一种适用于不同盐度水体中常见膦酸酯的检测方法

摘要

一种适用于不同盐度水体中常见膦酸酯的检测方法，涉及水体中膦酸酯的检测方法。提供具有操作简单、对仪器要求较低且能够同时测定四种膦酸酯的一种适用于不同盐度水体中常见膦酸酯的检测方法。可利用高效液相色谱荧光法分离并测定水体中常见膦酸酯—草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸2‑氨乙基膦酸浓度的方法。具体步骤为：利用芴甲氧羰酰氯作为衍生剂与膦酸酯发生反应，反应产物经过滤后进入高效液相色谱进行分离和测定。具有操作简单、对仪器要求较低、样品测定时间短、可同时测定四种膦酸酯等优点，能够适用于不同盐度水体中膦酸酯的测定。

说明书

技术领域

本发明涉及水体中膦酸酯的检测方法，特别是涉及一种适用于不同盐度水体中常见膦酸酯的检测方法。

背景技术

有机磷是海洋中磷的重要形态之一，在海洋生物地球化学循环中起着十分重要的作用。膦酸酯作为一种耐光解、耐高温的化学性质稳定的C-P键有机磷，其各方面的研究还较为欠缺。近年来，以草甘膦、草铵膦为代表的C-P键有机磷农药在全球各地被广泛使用，草铵膦、草甘膦以及草甘膦的主要降解产物氨甲基膦酸在环境中不断累积，对环境安全和人类健康造成一定威胁。另一方面，以2-氨乙基膦酸为代表的生物源膦酸酯，广泛存在于低等生物中。在磷限制条件下的水环境中，2-氨乙基膦酸可以作为某些生物的潜在磷源。为了了解上述膦酸酯在水环境中的含量及其对环境的影响，研究海洋磷循环等，建立膦酸酯的测定方法十分必要。

膦酸酯由于缺乏发色基团，不能直接通过高效液色谱进行检测。目前，这四种膦酸酯的测定主要通过与衍生剂反应生成带有荧光性质的衍生产物后，采用高效液相色谱荧光法或液相色谱-质谱联用的方法进行检测。但是液相色谱-质谱价格昂贵，操作也较复杂，不适宜推广使用。此外，目前多数已有的膦酸酯测定方法仅针对淡水样品中膦酸酯的测定，对于近海、河口等地区的样品由于存在不同含量的盐分，会对测定结果造成一定的影响。针对以上问题，本发明旨在建立一种水体中常见膦酸酯的分析方法，此方法具有操作简便、对仪器要求较低、不受样品基底盐度的影响、能够同时测定多种膦酸酯等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供具有操作简单、对仪器要求较低且能够同时测定四种膦酸酯的一种适用于不同盐度水体中常见膦酸酯的检测方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种适用于不同盐度水体中常见膦酸酯的检测方法，利用芴甲氧羰酰氯与样品中的膦酸酯发生衍生反应，再采用高效液相色谱荧光法对膦酸酯衍生产物进行分析测定，具体步骤如下：

1)取1～600μL待测水样，用盐度计对其盐度进行测定；

2)取步骤1)的待测水样，依次加入1～599μL超纯水，50～150μL的硼酸盐缓冲溶液，100～300μL甲醇和50～150μL芴甲氧羰酰氯溶液，用涡旋振荡器快速、充分地混匀；

3)吸取步骤2)得到的混合溶液，经0.22μm的针式过滤器过滤至进样小瓶中，衍生反应30～120min后用高效液相色谱荧光法进行测定，得到样品中膦酸酯色谱峰的峰面积；

4)选取与待测样品盐度相同的空白基质水样2～20份，依次加入不同体积同一浓度的膦酸酯标准溶液，用空白基质水样定容至500μL，得到不同浓度的膦酸酯标准溶液；

5)将步骤4)得到的膦酸酯标准溶液依次按照步骤2)、3)处理，得到不同浓度膦酸酯标准溶液中膦酸酯色谱峰的峰面积，根据膦酸酯浓度和对应的峰面积建立膦酸酯标准工作曲线；

6)将步骤3)得到的样品中膦酸酯色谱峰的峰面积带入步骤5)得到的膦酸酯工作曲线，计算得到样品中膦酸酯的浓度。

在步骤2)中，硼酸盐缓冲溶液浓度为0.10～0.30mol/L，芴甲氧羰酰氯溶液的浓度为5.0～7.0mmol/L。

在步骤3)中，高效液相色谱荧光法分析时流动相中有机相为乙腈、无机相为乙酸铵(pH＝9.0)。

在步骤3)中，高效液相色谱荧光法分析采用梯度洗脱程序，先用10％～30％的有机相分离膦酸酯，再用70％的有机相洗脱多余的衍生剂，最后将有机相降至初始比例。

在步骤3)中，进行高效液相色谱荧光法分析检测时采用的色谱柱为C18色谱柱。

本方法常见膦酸酯包括草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸和2-氨乙基膦酸。

本方法不受样品盐度的影响，可用人工海水或天然海水配制与样品盐度相同的标准曲线溶液，从而无需对测定结果进行盐度校正。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案适用于不同盐度水样中常见膦酸酯的测定，通过衍生条件的选择与优化，以及选择与样品盐度相同的基底配制标准曲线溶液，消除了盐度对测定结果的影响，因此样品测定时无需除盐，可直接与衍生剂反应后进行测定。测定仪器选用高效液相色谱-荧光检测器，操作较为简单且灵敏度高，能够较好地应用于不同水样中膦酸酯的测定。

