利用目标基因测序检测TRPC6基因致病突变的方法

摘要

本发明公开了利用目标基因测序检测TRPC6基因致病突变的方法，应用二代测序技术对表现原发性肾病综合征的患儿进行TRPC6基因的基因测序，并进行相关的生物信息学分析。设计TRPC6的13个外显子区域特异性捕获探针，与基因组DNA文库进行杂交，将目标基因组区域的DNA片段进行富集后，再利用illumina Nextseq第二代测序仪进行测序，并与正常壮族儿童进行对比，通过数据分析确定突变位点。经过数据分析，发现2号外显子上的c.172C>T(p.R58W)杂合突变，可导致相关蛋白表达和功能异常，考虑为中国广西壮族儿童致病突变。

说明书

【技术领域】

本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及利用目标基因测序检测TRPC6基因致病突变的方法，尤其涉及利用目标基因测序技术检测中国广西壮族儿童原发性肾病综合征TRPC6基因致病突变的方法。

【背景技术】

肾病综合征(nephrotic syndrome，NS)是由于肾小球滤过膜对血浆蛋白的通透性增高、大量血浆蛋白从尿中丢失而导致一系列病理生理改变的一种临床综合征。儿童原发性肾病综合征(primary nephritic syndrome，PNS)是一类严重影响患儿正常生长发育的免疫介导的肾小球疾病，对儿童生命健康以及生活质量造成了严重的影响。肾脏致病基因的研究已成为行业的热点，筛选PNS的发生发展中起关键作用的基因，并给予特异性干预，对于治疗PNS具有重要意义。TRPC6基因定位于11号染色体的长臂21区到22区(11q21-q22)，含13个外显子，人类的该基因突变可表现常染色体显性遗传的家族性局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomurular sclerosis，FSGS)。TRPC是瞬时受体电位(transientreceptor potential，TRP)家族主要成员之一，TRP包括TRPC、TRPV、TRPM、TRPP、TRPN及TRPML 6个蛋白家族成员，每个成员又有许多亚型，除TRPN外，其他成员在人类均有表达。TRPC包括7个亚族，即TRPC1、2、3、4、5、6、7，TRPC6与TRPC3、7氨基酸序列的相似度高达90％，TRPC通道在人体广泛表达，包括神经系统、血液系统、平滑肌、卵巢、肺、脾、肾等人体重要脏器。瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(transient channel receptor potential cation 6,TRPC6)是由TRPC6基因编码的一种裂孔隔膜(slit diaphragm,SD)蛋白，SD由相邻的足细胞足突有规律地相互交错形成，为肾小球滤过屏障的重要组成部分，在维持肾小球滤过膜的完整性中起重要作用。多因素作用导致肾小球足细胞损伤引起SD的足突融合是肾脏疾病最主要的形态学改变。TRPC6于肾脏组织表达甚广，肾小球足细胞、系膜细胞、内皮细胞以及肾小管间质血管壁、上皮细胞均有表达，也表达于肾脏血管，且在足细胞的表达最重要，于足细胞接近SD的初级突起表达最强。

传统的Sanger测序法测序通量较低，难以满足测序需求，需要高通量的方法来进行致病基因的检测。新发展起来的二代测序和生物信息分析技术，较以往的方法更加快捷、通量更高。目标基因捕获联合二代测序技术是近几年发展起来的快速、高通量的测序方法，可以对多个基因同时进行测序，成本也比全外显子测序低。

综上所述，研究TRPC6的致病突变和新突变，对于壮族儿童原发性肾病综合征分子病因学有更好的认识。

【发明内容】

针对现有技术中传统的Sanger测序法测序通量较低，难以满足测序需求，需要高通量的方法来进行致病基因的检测的不足，本发明提供了利用目标基因测序检测TRPC6基因致病突变的方法，具体是通过利用目标基因测序技术检测中国广西壮族儿童原发性肾病综合征TRPC6基因致病突变的方法，该方法快速而有效，可以使我们对壮族儿童原发性肾病综合征分子病因学有更好的认识。

