一种猪群体内腺病毒3型中和抗体阳性率的ELISA试剂盒及其检测方法

摘要

本发明创造提供了一种猪群体内腺病毒3型中和抗体阳性率的ELISA试剂盒及其检测方法，试剂盒中的包被抗原为重组蛋白SUMO3‑Hexon‑HVR1‑6。本发明创造所述的ELISA检测方法对临床常见的几种猪病毒阳性血清进行检测，并无交叉反应；当血清样品稀释到1:320时仍能检测出阳性血清；批内重复的变异系数为1.0％～3.9％之间，批间重复变异系数在0.5％～8.3％之间；本间接ELISA检测方法与PCR核酸检测的阳性符合率为88％。

说明书

技术领域

本发明创造属于生物检测技术领域，尤其是涉及猪群体内腺病毒 3型中和抗体阳性率的ELISA试剂盒及其检测方法。

背景技术

猪腺病毒3型(porcine adenovirus serotype 3,PADV-3)属于腺病毒科，哺乳动物腺病毒属。动物感染腺病毒之后会出现水样腹泻症状，有可能会出现呼吸道症状或者神经症状，但是症状比较轻微[1]。而且经常与其他可以引起猪群腹泻的病毒混合感染[2-4]。所以在猪群中出现腹泻病猪时，大家往往会把病因归结于这些常见的引起猪腹泻的病毒上，从而忽视了PADV-3在其中扮演的重要角色。腺病毒有非常严格的宿主选择性，猪是猪腺病毒的唯一宿主，不感染其他动物[5]。

PADV-3是一个无囊膜的DNA双链病毒，。病毒外形是一个十二面体，病毒衣壳主要由252个蛋白衣壳粒子，其中有240个六邻体 (Hexon)，12个五邻体蛋白(penton)[6-7]。腺病毒的中和抗体IgG 主要是识别腺病毒的衣壳蛋白[8]，腺病毒的主要中和表位都集中在Hexon的高变区(hypervariable region,HVR),其次是penton蛋白和 fiber蛋白[9-10]。每个Hexon都是有三个Hexon分子形成的聚合体分子，这个三聚体由一个五面体的基底和三角形的塔尖构成，基底部分是P1和P2两个结构域。顶部塔区部分由四个环组成，Loop

目前已有学者尝试将Hexon基因全长在原核系统中进行了表达 [14]，但是可能与培养的条件或者基因中包含大量的稀有密码子有关系，导致表达的蛋白都是以包涵体的形式存在。另外，现在关于 PADV-3的检测方法主要有普通的PCR和荧光定量PCR方法，血清学方面的相关研究比较少[15]。

发明内容

为了方便有效的检测猪群中PADV-3的中和抗体的阳性率，本发明通过将原核表达的重组Hexon蛋白作为包被抗原建立了间接 ELISA检测方法，并对该方法的敏感性和特异性进行了评价。提供了一种使用有效的检测猪群PADV-3中和抗体阳性率的方法，PADV-3 作为一种优良的疫苗载体被广泛应用[16]，但是动物体内预存的中和抗体却会对此载体疫苗的效果造成较大的影响，所以了解猪群体内 PADV-3中和抗体的阳性率可以为PADV-3载体疫苗的开发提供材料。

有鉴于此，本发明创造旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种猪群体内腺病毒3型中和抗体阳性率的ELISA试剂盒及其检测方法。

为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：

一种猪群体内腺病毒3型中和抗体阳性率的ELISA检测方法，包括如下步骤：

a、包被抗原：将SUMO3-Hexon-HVR

b、洗涤：弃去包被液并用PBST洗涤3次，每次摇床震荡30s；晾干后加入200μL封闭液封闭，PBST清洗3次，每次摇床震荡30s；

c、孵育一抗：晾干后加入稀释的血清样品100μL/孔，孵育， PBST清洗3次，每次摇床震荡30s；

d、孵育二抗：晾干后加入HRP标记的羊抗猪的二抗100μL/ 孔，孵育，PBST清洗3次，每次摇床震荡30s；e、显色与读值：晾干后按照100μL/孔的量加入TMB显色液，避光显色10min，最后加入浓度为2mol/L的硫酸溶液50μL/孔终止显色；在酶标仪上读取每孔OD450nm的值，根据临界值判定阴阳性；

