生物强化细胞营养素在制备预防自闭症功能食品中的应用

摘要

本发明公开了生物强化细胞营养素在制备预防自闭症功能食品中的应用，实验证明，强化细胞营养素可有效抑制VPA诱导的大鼠自闭症发生，并通过降低肠内炎性因子TNF‑α表达量，降低结肠内炎症水平，并有效抑制肠道CLDN8、CLDN15、TJP1表达失调，改善自闭症大鼠肠道通透性，维持肠屏障正常功能。

说明书

技术领域

本发明属于功能食品领域，特别是涉及生物强化细胞营养素在制备预防自闭症功能食品中的应用。

背景技术

人类的身体由上万亿个细胞组成,这些细胞是人体结构的基本功能单位，细胞的健康是在核酸的调控下，依靠蛋白质、多种氨基酸、多肽、多糖、多种微量元素、矿物质等带有生物活性的物质以维持细胞的正常代谢。细胞有特定的职责，协同工作，保持着我们的身体健康。身体内的每个组织由细胞构成，而相关细胞组织集群便构成了人体的器官。虽然这些器官由功能不同的细胞构成，但是，它们需要同样的基本营养成分，这便是支撑细胞代谢的基础物质。细胞是有寿命的，理论上说，如果为细胞提供合适的、足够的基本营养成分，淘汰凋亡的细胞，精确复制已经存在的健康的细胞，提高人体对于疾病的自愈能力，我们人类可延缓衰老，保持健康。

人体对于疾病的自愈能力，即是人类依靠自身的内在生命力，依靠免疫系统、神经系统和内分泌系统为主的修复机制，修复受损的细胞、摆脱疾病与亚健康状态的一种保持身体健康的能力。当人体的自愈力下降时，是因为某些人体器官组织系统缺少足够的营养因子，细胞不能正常地代谢，不能完全正确地复制健康细胞和液化凋亡的细胞。由于细胞的不正确的复制，使得细胞的正常功能打了折扣，身体的自我修复能力减低，这直接影响了人体对于疾病的抵抗能力，一旦遭遇外界不良因素，人体就会生病。

自闭症(Autism)又称孤独症，是一种具有生物基础的发育障碍类疾病，包括一系列复杂的神经发育障碍。最新版的美国精神疾病诊断及统计手册第五版(Diagnostic andStatistical Manual of Mental Disorders-V,DSM-V)已将自闭症的核心症状归结为社交障碍，沟通困难和有限的、重复和刻板的行为。自闭症由环境因素，生物和遗传因素等共同作用引起，成因复杂，自闭症儿童大脑早期发育异常可能是自闭症发病的直接诱因。神经毒性物质、营养物质、代谢产物和神经活性物质等都可能是自闭症的病因。一些自闭症患者存在染色体异常和基因变异，同时，更多的病例在胃肠道症状等其他方面也表现异常。目前的治疗措施主要包括行为干预和药物干预。然而,到目前为止，人们对自闭症的致病机制尚未完全阐明,也还没有切实有效的针对核心症状的治疗方法，只是通过处方药物来尝试改善生活。例如，抗精神病药物被用于预防攻击行为和自我伤害行为，这些行为是与自闭症谱系障碍相关的行为障碍。然而，它是对症治疗，并不旨在永久性治愈。因此，开发有效预防自闭症发生的功能性食品是科研工作者的重要任务。目前尚未发现报道能有效预防自闭症发生的功能性食品，与治疗药物相比，功能性食品能够提高患者的顺应性，降低使用痛苦。

研究表明，有超过90％的自闭症儿童存在饮食问题，且多伴随胃肠道异常症状，表现为肠道通透性改变，肠道屏障功能障碍。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种生物强化细胞营养素在制备预防自闭症功能食品中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