利用目标基因测序检测TRPC6基因致病突变的方法，具体是通过利用目标基因测序技术检测中国广西壮族儿童原发性肾病综合征TRPC6基因致病突变的方法，包括如下步骤：

1)研究对象的选择：选自诊断符合儿童原发性肾病综合征诊断标准，且排除肾小球肾炎、继发性肾病综合征的患儿，空腹抽取患儿外周静脉血2mL(EDTA抗凝)；

2)基因组DNA的提取：将收集肾病综合征患儿静脉血标本，用DNeasy血液和组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，然后使用Invitrogen Qbit分光光度计通过计算260nm处的吸光度与280nm处的吸光度的比率来测试DNA纯度；

3)FastTarget目标区域测序：

针对TRPC6目标区域设计高质量的测序引物，挑选能够以标准人基因组为模板，扩增获得清晰单一条带的引物，按每个panel 20对引物的标准，将优化后的引物混合为多重PCR引物panel，以标准人基因组为模板进行扩增；

基于毛细管电泳的特殊方法，最终获得的优化panel数量为引物数的二十分之一；

利用带有Index序列的引物，通过PCR扩增向文库末端引入和illumina平台兼容的特异性标签序列，反应采用11个循环数的PCR程序，降低PCR的倾向性；

将所有样品Index PCR扩增产物等量混合，并经割胶回收获得最终的FastTarget测序文库，文库的片段长度分布经Agilent 2100Bioanalyzer验证，文库摩尔浓度精确定量后，最终于Illumina Miseq平台，以2×150bp/2×250bp的双端测序模式进行高通量测序，获得FastQ数据；

4)数据筛选和生物学信息分析：

使用BWA(Burrows-Wheeler Aligner)软件，将每个样本的原始数据与参考基因组(UCSC hg19)比对，使用GATK标准程序校正BWA软件得到的初步比对结果，分别采用VarScan软件和GATK HaplotypeCaller方法这两种方式检测每个样品的SNV/InDel，并按照软件推荐的筛选方案进行过滤，对比上述两种检测方案找到的SNV/InDel，合并所有的样品，通过ANNOVAR将所有的SNV/InDel位与数据库进行比对分析，评估这些SNV/InDel位点的变异频率、功能特征、保守性、致病性，快速地找到最有生物学意义的SNV/InDel位点；

5)血清TRPC6水平的测定：采用双抗体夹心ELISA法检测样本中目的蛋白浓度，按试剂盒说明书操作；

6)统计学分析：

寻找与疾病相关的位点，使用关联分析方法，根据已有样本的突变位点的基因型数据以及表型数据，采用SPSS 24.0软件进行统计学分析，plink分析软件进行关联分析、Haploview软件进行连锁不平衡分析；

使用数学工具如逻辑回归、卡方、秩和检验等进行统计分析：

患病组和健康组TRPC6基因型及其等位基因用计数法计算频率，并进行Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验；

逻辑回归以单个位点为单位，按5个假设的遗传模型：Dominant(频率低的allele为显性)，Recessive(频率低的allele为隐性)，Log-additive(叠加作用)，HOM/HET(共显性模型，以纯合正常为参照)进行关联分析；卡方分析同样对每个位点进行分析，并设4个分析模型，Codominant共显性、Dominant显性、Recessive隐性、Allele等位基因。

本发明中：

步骤1)所述的继发性肾病综合征，是指乙肝、系统性红斑狼疮、紫癜、药物引起的继发性肾病综合征。

步骤2)所述的DNeasy血液和组织DNA提取试剂盒，来自德国Qiagen公司。

步骤4)所述的数据库，是指dbSNP数据库、千人基因组、dbSNP数据库、千人基因组、ESP6500、ExAC03、ExAC03_EAS、gnomAD、Hrcr1Kaviar_20150923数据库。

