一株可在人工培养基上产生子实体的冬虫夏草菌株

摘要

本发明公开了一株可在人工培养基上产生子实体的冬虫夏草菌株。本发明的一株可产子实体的冬虫夏草菌（Ophiocordyceps sinensis）ZDG02,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为：CGMCC No.17076。冬虫夏草菌（Ophiocordyceps sinensis）ZDG02在固体肉汤培养基上培养60天菌落直径可达2.5cm,培养90天以上开始产生气生菌丝，约500天时长出子实体。

说明书

技术领域

本发明涉及一株可在人工培养基上产生子实体的冬虫夏草菌株。

背景技术

冬虫夏草菌是分布于青藏高原及其周边高寒地区的名贵药用菌，现代研究表明冬虫夏草具有多种药理学作用，其应用前景十分可观。冬虫夏草资源短缺，供不应求，市场价格居高不下，对冬虫夏草资源进行人工开发将有助于缓解青藏高原脆弱的生态平衡，满足市场需求，造福人类健康。

在冬虫夏草的人工开发中，优质的冬虫夏草菌种是关键所在也是难点所在，通过组织分离获取冬虫夏草菌的难度不是很大，但是分离到能够经人工培养产生子实体的冬虫夏草菌的概率很低，可产子实体的冬虫夏草菌对冬虫夏草的半人工培育，全人工培育、菌丝体发酵以及冬虫夏草菌有性发育启动的研究都具有重要的意义与价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株经培养可产生人工子实体的冬虫夏草菌。

本发明所提供的可在人工培养基上产生子实体的冬虫夏草菌株是冬虫夏草菌（Ophiocordyceps sinensis），其菌株号为ZDG02，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.17076。该菌种已于2019年02月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称 CGMCC）。

冬虫夏草菌（Ophiocordyceps sinensis）ZDG02在肉汤培养基上培养60天菌落直径可达2.5CM,有深褐色色素分泌至培养基中,90天以上开始有气生菌丝产生,气生菌丝上有分生孢子,试管培养约500天时有子实体产生,子实体特征与天然冬虫夏草一致,该菌株对冬虫夏草子实体半人工培育、虫菌结合全人工培育、冬虫夏草菌发酵菌粉制备，以及揭示冬虫夏草有性发育启动的机制研究都有重要价值。

冬虫夏草菌（Ophiocordyceps sinensis）ZDG02的5.8S核糖体RNA编码基因序列见说明书核苷酸或氨基酸序列表。

保藏说明。

菌种名称：冬虫夏草菌。

拉丁名：Ophiocordyceps sinensis。

菌株编号：ZDG02 。

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

保藏机构简称：CGMCC。

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

保藏日期：2019年02月27日。

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17076。

下面为便于理解，结合具体实施例描述本发明。

附图说明

图1为冬虫夏草菌ZDG02在肉汤培养基上培养60天的照片。

图2为冬虫夏草菌ZDG02在肉汤培养基上培养90天以上有明显气生菌丝时的照片。

图3为冬虫夏草菌ZDG02气生菌丝以及分生孢子的显微照片。

图4为ZDG02菌株在试管培养约500天长出的子实体照片。

图5为依据ZDG02菌株的ITS序列构建的系统发育树。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明均可从商业途径获得。

下述实施例中的培养基。

每1L固体牛奶培养基由如下物质制成：200g土豆、200ml生牛奶、20g葡萄糖、5g水解乳蛋白、1g酵母粉、1g磷酸二氢钾、0.2g七水合硫酸镁、1片复合维生素B、琼脂15g和水。其中用水将培养基定容至1000ml。

每1L固体肉汤培养基由如下物质制成：500ml A液、100ml B液、5g水解乳蛋白、1g酵母粉、0.5g核酸、15g琼脂和水。其中用水将培养基定容至1000ml。（A液B液为课题组自主研发，尚未公开配方）。