生物强化细胞营养素在制备预防自闭症功能食品中的应用，所述生物强化细胞营养素是用下述方法制成：

(一)母液的制备：

(1)选取谷类为原料，清洗分离杂质后，置于纸浆蒸煮机中加入原料总重量30％～50％的水，启动纸浆蒸煮机，旋转浸泡30～60分钟；

(2)停止旋转，将水放净，打开冷气机，通入冷气，旋转保持-4℃以下60～90分钟，停止旋转；

(3)关闭冷气机，打开空压机，通入室温空气，旋转，升温至室温；

(4)关闭空压机，停止旋转，通入蒸汽，旋转，保持100℃，30～60分钟，关闭蒸汽；

(5)停止旋转，打开空压机，通入室温空气，旋转，降至30℃～50℃；

(6)停止旋转，加入原料总重量1％～3％的营养配料粉，旋转30～60分钟；所述营养配料为重量比为1:2:3:1的灵芝、枸杞、蓝莓果和肉桂；

(7)停止旋转，加入原料总重量0.2％～0.4％的复合酶，旋转1～2小时；

(8)加入原料总重量0.2％～1％食用菌种，旋转使均匀；停止旋转，分装至发酵桶，在28～35℃发酵8～15天，即得母液备用；

(二)胶料的制备：

(1)另取谷类为第二原料，用18～30℃水浸泡8～16小时；沥水，置于容器内；

(2)向容器内加入第二原料重量1～2倍的水，煮1～3小时；

(3)过滤，去除水，获得胶料备用；

(三)成品的制备：

(1)将母液与胶料按重量比为1：1～2的比例，混合，分离除渣，得混合液；

(2)加入混合液重量1％～2％的低聚异麦芽糖，混合液重量0.2％～0.7％的黄原胶，混合液重量0～1％的阿胶，均质；灌装灭菌，得生物强化细胞营养素；

所述复合酶是质量比为3:3:1:1的糖化酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶；

所述食用菌种为面包酵母，甜酒曲酵母、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌至少两种。

原料为黑糯米、黄糯米、白糯米、紫米、黍米、粟米、香米、高粱米、大米和薏米中的至少五种。

第二原料为黑糯米、黄糯米和白糯米至少一种。

本发明优点

实验证明，强化细胞营养素可有效抑制VPA诱导的大鼠自闭症发生，并通过降低肠内炎性因子TNF-α表达量，降低结肠内炎症水平，并有效抑制肠道CLDN8、CLDN15、TJP1表达失调，改善自闭症大鼠肠道通透性，维持肠屏障正常功能。

附图说明

图1为子代空白组(C)、子代VPA诱导的自闭症模型组(V)、子代生物强化细胞营养素干预组(P)大鼠发育学观测结果。

图2为子代大鼠MORRIS水迷宫实验检测结果。

图3为子代大鼠三厢社交测试实验检测结果。

图4为子代大鼠新物体识别实验检测结果。

图5为子代大鼠肠道通透性检测结果。

图6为子代大鼠结肠、小肠紧密连接家族基因及炎性因子TNF-α基因检测结果。

具体实施方式

本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好的理解本发明，但并不对本发明作任何限制。

本发明所采用的各个食用酵母菌均购自安琪酵母股份有限公司(但并不对本发明作任何限制，其它公司生产的功能相同的食用酵母菌也可以用于本发明)；各个乳杆菌购自丹麦汉森公司(但并不对本发明作任何限制，其它公司生产的功能相同的乳杆菌也可以用于本发明)。下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

生物强化细胞营养素用下述方法制成：

(一)母液的制备：

(1)选取重量比例为1:1:1:2:2的黑糯米、黄糯米、紫米、黍米和大米五种谷物为原料，清洗分离杂质后，置于纸浆蒸煮机中加入原料总重量30％的水，启动纸浆蒸煮机，旋转浸泡30分钟；浸泡的目的是使原料充分吸收水份；