步骤6)所述的基因型数据以及表型数据，是指case/control数据、性别、年龄。

和现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明所述的利用目标基因测序技术检测中国广西壮族儿童原发性肾病综合征TRPC6基因致病突变的方法通过设计TRPC6的13个外显子区域特异性捕获探针，与基因组DNA文库进行杂交，将目标基因组区域的DNA片段进行富集后，再利用illumina Nextseq(美国illumina公司)第二代测序仪进行测序，并与正常壮族儿童进行对比，通过数据分析确定突变位点。

2、本发明所述的利用目标基因测序技术检测中国广西壮族儿童原发性肾病综合征TRPC6基因致病突变的方法，通过建立的FastTarget目标基因捕获技术结合illuminaNextseq第二代测序技术成功的发现了TRPC6的致病突变和新突变，该方法快速而有效，可以使我们对壮族儿童原发性肾病综合征分子病因学有更好的认识。

【附图说明】

图1是本发明实施例中TRPC6基因位点连锁分析(D’值)的图，其中未标记数据的D’。

图2是本发明对比例中TRPC6基因位点连锁分析(r

【具体实施方式】

以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。

实施例：

利用目标基因测序检测TRPC6基因致病突变的方法，具体是通过利用目标基因测序技术检测中国广西壮族儿童原发性肾病综合征TRPC6基因致病突变的方法，包括如下步骤：

1对象和方法

1.1研究对象2015年7月至2017年9月期间右江民族医学院附属医院门诊和病房收集的134例肾病综合征患儿静脉血标本，诊断符合儿童原发性肾病综合征诊断标准[5]，且排除肾小球肾炎、(乙肝、系统性红斑狼疮、紫癜、药物等)继发性肾病综合征等，其中患儿男90例，女44例，年龄2.7-15.8岁，平均(9.3±1.4)岁，107例健康儿童作为对照，为同期体检的健康儿童，男76例，女31例，年龄3.8-14.2岁，平均(8.5±0.7)岁，家族中无肾病综合征及其他肾脏疾病患者。两组研究对象三代均为壮族，相互之间无血缘关系。在年龄及性别组成上两组差异无统计学意义(P＞0.05)。根据知情同意原则，与患儿家长签订知情同意书，并经过右江民族医学院伦理委员会批准。

1.2主要设备和试剂AB 2720热循环仪(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆应用生物系统公司)；艾本德5810R离心机(德国艾本德股份公司)；分光光度计(美国威尔明顿)；Invitrogen量子分光光度计(美国卡尔斯巴德Invitrogen公司)；Illumina NextSeq(美国加利福尼亚州圣地亚哥Illumina公司)；Multiskan FC酶标仪(美国赛默飞世尔科技)；微量移液器(德国艾本德股份公司)；Nextseq试剂盒V2(美国加利福尼亚州圣地亚哥Illumina公司)；凝胶提取试剂盒(中国北京天根生化科技有限公司)；10×反应缓冲液(中国大连宝生物工程有限公司)；HotStarTaq聚合酶(中国大连宝生物工程有限公司)；TRPC6酶联免疫吸附试剂盒(中国酶联生物学)；

1.3基因组DNA的提取空腹抽取患儿外周静脉血2mL(EDTA抗凝)，用DNeasy血液和组织DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)提取基因组DNA。然后使用Invitrogen Qbit分光光度计通过计算260nm处的吸光度与280nm处的吸光度的比率来测试DNA纯度。