其中，步骤a中所述SUMO3-Hexon-HVR

优选的，所述步骤a中包被抗原的包被浓度为6μg/mL。

优选的，所述步骤b中的封闭液为2％的BSA溶液，封闭条件为 37℃封闭1h。

优选的，所述步骤c中血清样品的稀释度为1:80，孵育条件分别为37℃孵育1h。

优选的，所述HRP标记的羊抗猪的二抗的稀释度为原液浓度，孵育条件37℃孵育1h。

优选的，所述临界值判定阴阳性的标准为：当OD450nm值大于 0.362时是阳性，小于0.362时是阴性。

本发明还提供上述方法在制备猪群体内腺病毒3型中和抗体阳性率的检测试剂盒中的应用。

相对于现有技术，本发明创造具有以下优势：

(1)本发明首先扩增出了Hexon的高变区基因HVR1-6，并在其 N端分别添加酵母来源的SUMO标签以及猪源的SUMO1、SUMO3标签，来对比不同SUMO标签的促溶效果。挑选促溶效果最好的猪源SUMO3 标签来进行后续的实验，并且大量表达纯化得到重组蛋白 SUMO3-Hexon-HVR1-6。

(2)本发明选取了Hexon的高变区基因来降低Hexon全长基表达时出现的问题，实现Hexon基因的可溶性表达；而且高变区基因包含猪腺病毒型特异性区域，所以选取此区域作为包被抗原可以最大限度的降低腺病毒不同血清型对PADV-3中和抗体阳性率的影响。

(3)利用本发明的ELISA检测方法对临床常见的几种猪病毒阳性血清进行检测，并无交叉反应；当血清样品稀释到1:320时仍能检测出阳性血清；批内重复的变异系数为1.0％～3.9％之间，批间重复变异系数在0.5％～8.3％之间；本间接ELISA检测方法与PCR核酸检测的阳性符合率为88％。

(4)利用本发明建立的间接ELISA检测方法对不同猪场采集的 241份血清样品进行检测，检测出阳性血清48份，阳性率为19.9％。

(5)本发明建立的间接ELISA检测方法方便、快捷、灵敏、有效，可用于PADV-3的检测以及流行病学的调查。

附图说明

图1为重组质粒的PCR验证图；图中的5泳道为质粒28a-HVR1-6 的PCR结果，6、7、8泳道分别为28a-S1-HVR

图2为重组质粒的双酶切鉴定；从左到右依次是重组质粒 28a-HVR

图3为细菌破碎后的SDS-PAGE检测图；图3-A中的泳道7、8 为不带标签的28a-HVR

图4为融合蛋白S3-HVR

图5为融合蛋白S3-HVR

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例来详细说明本发明创造。

实施例 猪腺病毒3型的Hexon高变区基因的可溶性表达以及中和抗体间接ELISA方法的建立

1.1引物设计

根据pET28a、pET28a、pET28a-pigSUMO1、pET28a-pigSUMO3、 yeastSUMO和Hexon-HVR的基因序列，利用Snapgene和CE Design 软件设计出特异性引物扩增出目的片与酶切载体构建 pET28a-HVR

表1构建载体所用引物

1.2构建表达载体

1.2.1扩增目的基因

用表1中的F1和R1引物扩增的HVR

表2 PCR反应体系

PCR反应条件如下：

PCR扩增结束后用将PCR产物加入1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像仪照出目的条带，用天根的凝胶回收试剂盒进行切胶回收，最后利用核酸蛋白分析仪NanoDrop2000测定回收的核酸浓度，-20℃保存备用。

1.2.2载体的双酶切

使用QuickCut HindIII和Xhol对pET28a载体进行双酶切，37℃条件下反应30min；使用QuickCut BamHI分别对pET28a-SUMO1、 pET28a-SUMO3、pET28a-yeastSUMO进行30℃酶切15min，直接在反应体系中加入HindIII在37℃条件下继续酶切15min，反应结束后少量酶切产物进行凝胶核酸电泳检验，验证无误后进行切胶回收。 HindIII和Xhol双酶切反应体系如表3：

表3 HindIII和Xhol双酶切反应体系

轻轻混匀后瞬时离心，37℃酶切30min。

BamHI和HindIII双酶切反应体系如表4：

表4 BamHI和HindIII双酶切反应体系

轻轻摇匀后瞬时离心，首先在30℃酶切15min，之后再加入1μL 的QuickCutHindIII在37℃继续酶切15min。琼脂糖凝胶电泳结束后，胶回收操作步骤参考说明书。