(2)停止旋转，将水放净，打开冷气机，通入冷气，旋转保持-4℃以下60分钟，停止旋转；放冷的目的是使吸水后的原料膨胀；

(3)关闭冷气机，打开空压机，通入室温空气，旋转，升温至室温；提前预热的目的是为了下一步通蒸汽之前的温度升高而节省能源；

(4)关闭空压机，停止旋转，通入蒸汽，旋转，保持100℃，60分钟，关闭蒸汽；其目的是熟化并消毒；

(5)停止旋转，打开空压机，通入室温空气，旋转，降至30℃；其目的为后续加入营养配料、复合酶及菌种提供合适的温度；

(6)停止旋转，加入原料总重量2％的营养配料粉，旋转30分钟；所述营养配料为重量比为1:2:3:1的灵芝、枸杞、蓝莓果和肉桂；

(7)停止旋转，加入原料总重量0.2％的复合酶，旋转1小时；复合酶是质量比为3:3:1:1的糖化酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶；

(8)加入原料总重量0.2％食用菌种，旋转使均匀；停止旋转，分装至发酵桶，在28℃发酵15天，即得母液备用；食用菌种为重量比为3:1的面包酵母菌和保加利亚乳杆菌；

(二)胶料的制备：

(1)另取重量比为1:1的黄糯米和白糯米为第二原料，用18℃水浸泡16小时；沥水，将沥水后的米置于容器内；

(2)向容器内加入第二原料重量1倍的水，煮1小时；

(3)过滤，去除水，获得胶料备用；

(三)成品的制备：

(1)将母液与胶料按重量比为1：1的比例，混合，分离除渣，得混合液；

(2)加入混合液重量1％的低聚异麦芽糖，混合液重量0.2％的黄原胶，均质；灌装灭菌，得生物强化细胞营养素。

本实施例中的旋转转速均为15转/分钟。

实施例2

生物强化细胞营养素用下述方法制成：

(一)母液的制备：

(1)选取重量比为1:1:2:1:1:2:1的黑糯米、紫米、黍米、白糯米、粟米、高粱米和大米七种谷物为原料，清洗分离杂质后，置于纸浆蒸煮机中加入原料总重量40％的水，启动纸浆蒸煮机，旋转浸泡40分钟；

(2)停止旋转，将水放净，打开冷气机，通入冷气，旋转保持-4℃以下80分钟，停止旋转；

(3)关闭冷气机，打开空压机，通入室温空气，旋转，升温至室温；

(4)关闭空压机，停止旋转，通入蒸汽，旋转，保持100℃，50分钟，关闭蒸汽；

(5)停止旋转，打开空压机，通入室温空气，旋转，降至40℃；

(6)停止旋转，加入原料总重量1％的营养配料粉，旋转60分钟；所述营养配料为重量比为1:2:3:1的灵芝、枸杞、蓝莓果和肉桂；

(7)停止旋转，加入原料总重量0.3％的复合酶，旋转1.5小时，复合酶是质量比为3:3:1:1的糖化酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶；

(8)加入原料总重量0.5％食用菌种，旋转使均匀；停止旋转，分装至发酵桶，在32℃发酵12天，即得母液备用；食用菌种为重量比为2:1:1的面包酵母、甜酒曲酵母和植物乳杆菌；(二)胶料的制备：

(1)另取重量比为1：1的黄糯米和白糯米为第二原料，用30℃水浸泡8小时；沥水，置于容器内；

(2)向容器内加入第二原料重量1.5倍的水，煮2小时；

(3)过滤，去除水，获得胶料备用；

(三)成品的制备：

(1)将母液与胶料按重量比为1：1.5的比例，混合，分离除渣，得混合液；

(2)加入混合液重量2％的低聚异麦芽糖，混合液重量0.4％的黄原胶，混合液重量0.1％的阿胶，均质；灌装灭菌，得生物强化细胞营养素。

本实施例中的旋转转速均为20转/分钟。

实施例3

生物强化细胞营养素用下述方法制成：

(一)母液的制备：

(1)选取重量比为1:1:1:2:1:0.5:1:1:0.5的黑糯米、白糯米、紫米、黍米、粟米、香米、高粱米、大米和薏米九种谷物为原料，清洗分离杂质后，置于纸浆蒸煮机中加入原料总重量50％的水，启动纸浆蒸煮机，旋转浸泡60分钟；

