制品表达系统。CHO表达系统具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白质在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长，也可以悬浮生长，且具有较高的耐受剪切力和渗透压的能力；具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；并且能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。

使用中国仓鼠卵巢细胞表达系统，其表达生物制品的步骤包括：外源基因的合成，表达载体构建，将外源基因导入适合CHO宿主细胞表达的载体；转染，将含有目的基因的载体转染至CHO宿主细胞中；基因扩增；筛选出符合条件的克隆；克隆培养；目标蛋白的表达、分离纯化。

在CHO细胞表达系统中，克隆的筛选是非常重要的一个环节，根据细胞筛选目的的不同，可以分为基于目标蛋白产量的筛选和基于生理生化特征的筛选。在克隆筛选过程中，克隆的形成率、克隆形成的状态、克隆的生长速度、及克隆成团的状态等，都会影响克隆的筛选结果，如何更有效、快速地选取符合生产目的的克隆，是生物制品生产表达的一个至关重要的环节。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种用于中国仓鼠卵巢细胞克隆形成的培养基，本发明提供的培养基不含血清、不含动物来源的组分，该培养基与现有CHO细胞克隆培养基相比，其克隆形成率较高，使用本发明所提供的克隆培养基，能够使CHO细胞的克隆成团更紧密、扩散少，并且克隆的生长速度快，能够更高效地挑选出适合生产使用目的的表达克隆。

本发明提供的培养基为CHOM-C2系列，该系列培养基是在本公司上海迈泰君奥生物技术有限公司产品CHOM-B09的基础上进一步改进而得。CHOM-B09是一种无血清、无动物源组分的培养基，其中不含有L-谷氨酰胺，用于CHO细胞的克隆形成及生长。

在培养基CHOM-B09的基础上调节培养基的氨基酸、维生素、核苷、微量元素及乙醇胺等，形成克隆培养基CHOM-C2-1、CHOM-C2-5、CHOM-C2-6。

本发明所公开的用于CHO细胞克隆筛选的培养基，所述克隆筛选培养基在CHOM-B09培养基的基础上添加氨基酸、维生素、微量元素、乙醇胺及核苷。

所述克隆培养基在CHOM-B09培养基的基础上添加的氨基酸为3～1000mg/L的半胱氨酸、2～2000mg/L的胱氨酸、2.5～800mg/L的苯丙胺酸、1～1000mg/L的脯氨酸、及2.5～500mg/L的酪氨酸。

所述克隆培养基在CHOM-B09培养基的基础上添加的维生素为0.1～80mg/L的叶酸、0.03～80mg/L的肌醇、0.1～20mg/L的核黄素、及0.01～50mg/L的维生素B12。

所述克隆培养基在CHOM-B09培养基的基础上添加的微量元素为0.01～0.5mg/L的氯化钴、0.001～0.006mg/L的硫酸铜、0.01～50mg/L的硫酸锌、及0.01～0.5mg/L的氯化锡。

所述克隆培养基在CHOM-B09培养基的基础上添加的乙醇胺为1～20mg/L，添加的核苷为0.2～50mg/L的胸苷、0.1～60mg/L的胞苷、0.05～60mg/L的尿苷、0.1～70mg/L的腺苷、及0.02～50mg/L的鸟苷。

所述克隆培养基在CHOM-B09培养基的基础上添加的氨基酸为10～600mg/L的半胱氨酸、2～1000mg/L的胱氨酸、2.5～500mg/L的苯丙胺酸、1～800mg/L的脯氨酸、及2.5～500mg/L的酪氨酸；添加的维生素为0.1～60mg/L的叶酸、0.03～60mg/L的肌醇、0.1～20mg/L的核黄素、及0.01～30mg/L的维生素B12；添加的微量元素为0.01～0.3mg/L的氯化钴、0.001～0.005mg/L的硫酸铜、0.01～20mg/L的硫酸锌、及0.01～0.3mg/L的氯化锡；添加的乙醇胺为1～10mg/L，添加的核苷为0.2～50mg/L的胸苷、0.1～60mg/L的胞苷、0.05～60mg/L的尿苷、0.1～70mg/L的腺苷、及0.02～50mg/L的鸟苷。

本发明所公开的CHO细胞克隆筛选培养基的应用，所述克隆筛选培养基用于蛋白质类药物CHO细胞表达的克隆筛选。所述克隆培养基用于单克隆抗体、双功能融合蛋白、细胞因子类药物的CHO细胞表达的克隆筛选。