上述培养基的PH自然即可。

上述固体牛奶培养基的配制方法如下：将切成见方1cm去皮土豆块煮沸30min,用纱布过滤，在滤液中逐一加入其他固体试剂溶解，将生牛奶煮沸10min用纱布过滤后加入培养基中，用蒸馏水将培养基定容至1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min得到培养基。

上述固体肉汤培养基的配制方法如下：用200ml蒸馏水将固体物质先逐一溶解，加入B液搅匀，再加入A液搅匀，最后用蒸馏水定容至1000毫升，121℃高压蒸汽灭菌20min得到培养基。

下述实施例中用于制备培养基的培养皿直径为75mm、玻璃试管直径为25mm,长为250mm。

实施例1、冬虫夏草菌ZDG02的分离以及纯化。

本发明所涉及的菌株的分离方法为组织分离法，实验材料为甘肃武威天祝藏族自治县代乾牧场所产的新鲜冬虫夏草的子实体部分。其主要步骤为：1、将完好无损的新鲜冬虫夏草用蒸馏水冲洗去除表面泥土并用无菌滤纸吸干表面水分。2、将冬虫夏草放入75%酒精中消毒30秒，然后用无菌水冲洗三次。3将冬虫夏草放入0.1%升汞溶液中表面消毒处理2分钟，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干表面水分。4、用无菌手术刀将子实体部分切成2mm小块接种于牛奶培养基中18摄氏度黑暗避光培养。5、待培养基上长出肉眼可见菌落时，挑取边缘菌丝接入新的固体牛奶培养基中进行纯化，按照此种方式连续纯化三次。

实施例2、冬虫夏草菌ZDG02的生物学特性。

1、形态学特性：在固体牛奶培养基上菌落整体呈现棕黄色，质地坚韧，初期气生菌丝不发达，有深褐色色素分泌至培养基中，随着培养时间的延长菌落会出现不规则褶皱并整体向上隆起整体呈现蚯蚓粪状（图1），当培养至90天以上时开始有明显气生菌丝（图2），显微镜下观察气生菌丝透明、有膈、有肾形分生孢子，分生孢子无色无隔膜，孢子量不多（图3）。

2、分子生物学特性：用OMEGA试剂盒中第三种方法对冬虫夏草菌ZDG02的总DNA进行提取，以ITS4/ITS5通用引物扩增核糖体内转录间隔区（ITS）序列并测序，测序结果如表所示，提交至NCBI进行序列比对，与已有冬虫夏草菌序列信息相似度都在99%以上，选取其中几个序列构建系统发育树分析如图5所示，ITS鉴定结果显示ZDG02菌株为冬虫夏草菌（Ophiocordyceps sinensis）。

3、冬虫夏草菌ZDG02在固体牛奶培养基上18℃生长特性：18℃下，冬虫夏草菌ZDG02在固体牛奶培养基平板上培养60天菌落直径可达2.5cm,前60天的平均生长速度为0.41mm/d，90天时菌落直径为4.2cm,前90天的平均生长速度为0.45mm/d。

实施例3、冬虫夏草菌ZDG02深度培养产子实体研究。

1、将纯化后的冬虫夏草菌ZDG02接种到有肉汤培养基的斜面试管中，用硅胶塞塞紧试管18℃避光培养120天。

2、步骤1结束后，转至15℃培养箱培养100天。

3、步骤2结束后，转至12℃培养箱培养100天。

4、步骤3结束后，转至4℃培养。

总培养时间接近500天时，冬虫夏草菌ZDG02在肉汤培养基上长出与天然虫草一致的子实体，如图4所示。

序列表

<110> 兰州交通大学

<120> 一株可在人工培养基上产生子实体的冬虫夏草菌株

<130> 2020.5.20

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 581

<212> DNA

<213> 冬虫夏草菌(Ophiocordyceps sinensis)

<400> 1

taacaaggtc tccgttggtg aaccagcgga gggatcatta ccgagtcacc actcccaaac 60

cccctgcgaa caccacagca gttgcctcgg cgggaccgcc ccggcgcccc agggcccgga 120

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