(2)停止旋转，将水放净，打开冷气机，通入冷气，旋转保持-4℃以下90分钟，停止旋转；

(3)关闭冷气机，打开空压机，通入室温空气，旋转，升温至室温；

(4)关闭空压机，停止旋转，通入蒸汽，旋转，保持100℃，30分钟，关闭蒸汽；

(5)停止旋转，打开空压机，通入室温空气，旋转，降至50℃；

(6)停止旋转，加入原料总重量3％的营养配料粉，旋转30分钟；营养配料为重量比为1:2:3:1的灵芝、枸杞、蓝莓果和肉桂；

(7)停止旋转，加入原料总重量0.4％的复合酶，旋转2小时，复合酶是质量比为3:3:1:1的糖化酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶；

(8)加入原料总重量1％食用菌种，旋转使均匀；停止旋转，分装至发酵桶，在35℃发酵8天，即得母液备用；食用菌种为重量比为2:1:1的面包酵母、甜酒曲酵母和嗜酸乳杆菌；

(二)胶料的制备：

(1)另取黑糯米为第二原料，用25℃水浸泡10小时；沥水，置于容器内；

(2)向容器内加入第二原料重量2倍的水，煮3小时；

(3)过滤，去除水，获得胶料备用；

(三)成品的制备：

(1)将母液与胶料按重量比为1：2的比例，混合，分离除渣，得混合液；

(2)加入混合液重量2％的低聚异麦芽糖，混合液重量0.7％的黄原胶，混合液重量1％的阿胶，均质；灌装灭菌，得生物强化细胞营养素。

各实施例中的转速为15-20转/分钟，其目的是例物料混匀，但对转速并不限制，达到混匀目的的其它转速也可以使用。

在实施例1－3的基础上再加以微波、气流干燥、喷雾等烘干技术，可将本发明制成粉体状食品，减轻了液体灌装的重量，方便外出携带，食用时即冲即食；

在实施例1－3的基础上再在上述成品工序中将黄原胶的加入比例提高，加入天然果胶，也可制成类似果冻状食品，或添加到巧克力、麦乳精、饼干、面包等食品中食用；也可精制成口服液服用。又可制成固体羹状食品，此外，本发明还可制成饼干、糖果、点心等食品，方便各类群体食用。

实施例4

生物强化细胞营养素改善VPA诱导的自闭症子代Wistar大鼠模型构建(实验由吉林大学基础医学院病原生物学教研室完成)

实验材料：成年SPF级Wistar大鼠，雌性体重250±20g，雄性体重280±20g，采购于长春亿斯实验动物技术有限责任公司，饲养于吉林大学基础医学院实验动物中心。光照条件为昼夜循环光照(12h/12h)，环境温度为25±1℃，相对湿度为50±5％。饲养期间大鼠摄食及饮水自由，环境安静卫生。实验中所涉及的动物的使用和实验方案均符合国际实验动物评估和评审委员会的动物使用标准。

实验试剂：丙戊酸钠(VPA)：造模用药，冻干粉，10g/瓶，批号：P4543，德国Sigma-Aldrich公司生产；生理盐水(上海源叶生物科技有限公司)；体重秤；计时器。