使用上述培养基进行CHO细胞的克隆筛选，通过有限稀释法获得克隆并测试克隆培养基性能。在10cm培养皿中通过三次稀释将细胞密度降至目标浓度，每次稀释倍数不高于100倍。每种培养基对应一块96孔培养板，每孔添加含有细胞的培养基200ul，理论细胞数为0.5个/孔。96孔板第一行第一列孔标记为A1孔，此孔中加入2000～3000个细胞，作为成像对照孔。使用Solentim但克隆成像仪观察克隆形成过程，并在克隆生长第7天对克隆进行拍照。

细胞筛选最常用的方法是有限稀释法，有限稀释法的步骤为：1）把细胞低密度接种到96孔板中，使每孔中平均细胞数小于1；2）在显微镜下检查96孔板中仅有单个细胞的孔，这些孔用于后续的检测；3）细胞在96孔板中培养约10天时，单个细胞可以长成克隆，如果标记孔中细胞仍然存活，则用酶联免疫吸附法（ELISA）检测上清中抗体产量，从中挑出产量高的克隆；4）由于每孔中实际细胞数往往不止一个，为了保证分离得到真正的克隆，一般来说，常常进行第二轮克隆。

经过本发明所提供的无血清、无动物源成分的CHO细胞克隆筛选培养基CHOM-C系列培养基培养的CHO细胞，克隆形成率高，克隆成团紧密、扩散少，并且克隆细胞生长速度快，克隆筛选的各种指标均优于阳性对照品克隆培养基MediumA（Ex-cell CloningMedium，C6366，Sigma）。

附图说明

图1、不同克隆培养基的第7天克隆的生长状态；

图2、不同克隆培养基的第7天克隆的生长形态；

图3、不同克隆培养基形成的克隆抗体表达情况。

具体实施例

实施例1、筛选方法

本发明中所使用的中国仓鼠卵巢细胞CHO来源于CHO-K1，使用该宿主细胞进行单克隆抗体表达的克隆筛选。细胞培养温度为37℃，通二氧化碳含量为5%。

基因合成所要表达的抗体基因序列，制备含有该种抗体基因序列的表达载体，转染CHO-K1宿主细胞，进行细胞培养，克隆筛选。

CHO细胞克隆筛选采用有限稀释法进行，使用无血清、无动物来源成分的培养基CHOM-C2-1、CHOM-C2-5、CHOM-C2-6进行CHO细胞的培养，无血清、无动物来源成分的克隆培养基CHOM-C2-1、CHOM-C2-5、CHOM-C2-6有利于中国仓鼠卵巢细胞系的克隆存活和生长，可替代传统的使用10%胎牛血清的培养方法。

克隆培养基CHOM-C2-1、CHOM-C2-5、CHOM-C2-6不含有抗生素、抗真菌药、L-谷氨酰胺、胰岛素或转铁蛋白，含有无机盐、碳酸氢钠、必需和非必需氨基酸、维生素、微量元素、植物水解产物和其他有机化合物。

克隆培养基CHOM-C2-1、CHOM-C2-5、CHOM-C2-6是在上海迈泰君奥生物技术有限公司所市售的克隆培养基CHOM-B09基础上制备而成。克隆培养基CHOM-C2-1、CHOM-C2-5、CHOM-C2-6在克隆培养基CHOM-B09的基础上调节培养基的氨基酸、维生素、核苷、微量元素及乙醇胺等，形成克隆培养基CHOM-C2-1、CHOM-C2-5、CHOM-C2-6。

不同克隆培养基配方如表1所示。

表1、不同克隆培养基组成成分

优选培养基C2-1为：半胱氨酸200~260 mg/L、胱氨酸350~400 mg/L、苯丙氨酸80~100mg/L、脯氨酸600~700 mg/L、酪氨酸100~150 mg/L、叶酸30~50 mg/L、肌醇10~18 mg/L、核黄素5~10 mg/L、维生素B12 1~4 mg/L、氯化钴0.1~0.3 mg/L、硫酸铜0.002~0.006 mg/L、硫酸锌10~15 mg/L、氯化锡0.08~0.2 mg/L、乙醇胺3~7 mg/L、胸苷0 mg/L、胞苷0 mg/L、尿苷0mg/L、腺苷0 mg/L、鸟苷0 mg/L。