1.2.3构建重组质粒

参考诺唯赞重组试剂盒将PCR产物与酶切后的载体进行反应构建pET28a-HVR

表5重组质粒的反应体系

1.3重组产物的转化、筛选

转化过程参考说明书进行，转化菌株用带有卡那抗性的LB平板进行筛选，37℃温箱培养，直至出现单菌落。

挑取平板上的单菌落，T7/T7ter引物进行PCR鉴定(如图1)，以及重组质粒的双酶切鉴定(如图2)。

1.4重组质粒的表达

将提取的重组质粒按照说明书转化进入BL21(DE3)感受态细胞中，经验证正确的菌株保存备用，同时接种到LB培养基中，37℃、 200转/min诱培养至OD

1.5表达蛋白SDS-PAGE、WB验证

按照索莱宝的SDS-PAGE凝胶试剂盒配置浓缩胶和12％的分离胶备用。将表达的重组蛋白Hexon-HVR

1.6重组蛋白S3-HVR

镍柱首先用10mM的咪唑溶液进行润洗，将过滤后的细菌破碎液上清穿过镍柱，接着用20mM的咪唑溶液洗脱杂蛋白，最后用500mM 的咪唑溶液洗脱目的蛋白，纯化结果(如图5)显示洗脱效果较好，纯度较高。

2.1抗原蛋白稀释度以及血清稀释度的确定

将上述制备的重组蛋白S3-HVR

表6方阵滴定法结果

2.2抗原蛋白最佳包被时间的确定

将抗原蛋白分别在4℃过夜包被、37℃包被1h、37℃包被2h三个不同的条件下进行，其他的条件不变，结果(表7)发现P/N数值在4℃的情况下最大。

表7

2.3最佳封闭液以及最佳封闭时间的确定

分别选用1％脱脂乳、2％脱脂乳、1％BSA、2％BSA溶液对吸附了抗原蛋白的96孔板进行37℃封闭1h，同时设置一组不封闭作为对照，结果(表8)表明用2％BSA的P/N最大，封闭效果最好。

设置2％BSA分别进行37℃封闭0.5h、37℃封闭1h、37℃封闭 2h；对比结果(表9)最终确定37℃封闭1h作为最佳的封闭时间。

表8

表9

2.4血清最佳孵育时间的确定

将血清样品稀释到合适的浓度分别在37℃孵育0.5h、37℃孵育1 h、37℃孵育2h进行反应，结果(表10)表明P/N的值在37℃孵育1h的条件下最大。

表10

2.5二抗最佳稀释度以及最佳孵育时间的确定

将稀释好的商品化HRP标记的二抗原液分别制备成2倍、4倍、 8倍稀释剂量，对比结果(表11)发现二抗在原液浓度下效果最佳。

对比二抗在37℃下分别孵育0.5h、1h、2h的孵育效果，结果(表 12)表明其在37℃孵育1h情况下P/N数值最大。

表11

表12

2.6PADV-3中和抗体间接ELISA检测程序的确定

经过各个环节的优化确定最佳的检测程序如下：将S3-HVR

2.7阴性样品和阳性样品临界值的确定

选取30份PADV-3的阴性血清，用本研究建立的检测方法读取其在OD

表13

2.8特异性检验

用本研究建立的检测方法分别对PCV2、PRV、FMDV、PRRSV 阳性血清进行检测，PADV-3阳性血清和阴性血清作为对照，结果(表 14)发现其它病毒阳性血清的OD

表14

2.9敏感性检验

将抗原蛋白稀释到最佳的浓度，并且按照前面介绍的最佳包被条件进行包被，之后将标准的PADV-3的阳性血清按照1:40、1:80、1:160、 1:320、1:640的梯度进行稀释，其他条件都是本试验确定的最佳条件。结果发现，当阳性血清稀释到320倍之后其吸光值仍能大于0.362。

2.10重复性检验

随机挑选6份临床血清样品进行批内、批间重复试验。首先用同一批次的重组蛋白进行包被，其他条件均是本研究确定的最佳条件，分别在0h、24h、48h对这6份样品进行测定进行批内重复检验，结果(表15)显示变异系数在1.0％～3.9％之间。选用制备的3个不同批次的重组蛋白作为包被抗原进行包被，结果(表16)显示，批间重复试验的变异系数为0.5％～8.3％之间。

表15

表16

2.11符合性检验

随机挑选30份猪血清样品，先用本研究建立的ELISA检测方法对其进行检测，此方法共检测出阳性样品17份，阴性样品13份；利用试剂盒对这30份血清按照说明书进行核酸提取，然后PCR扩增目的条带之后进行核酸凝胶电泳检测，检测出阳性样品15份，阴性样品15份。对比结果显示此两种方法的阳性符合率为88％。

2.12猪群体内中和抗体的检测

从陕西、山西地区的6个猪场随机采取了241份血清样品用本研究建立的方法进行检测，每个血清样品检测2次，最后共计检测出阳性样品48份，根据此次的检测结果至少可以得出在这些地区猪群体内的PADV-3的中和抗体阳性率为19.9％。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。