实验方法：将育龄雌性Wistar大鼠单独喂养一周后，与雄性Wistar大鼠合笼过夜，通过阴道涂片法检测雌性大鼠受孕情况。将孕鼠分为三组，

亲代空白组(FC)、

亲代VPA诱导的自闭症模型组(FV)，

亲代生物强化细胞营养素干预组(FP)。

FP组自受孕日开始按12.2775ml/kg剂量连续20天进行生物强化细胞营养素(实施例1制备)灌胃给药，同时给予FC组和FV组同剂量生理盐水。在大鼠受孕12.5天时，FV组和FP组通过腹腔注射剂量为400mg/kg的VPA，同时FC组腹腔注射等量的生理盐水。

FC组孕鼠所产子代为子代空白组(C组)，FV组所产子代鼠为子代VPA诱导的自闭症模型组(V组)，FP组所产子代鼠为子代生物强化细胞营养素干预组(P组)。雌性大鼠产下子代鼠当天记为分娩第0天(P0)。从体重、睁眼指标，以及方向趋向性实验三个指标评价模型制备成功。体重：P7-P21每隔2天检测体重情况并记录。睁眼指标：P12-P16进行观察。观察计算各组睁眼得分情况：两眼均未睁记为0分；一睁一闭记为1分；两眼均睁记为2分。方向趋向性实验：P14-P17进行检测。光滑斜板的斜角度为45°将幼鼠头部放在下倾的光滑斜板上，记录转身180°所用的时间。选取符合发育学特征的子代雄性大鼠饲育至P21准备下一步实验。

结果见图1。

结果表明：子代生物强化细胞营养素干预组P组在体重(见图1-a)、睁眼指标(见图1-b)、趋向性测试(图1-c)三项指标相对于V组更趋近于C组，说明在发育学上，生物强化细胞营养素干预作用对VPA诱导的大鼠自闭症发生具有抑制作用。

图1为子代空白组(C)、子代VPA诱导的自闭症模型组(V)、子代生物强化细胞营养素干预组(P)子代大鼠发育学观测结果。

实施例5

生物强化细胞营养素改善VPA诱导的自闭症子代Wistar大鼠行为学表型(实验由吉林大学基础医学院病原生物学教研室完成)

实验材料：子代雄鼠每组20只(实施例4制备)；MORRIS水迷宫视频分析系统(安徽正华生物仪器设备有限公司)；用于新物体识别实验、三厢社交测试实验设备均为按标准尺寸制作的玻璃树脂材质隔离箱；

实验方法：

MORRIS水迷宫实验：

P21进行检测。MORRIS水迷宫实验程序包括:

(l)定位划行实验(学习):当幼鼠长到P33时，分别取各组幼鼠,在水迷宫中对每只鼠进行训练,训练时间和次数保持相同。训练时随机选择一个象限开始,按逆时针方向,将鼠从各象限边缘中点位置面向池壁放入水中。然后观察并记录各只鼠在一定时间内(定为90s)找到平台时间(逃避潜伏期)。如果鼠在90s内未能找到平台,则人为引导至平台停留10s后移开。空间探索实验:用于测量鼠学会寻找平台后,对平台空间位置记忆的能力。在上述试验后,即在鼠能熟练找到平台后撤除平台,然后任选一个入水点将大鼠面向池壁放入水中,由摄像系统及电脑路径软件自动记录鼠90S内动物穿越目标平台即原平台位置的次数、原平台区域及其边界外围1cm区域活动时间、原平台区域及其边界外围1cm区域活动路程和平均游泳速度。

(2)三厢社交测试实验：

P21进行检测。第一阶段：a)实验开始前，将大鼠放在行为测试室适应半个小时；b)用透明的玻璃树脂板将三个箱子隔开，并将测试大鼠(Subject mice)放进中间的箱子里适应5分钟；c)将Stranger 1随机放进左侧或右侧箱子里的金属笼子里，另外一侧箱子的金属笼子空着；d)去掉隔开箱子的玻璃树脂板，使测试大鼠可以在三个箱子中自由活动十分钟；e)马上开始拍摄并记录下相关参数：第二阶段：在苐一阶段实验中空着的金属笼子中放入第二只陌生同种大鼠(Stranger 2)，然后记录十分钟，观察Subject mice与Stranger 1和Stranger 2之间相互接触的时间。