1.4 FastTarget目标区域测序针对TRPC6目标区域设计高质量的测序引物，挑选能够以标准人基因组为模板，扩增获得清晰单一条带的引物。按每个panel 20对引物的标准，将优化后的引物混合为多重PCR引物panel，以标准人基因组为模板进行扩增。基于毛细管电泳的特殊方法，最终获得的优化panel数量约为引物数的二十分之一。利用带有Index序列的引物，通过PCR扩增向文库末端引入和illumina平台兼容的特异性标签序列。反应采用11个循环数的PCR程序，尽可能降低PCR的倾向性。将所有样品Index PCR扩增产物等量混合，并经割胶回收获得最终的FastTarget测序文库，文库的片段长度分布经Agilent2100Bioanalyzer验证。文库摩尔浓度精确定量后，最终于Illumina Miseq平台，以2×150bp/2×250bp的双端测序模式进行高通量测序，获得FastQ数据。

1.5数据筛选和生物学信息分析使用BWA(Burrows-Wheeler Aligner)软件，将每个样本的原始数据与参考基因组(UCSC hg19)比对，使用GATK标准程序校正BWA软件得到的初步比对结果，这样经过处理后的比对结果能够更加准确地识别出SNV和InDel，分别采用VarScan软件和GATK HaplotypeCaller方法这两种方式检测每个样品的SNV/InDel，并按照软件推荐的筛选方案进行过滤，对比上述两种检测方案找到的SNV/InDel，合并所有的样品，通过ANNOVAR将所有的SNV/InDel位与dbSNP数据库、千人基因组、dbSNP数据库、千人基因组、ESP6500、ExAC03、ExAC03_EAS、gnomAD、Hrcr1Kaviar_20150923数据库进行比对分析(表2)，评估这些SNV/InDel位点的变异频率、功能特征、保守性、致病性等，快速地找到最有生物学意义的SNV/InDel位点(表1)。

1.6血清TRPC6水平的测定采用双抗体夹心ELISA法检测样本中目的蛋白浓度，按试剂盒说明书操作。

1.7统计学分析为寻找与疾病相关的位点，我们通常使用关联分析方法，根据已有样本的突变位点的基因型数据以及表型数据(如case/control数据、性别、年龄等)，采用SPSS 24.0软件进行统计学分析，plink分析软件进行关联分析、Haploview软件进行连锁不平衡分析。使用数学工具如逻辑回归、卡方、秩和检验等进行统计分析。患病组和健康组TRPC6基因型及其等位基因用计数法计算频率，并进行Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验。逻辑回归以单个位点为单位，按5个假设的遗传模型，Dominant(频率低的allele为显性)，Recessive(频率低的allele为隐性)，Log-additive(叠加作用)，HOM/HET(共显性模型，以纯合正常为参照)进行关联分析。卡方分析同样对每个位点进行分析，并设4个分析模型，Codominant共显性、Dominant显性、Recessive隐性、Allele等位基因。

2结果：

2.1测序深度与覆盖度数据统计134例患病组与107例正常对照组目标区域平均测序深度为216.965-1181.708，86.50-98.20％目标区域>2×覆盖度，82.50-97.10％目标区域>10×覆盖度，78.40-95.30％目标区域>20×覆盖度，76.00-94.70％目标区域>30×覆盖度。

2.2致病突变TRPC6突变分析测序结果发现，在病例组中发现1例2号外显子上的c.172C>T(p.R58W)杂合突变，这些突变在107例健康对照组中未检测出，经数据筛选和生物学信息分析，该突变为致病突变，可导致相关蛋白表达和功能异常，考虑为中国广西壮族儿童致病突变。

表1所有样本TRPC6低频功能突变结果

表2-1所有低频样本在数据库中的概率

表2-2所有低频样本在数据库中的概率

2.3 Hardy-Weinberg平衡检验

通过检验研究的随机样本中基因型频率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，进而判断研究样本是否有群体代表性。比较基因型频率观察值和预期值之间的差异，P>0.05说明符合Hardy-Weinberg平衡定律，有群体代表性。

2.4 SNP关联分析

2.4.1 SNP位点卡方检验

对TRPC6所有SNP位点进行卡方检验分析，分析模型有共显性、显性、隐性、等位基因。rs117895343、rs7931399、rs12805398、rs59743346、rs7105083、rs12362848、rs12366144、rs10501986、rs17096918、rs3802829、rs3824934位点在共显性、显性、隐性、等位基因分析模型的不同基因型中P值均大于0.05，差异在case和control中无统计学意义。