优选培养基C2-5为：半胱氨酸800~850 mg/L、胱氨酸1100~1200 mg/L、苯丙氨酸300~350 mg/L、脯氨酸600~700 mg/L、酪氨酸100~150 mg/L、叶酸1~10 mg/L、肌醇0.3~8mg/L、核黄素0.1~5 mg/L、维生素B12 0.1~1 mg/L、氯化钴0.03~0.1 mg/L、硫酸铜0.002~0.006 mg/L、硫酸锌0.1~10 mg/L、氯化锡0.08~0.2 mg/L、乙醇胺8~12 mg/L、胸苷0 mg/L、胞苷0 mg/L、尿苷0 mg/L、腺苷0 mg/L、鸟苷0 mg/L。

优选培养基C2-6为：半胱氨酸450~500 mg/L、胱氨酸400~450 mg/L、苯丙氨酸80~100 mg/L、脯氨酸600~700 mg/L、酪氨酸100~150 mg/L、叶酸30~50 mg/L、肌醇10~18 mg/L、核黄素5~10 mg/L、维生素B12 6~9 mg/L、氯化钴0.1~0.3 mg/L、硫酸铜0.002~0.006 mg/L、硫酸锌10~15 mg/L、氯化锡0.08~0.2 mg/L、乙醇胺10~15 mg/L、胸苷10~12 mg/L、胞苷8~10mg/L、尿苷6~9 mg/L、腺苷8~10 mg/L、鸟苷10~15 mg/L。

使用上述培养基进行CHO细胞的克隆筛选，通过有限稀释法获得克隆并测试克隆培养基性能。在10cm培养皿中通过三次稀释将细胞密度降至目标浓度，每次稀释倍数不高于100倍。每种培养基对应一块96孔培养板，每孔添加含有细胞的培养基200ul，理论细胞数为0.5个/孔。96孔板第一行第一列孔标记为A1孔，此孔中加入2000～3000个细胞，作为成像对照孔。使用Solentim但克隆成像仪观察克隆形成过程，并在克隆生长第7天对克隆进行拍照。

不同克隆培养基的第7天克隆生长状态如图1所示。96孔板中不同培养基培养CHO细胞克隆7天，克隆的形成情况，A图为培养基C2-1，B图为C2-5，C图为C2-6，D图为阳性对照培养基MediumA，E图为阴性对照MediumB，符号“×”表示此孔中无克隆形成，A1孔为成像对照孔。

阳性对照克隆培养基MediumA为Ex-cell Cloning Medium，C6366，Sigma。

阴性对照克隆培养基MediumB为Balan CD CHO Growth A，Irvine Scientific。

不同克隆培养基的克隆形成率结果见表2。

表2、不同培养基克隆形成率

经过不同的克隆培养基培养后，所形成的克隆性他如图2所示。不同克隆培养基培养CHO细胞克隆7天，形成的克隆形态，A图为克隆培养基C2-1，B图为克隆培养基C2-6，C图为阳性对照培养基MediumA。

实施例2、克隆对照

使用不同的克隆培养基对CHO细胞克隆培养后，对所获得对克隆所表达的蛋白质的表达量进行测定。使用斑点杂交法进行蛋白质表达量测定，克隆培养12天时，从96孔板中吸取细胞培养上清1.5ul于硝酸纤维素（NC）膜上，静置5min后，置于10%脱脂奶粉中室温孵育2h。用磷酸缓冲盐（PBS）清洗2次，每次3～5min；加入1:1000稀释的抗体，室温孵育1h。使用含有0.1%Tween20的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗5次后，放置于DAB显色液中显色3～5min。

不同克隆培养基所获得的克隆的蛋白质表达量结果如图3所示。使用不同的克隆培养基培养CHO细胞克隆12天，检测不同克隆培养基所培养的克隆抗体表达情况，不同斑点颜色深浅代表抗体表达量多少，颜色越深，抗体表达量就越高，符号“+”代表阳性对照，符号“—”代表阴性对照，A图为克隆培养基C2-1，B图为克隆培养基C2-6，C图为阳性对照培养基MediumA。

由上述实施例的实验结果可知，经过本发明所提供的无血清、无动物源成分的CHO细胞克隆筛选培养基CHOM-C系列培养基培养的CHO细胞，克隆形成率高，克隆成团紧密、扩散少，并且克隆细胞生长速度快，克隆筛选的各种指标均优于阳性对照品克隆培养基MediumA（Ex-cell Cloning Medium，C6366，Sigma）。