(3)新物体识别实验：

P21进行检测。在一个熟悉的环境里测试鼠类动物对新物体的认知能力是一种非常普遍的评估试验对象记忆能力的方法。在新物体认知能力试验中，测量和比较动物对新物体和熟悉物体在兴趣程度上的差别。阶段1适应期：分别让每只动物在空的试验箱内自由活动3min，以适应试验箱内的环境。阶段2学习期：先将两个完全相同的物体放入试验箱中设置好的位置，随后分别将动物从试验箱内的某个固定角落放入试验箱中。每只动物分别给予5min的探索时间，记录动物探索两个物体的时间，分别记录为Ta1和Tb1。判断动物探索物体的标准为：动物面向物体，鼻子触碰或者贴近物体距离小于1cm。任何非正面身体与物体接触，或者越过、爬上物体眺望均不计入动物探查物体时间。阶段3测试期：将其中一个替换为新物体(Novel object)，物体的放置位置保持不变。将动物从另一侧放入试验箱内。每只动物分别给予5min的探索时间，记录动物探查两个物体的时间，分别记录为Ta2和Tc1。评价指标为偏好指数＝Tc1/(Ta2+Tc1)。

结果见图2、图3、图4。

结果表明：在实验中，通过从空间记忆能力(MORRIS水迷宫)、探索趋新能力(新物体识别)，社交能力(三厢社交测试)对子代大鼠表型进行评价。图2-a、2-b、2-c分别展示C组、V组、P组在MORRIS水迷宫实验中的运动轨迹，统计结果表明P组的运动能力(运动总路程、游泳速度)、空间记忆能力(穿越平台次数、平台区域逗留时间)高于V组趋近C组(见图2-d、2-e、2-f、2-g)；图3-c、3-d、3-e分别展示C组、V组、P组在三厢社交实验中的运动轨迹，V组有避免接触新个体的倾向(见图3-a、3-b)，但在P组中这一倾向有明显改善；图4-d、4-e、4-f分别展示C组、V组、P组在新物体识别实验中的运动轨迹，V组的偏好指数显著低于C组，P组高于C组(见图4-a,4-b,4-c)，说明生物强化细胞营养素干预能提高大鼠探索趋新水平。从行为学实验结果可知，生物强化细胞营养素能有效预防子代自闭症样行为学表型表达。

实施例6

生物强化细胞营养素改善VPA诱导的自闭症子代Wistar大鼠肠屏障功能(实验由吉林大学基础医学院病原生物学教研室完成)

实验材料：子代雄鼠每组6只(实施例4制备,P21)；FITC-dextran(40000kD，SIGMA)；biotek synergy H1全功能酶标仪

实验方法：

以0.6mg/g的标准剂量对子代大鼠进行FITC-dextran灌胃，4小时后，通过腹主动脉取外周血，用Biotek synergy H1全功能酶标仪在490nm波长检测血清中FITC含量。

结果见图5。

结果表明：V组大鼠检测到的FITC荧光值高于C组和P组(见图5)，表明V组中有大量的FITC通过肠壁进入血液，通透性增强，与自闭症患者肠道屏障功能障碍表型一致。同时，P组FITC荧光强度趋近于C组，说明生物强化细胞营养素干预能有效改善VPA诱导大鼠子代肠屏障功能障碍。

实施例7

生物强化细胞营养素改善VPA诱导的自闭症子代Wistar大鼠结肠、小肠紧密连接蛋白、炎症因子相关基因表达水平(实验由吉林大学基础医学院病原生物学教研室完成)