2.4.2 SNP位点逻辑回归分析

对TRPC6所有SNP位点进行逻辑回归分析，使用性别、年龄进行逻辑回归校正。分析模型有Dominant(频率低的allele为显性)，Recessive(频率低的allele为隐形)，Log-additive(叠加作用)，HOM/HET(共显性模型，以纯合正常为参照)进行关联分析。rs117895343、rs7931399、rs12805398、rs59743346、rs7105083、rs12362848、rs12366144、rs10501986、rs17096918、rs3802829、rs3824934位点在Dominant、Recessive、Log-additive、HOM/HET分析模型的不同基因型中P值均大于0.05，差异在case和control中无统计学意义。

2.4.3表型与基因型关联分析

除了基于样本的case/control的逻辑回归关联分析外，样本的表型信息也可用于基因型的关联分析。数据分析中，我们对所有的表型信息(除性别、年龄外)与基因型进行关联分析。同时，使用性别、年龄数据进行校正。对连续型变量我们使用线性回归进行分析；对分类变量，使用逻辑回归进行分析。分析模型有Dominant(频率低的allele为显性)，Recessive(频率低的allele为隐形)，Log-additive(叠加作用)，HOM/HET(共显性)。TRPC6所有SNP位点(rs117895343、rs7931399、rs12805398、rs59743346、rs7105083、rs12362848、rs12366144、rs10501986、rs17096918、rs3802829、rs3824934位点)在Dominant、Recessive、Log-additive、HOM/HET分析模型的不同基因型中P值均大于0.05，表型与基因型差异在case和control中无统计学意义。

2.4.4连锁不平衡分析

本研究对位于TRPC6基因的rs117895343、rs7931399、rs12805398、rs59743346、rs7105083、rs12362848、rs12366144、rs10501986、rs17096918、rs3802829、rs3824934位点使用haploview软件进行连锁不平衡分析(附图1、附图2)。从而获得存在较强关联性的单倍型。发现rs7931399分别与rs12805398、rs59743346位点存在强连锁不平衡(D’分别为0.93、0.94，r

2.4.5环境因子校正的单倍型分析

通过连锁不平衡分析，找出存在较强关联性的Block，对这些Block进行单倍型分析并使用case/control信息进行逻辑回归的关联分析，并使用性别、年龄用于逻辑回归校正。对TRPC6基因rs117895343、rs7931399、rs12805398、rs59743346、rs7105083、rs12362848、rs12366144、rs10501986、rs17096918、rs3802829和rs3824934位点进行单倍型分析可能存在的几种单倍型及其频率见表3。TRPC6-1(rs117895343、rs7931399、rs12805398、rs59743346、rs7105083位点)单倍型在肾病综合征组和健康组中发现均以GACAAGG单倍型为主，分别为91.2％和87.1％，未发现有单倍型分布频率在肾病综合征组和健康组间有统计学差异；TRPC6-2(rs12362848和rs12366144位点)单倍型在肾病综合征组和健康组中发现均以GA单倍型为主，分别为94.4％和94.3％，未发现有单倍型分布频率在两组间有统计学差异。TRPC6-3(rs17096918、rs3802829、rs3824934位点)单倍型在肾病综合征组和健康组中发现均以TGC单倍型为主，分别为48.0％和51.5％，未发现有单倍型分布频率在两组间有统计学差异。

表3基因单倍型关联分析分析结果

注：数据处理中涉及的“case_F”指case样本单倍型的数量与频率，“control_F”指control样本单倍型的数量与频率。

2.5 TRPC6血清水平比较采用非参数秩和检验(Mean-Whitney U)分析，健康组TRPC6血清水平为544.7(264.6,952.6ng/mL，明显高于肾病综合征组241.20(110.75，542.35ng/mL(Z＝4.154，P<0.001)。