附图说明

图1为本发明实施例2中样品中膦酸酯测定结果的色谱图。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的描述。

本发明实施例具体步骤如下：

1)取1～600μL含待测水样，用盐度计对其盐度进行测定。

2)取步骤1)的待测水样，依次加入1～599μL超纯水，50～150μL的硼酸盐缓冲溶液，100～300μL甲醇和50～150μL芴甲氧羰酰氯溶液，用涡旋振荡器快速、充分地混匀；硼酸盐缓冲溶液浓度为0.10～0.30mol/L，芴甲氧羰酰氯溶液的浓度为5.0～7.0mmol/L。

3)吸取步骤2)得到的混合溶液，经0.22μm的针式过滤器过滤至进样小瓶中，衍生反应30～120min后用高效液相色谱荧光法进行测定，得到样品中膦酸酯色谱峰的峰面积；常见膦酸酯包括草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸和2-氨乙基膦酸。高效液相色谱荧光法分析时流动相中有机相为乙腈、无机相为乙酸铵(pH＝9.0)；高效液相色谱荧光法分析采用梯度洗脱程序，先用10％～30％的有机相分离膦酸酯，再用70％的有机相洗脱多余的衍生剂，最后将有机相降至初始比例。进行高效液相色谱荧光法分析检测时采用的色谱柱为C18色谱柱。

4)选取与待测样品盐度相同的空白基质水样2～20份，依次加入不同体积同一浓度的膦酸酯标准溶液，用空白基质水样定容至500μL，得到不同浓度的膦酸酯标准溶液；

5)将步骤4)得到的膦酸酯标准溶液依次按照步骤2)、3)处理，得到不同浓度膦酸酯标准溶液中膦酸酯色谱峰的峰面积，根据膦酸酯浓度和对应的峰面积建立膦酸酯标准工作曲线；

6)将步骤3)得到的样品中膦酸酯色谱峰的峰面积带入步骤5)得到的膦酸酯工作曲线，计算得到样品中膦酸酯的浓度。

实施例1

运用本发明建立盐度为10的膦酸酯的工作曲线。

使用盐度为10的人工海水分别配制含有5个不同浓度梯度的四种膦酸酯的混合标准溶液，分别为标准溶液1：草甘膦80.0μg/L，草铵膦50.0μg/L，氨甲基膦酸20.0μg/L，2-氨乙基膦酸150μg/L；标准溶液2：草甘膦160μg/L，草铵膦100μg/L，氨甲基膦酸40.0μg/L，2-氨乙基膦酸300μg/L；标准溶液3：草甘膦240μg/L，草铵膦150μg/L，氨甲基膦酸60.0μg/L，2-氨乙基膦酸450μg/L；标准溶液4：草甘膦320μg/L，草铵膦200μg/L，氨甲基膦酸80.0μg/L，2-氨乙基膦酸600μg/L；标准溶液5：草甘膦400μg/L，草铵膦250μg/L，氨甲基膦酸100μg/L，2-氨乙基膦酸750μg/L。分别取上述5个标准溶液500μL，依次加入100μL超纯水，100μL浓度为0.20mmol/L的硼酸盐缓冲溶液，200μL甲醇和100μL浓度为6.0mmol/L芴甲氧羰酰氯溶液，用涡旋振荡器快速、充分地混匀。将反应后的衍生产物混合溶液经过0.22μm的针式过滤器过滤后置于色谱进样瓶中。取20μL样品注入高效液相色谱中，色谱柱为Phenomen Gemini NXC18(4.6×250mm，5μm)，荧光检测器的激发波长为265nm，发射波长为315nm。流动相采用乙腈作为有机相，pH＝9.0的乙酸氨作为无机相。梯度洗脱程序为0～10min，恒定20％的有机相；10～13min，20％～70％有机相；13～24min，恒定70％有机相；24～27min，70％～20％有机相；27～30min，恒定20％有机相。四种膦酸酯测定的标准工作曲线如表1所示。

表1盐度为10的膦酸酯的标准工作曲线

实施例2

运用本发明测定海水生物培养样品中四种膦酸酯的含量。

使用盐度计对待测海水生物培养样品的盐度进行测定，测得其盐度为30，使用超纯水将其盐度稀释至10。取500μL稀释后的样品，依次加入100μL超纯水，100μL浓度为0.20mmol/L的硼酸盐缓冲溶液，200μL甲醇和100μL浓度为6.0mmol/L芴甲氧羰酰氯溶液，用涡旋振荡器快速、充分地混匀。将反应后的溶液经过0.22μm的针式过滤器过滤后置于色谱进样瓶中。取20μL样品注入高效液相色谱中，色谱柱为Phenomen Gemini NX C18(4.6×250mm，5μm)，荧光检测器的激发波长为265nm，发射波长为315nm。色谱的流动相采用乙腈作为有机相，pH＝9.0的乙酸氨作为无机相。梯度洗脱程序为0～10min，恒定20％有机相；10～13min，20％-70％有机相；13～24min，恒定70％有机相；24～27min，70％～20％有机相；27～30min，恒定20％有机相。样品的色谱图如图1所示；选取与样品盐度相同的标准工作曲线计算得到样品中膦酸酯的含量，结果如表2所示。

表2样品中膦酸酯的测定结果

实验表明，本发明具有操作简单、对仪器要求较低、样品测定时间短、可同时测定四种膦酸酯等优点，能够适用于不同盐度水体中膦酸酯的测定。