实验材料：子代雄鼠每组10只(实施例4制备，P21)；总RNA纯化试剂盒(GeneMark，TR01/TR01-150)；逆转录试剂盒(novoprotein，

实验方法：

总RNA提取：

总RNA提取使用GeneMark总RNA纯化试剂盒，具体实施方案如下：

(1)P21取子代大鼠结肠、小肠组织各25mg，加入600ul RNA Lysis/2-MESolution，使用研磨器冰浴匀浆；

(2)将700ul匀浆混合液移取至2ml ollection Tube的RNA Spin Column中，以最高离心转速(12,000～14,000x g)离心1分钟，丢弃滤液。

(3)将RNA Spin Column放回原來的Collection Tube中，加入500μl RNA WashSolution I，以最高离心转速离心1分钟，丢弃滤液。

(4)将80μl DNase Incubation Buffer与2μl DNase I预先混合在新的无菌离心管。将82μl DNase I Solution加入至RNA Spin Column的膜中心，于室温(25～28℃)孵育15分钟。

(5)加入500μl RNA Wash Solution I至RNA Spin Column中，以最高离心转速离心1分钟，丢弃滤液。

(6)将RNA Spin Column放回原來的Collection Tube中，加入600μl RNA WashSolution II，以最高离心转速离心1分钟，丢弃滤液。重复一次此步骤。

(7)将RNA Spin Column放回Collection Tube中，以最高离心转速离心3分鐘，以去除残留的ethanol。

(8)将RNA Spin Column移至干净的1.5ml离心管，加入30～50μl Nuclease-freewater至RNA Spin Column的膜中心，静置1分钟，于最高离心转速1分钟以回收RNA，可将RNA样本保存于-70℃。

RNA逆转录：

RNA逆转录使用逆转录试剂盒(novoprotein，

(1)去基因组DNA反应：模板RNA 0.1ng-1ug、gDNA Purge 1ul、RNase Free Water加至10ul。42℃孵育5min。

(2)逆转录反应：(1)反应液10ul、2*NovoScript Plus 1st Strand cDNASynthesis SuperMix10ul。轻轻混匀，离心。50℃孵育15min。

(3)75℃孵育5min，终止反应。

实时荧光定量PCR：

(1)反应体系：2*NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus 10ul、上下游引物各0.2uM、模板1ul、ROX0.4ul、RNase Free Water加至20ul。

(2)按(1)体系加完样本，置于7300Plus实时荧光PCR仪内按以下条件循环：1)95℃1min；2)循环35次：95℃，20s、60℃，60s。

结果见图6。

结果表明：

V组结肠组织紧密连接蛋白CLDN8表达量显著下调、CLDN15表达量显著上调，且在P组中CLDN15恢复至C组水平；V组肿瘤坏死因子TNF-α表达量显著上调，同时，P组TNF-α表达量降低(见图6-a)。

小肠样本检测结果在CLDN8、CLDN15以及TNF-α上与结肠结果一致，此外在小肠中相对于C组，V组TJP1表达量显著下调，在P组中TJP1表达量显著上调(见图6-b)。

CLDN8、CLDN15、TJP1都是紧密连接家族的一员，一般认为在肠道内其表达量的异常，易导致肠壁屏障功能障碍。

实验结果表明，生物强化细胞营养素能有效抑制肠道CLDN8、CLDN15、TJP1表达失调，维持肠屏障正常功能。TNF-α是肿瘤坏死因子，它可以促进T细胞产生各种炎症因子，进而促进炎症反应的发生。说明结肠内生物强化细胞营养素能有效抑制TNF-α表达量，降低结肠内炎症水平。此外也有研究表明，TNF-α以及其他炎性细胞因子(IL-β、IFN-γ)参与调节CLDNs的表达。TNF-α与紧密连接家族基因表达情况关联，表明在ASD大鼠肠道内发生肠壁屏障功能障碍，并伴随炎性反应，而生物强化细胞营养素干预能在一定程度上减弱炎性反应程度，维护肠壁正常屏障功能。