3讨论

越来越多研究发现TRPC6基因突变是迟发型常染色体显性家族性FSGS的首要遗传原因，患者通常在成年早期接受医学治疗。Winn等于2005年首先发现TRPC6的P112Q突变可致TRPC6蛋白表达和细胞内钙离子浓度明显升高。近年的研究陆续报道15种TRPC6突变参与FSGS发病。其中，3个突变(G109S、P112Q、N125S)位于ANK1区域，2个突变(M132T、N143S)位于ANK2区域，1个突变(R175Q)位于ANK3区域，1个突变(H218L)位于ANK4区域，另外2个突变(S270T、L395A)位于细胞质N-末端；余下6个突变(L780P、K874X、Q889K、R895C、R895L、E897K)位于细胞质C-末端。其中的10个突变(P112Q、N143S、R895C、E897K、Q889K、M132T、N125S、H218L、R895L、R175Q突变)均可以导致钙通道活性增加。Kuang等研究发现，TRPC6-254C>G基因变异与增强转录和儿童激素抵抗性肾病综合征相关。80个中国血统的家系筛查发现2个独立的家庭均存在Q889K错义突变，TRPC6的突变率为2.5％。也有研究表明，位于TRPC6启动子区的rs3824934(-254C>G)和rs56134796(-218C>T)基因多态性不影响印度激素耐药性肾病综合征患者的易感性。对墨西哥家族性FSGS的9个患病成员研究发现，TRPC6的R895C杂合子突变可使钙离子内流增加，从而导致FSGS。Hofstra等发现，Heymann肾炎大鼠肾小球的TRPC6表达较正常组明显增高，但MN的易感性和疾病预后与TRPC6基因多态性无关，并通过对101例特发性膜性肾病(IMN)患者的TRPC6基因测序发现13个单核苷酸多态性，其中2个突变(rs3802829，pro15ser和rs36111323，ala404val)引起氨基酸的替换，但与正常对照组之间的基因型和等位基因频率差异均不存在统计学意义。Chen等对134名肾炎患者进行肾组织活检，发现TRPC6(rs3824935C/T、rs17096918C/T、和rs4326755A/G)单核苷酸多态性与正常对照组的差异无统计学意义，其中rs17096918C/T、和rs4326755A/G核苷酸多态性只在MN患者中被检出。Kistler等发现TRPC6在MN足细胞损伤初期表达的升高对足细胞有保护作用，但随着TRPC6过表达时间延长可使病情进展。

以上报道提示TRPC6突变与不同民族、不同地区人群的肾病综合征的发生相关。在病例组中发现1例2号外显子上的c.172C>T(p.R58W)杂合突变，这些突变在107例健康对照组中未检测出，经数据筛选和生物学信息分析，该突变为致病突变，可导致相关蛋白表达和功能异常，考虑为中国广西壮族儿童致病突变。对TRPC6基因所有SNP位点(rs117895343、rs7931399、rs12805398、rs59743346、rs7105083、rs12362848、rs12366144、rs10501986、rs17096918、rs3802829和rs3824934)关联分析，TRPC6所有SNP位点多态性在广西壮族儿童肾病综合征组和健康组中未发现统计学差异。分别对TRPC6-1(rs117895343、rs7931399、rs12805398、rs59743346、rs7105083)、TRPC6-2(rs12362848和rs12366144)、TRPC6-3(rs17096918、rs3802829、rs3824934)位点单倍型分析，未发现有增加肾病综合征风险的单倍型。

综上所述，TRPC6基因是儿童肾病综合征的候选基因，该基因突变与中国广西壮族儿童原发性肾病综合征发病有关，与传统的一代测序相比目标基因测序技术通量更高、更快速、更准确，对深入研究疾病分子病因学有重要意义，有助于阐明疾病的发生机制，从而有助于相关药物的开发，达到早期诊断、早期治疗的作用。

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。