一种基于COI基因片段的飘鱼和寡鳞飘鱼的分子鉴别方法

摘要

本发明公开了一种基于COI基因片段的飘鱼和寡鳞飘鱼的分子鉴别方法。该方法包含：（1）分别提取飘鱼和寡鳞飘鱼基因组DNA；（2）PCR扩增飘鱼和寡鳞飘鱼的细胞色素氧化酶亚基I基因；（3）扩增产物纯化后，直接测序，飘鱼的COI基因扩增产物如SEQ ID NO.1所示，寡鳞飘鱼的COI基因扩增产物如SEQ ID NO.2所示；COI基因第4位点第6位点碱基分别是T和A为飘鱼，COI基因第4位点第6位点碱基分别是C和G为寡鳞飘鱼。该方法可以快速、简便、准确、有效地鉴别飘鱼和寡鳞飘鱼，结果稳定性好，重复率高，填补了目前国内分子生物学标准鉴别飘鱼和寡鳞飘鱼的空白，也有利于开展飘鱼和寡鳞飘遗传多样性研究和保护。

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及一种基于COI基因片段的飘鱼和寡鳞飘鱼的分子鉴别方法。

背景技术

飘鱼(Pseudolaubuca sinensis)和寡鳞飘鱼(Pseudolaubuca engraulis)隶属于鲤形目鲌亚科飘鱼属，是一类繁殖快、生活力强的小型鱼类，可食用，具有一定的经济价值。飘鱼和寡鳞飘鱼在我国分布广泛，从南至北诸河流及湖泊均有分布，喜成群于浅水区表层水面上来往漂游，杂食性，是淡水鱼类群落中的常见种类，数量较多，在水生态系统中具有重要的生态作用。多年来，受过度捕捞、水利工程、环境污染等不利因素的影响，飘鱼和寡鳞飘鱼种群数量下降，遗传多样性水平降低。飘鱼和寡鳞飘鱼形态相似，生态位相近，在鱼类资源调查中很难区分和鉴别。线粒DNA（mtDNA）为细胞核外遗传物质，具有母性遗传、结构简单、不发生重组、进化速度等特点。mtDNA在种间、种内群体间具有广泛的多态性，事研究动物物种间进化、进行种属鉴定的常用分子标记。线粒体细胞色素C氧化酶I基因（COI）是蛋白质编码基因之一，在鱼类遗传多样性、系统进化、种类鉴别等研究中具有重要用途，能够有效鉴别和区分近缘物种，现广泛用于分子鉴别领域。

发明内容

本发明的目的是针对形态区分鉴别的困难，提供一种飘鱼和寡鳞飘鱼的分子遗传鉴别方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：一种飘鱼和寡鳞飘鱼的分子遗传鉴别方法，包含以下步骤：（1）分别提取待鉴定的飘鱼和寡鳞飘鱼基因组DNA；（2）以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增飘鱼和寡鳞飘鱼的细胞色素氧化酶亚基I基因，PCR扩增上游引物如序列SEQ ID NO.1所示，下游引物如序列SEQ ID NO.2所示；（3）扩增产物纯化后，直接测序，飘鱼的COI基因扩增产物如SEQ ID NO.3所示，寡鳞飘鱼的COI基因扩增产物如SEQ ID NO.4所示；COI基因第4位点第6位点碱基分别是T和A为飘鱼，COI基因第4位点第6位点碱基分别是C和G为寡鳞飘鱼。

SEQ ID NO.3：

GAATTAAGCCAACCTGGATCACTTCTGGGCGACGATCAAATTTATAACGTTATTGTTACTGCCCATGCCTTCGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATTCTTATTGGGGGGTTTGGAAACTGACTCGTGCCATTAATGATTGGGGCACCGGACATAGCATTCCCACGAATAAATAACATAAGCTTTTGACTTCTACCTCCCTCTTTCCTCCTACTATTAGCCTCTTCTGGCGTTGAAGCCGGGGCCGGTACTGGATGAACAGTTTACCCGCCACTTGCAGGCAACCTTGCTCATGCAGGGGCATCCGTAGACCTAACAATTTTCTCACTTCACCTAGCAGGTGTATCATCAATTTTAGGGGCAATTAACTTCATTACCACAACCATTAACATGAAACCACCAGCCATCTCTCAATACCAAACACCCCTATTTGTCTGAGCTGTACTTGTGACAGCCGTGCTCCTTCTTCTATCCCTACCAGTGCTAGCTGCTGGAATTACAATGCTCCTTACAGATCGAAACTTAAATACTACATTCTTTGATCCGGCGGGGGGAGGAGACCCGATCTTATACCAACACCTATTCTGATTCTTCGGC。

SEQ ID NO.4：

GAACTGAGTCAACCGGGATCACTTCTGGGCGACGATCAAATTTATAATGTTATTGTTACTGCCCATGCCTTCGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATTCTTATCGGAGGGTTTGGAAACTGACTCGTGCCACTAATGATTGGGGCACCGGACATAGCCTTCCCCCGAATAAATAATATAAGCTTCTGACTCCTACCCCCCTCTTTCCTCCTGCTCCTAGCCTCCTCTGGCGTTGAGGCCGGAGCCGGTACAGGATGAACAGTCTACCCCCCACTCGCAGGCAATCTTGCCCATGCAGGAGCATCCGTAGACCTAACAATCTTCTCACTTCACTTAGCAGGTGTGTCCTCAATTTTAGGCGCAATTAATTTTATCACCACAACCATTAATATGAAACCACCAGCCATTTCTCAGTACCAAACACCTCTATTTGTTTGAGCCGTACTTGTAACAGCCGTACTTCTTCTCCTGTCCCTACCAGTCTTAGCGGCTGGAATTACAATGCTCCTTACAGACCGAAACCTAAATACTACCTTCTTTGATCCGGCAGGGGGAGGAGACCCAATCTTATACCAACACTTATTCTGATTCTTCGGC。

所述的PCR的反应体系为50 mL：80ng/μL的模板DNA 1 mL，PCR缓冲液 5 mL，dNTP混合液4 mL，每种dNTP 0.1mmol/L， 10 μmol/L的上、下游引物各1 mL，2mL 2.5 IU的Taq酶；双蒸水36mL；所述的PCR缓冲液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0， 0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl

作为本发明的另一方面，本发明提供一种用于飘鱼和寡鳞飘鱼的分子鉴别的引物对，其中：上游引物如序列SEQ ID NO.1所示，下游引物如序列SEQ ID NO.2所示。

作为本发明的另一方面，本发明提供所述的引物对在分子鉴别飘鱼和寡鳞飘鱼中的应用。

作为本发明的另一方面，本发明提供所述的引物对在制备飘鱼和寡鳞飘鱼分子鉴别试剂中的应用。

作为本发明的另一方面，本发明提供一种飘鱼和寡鳞飘鱼分子鉴别试剂，包含本发明所述的引物对。

优选的，所述的飘鱼和寡鳞飘鱼分子鉴别试剂还优选包括PCR缓冲液和dNTP混合液，所述的PCR缓冲液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0， 0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl

有益效果：

本发明针对飘鱼和寡鳞飘鱼细胞色素氧化酶亚基I（Cytochrome Oxidasesubunit I，COI）基因序列差异，首次以飘鱼和寡鳞飘鱼的COI基因序列片段作为依据，从而定性鉴别飘鱼和寡鳞飘鱼。该方法可以快速、简便、准确、有效地鉴别飘鱼和寡鳞飘鱼，结果稳定性好，重复率高，填补了目前国内分子生物学标准鉴别飘鱼和寡鳞飘鱼的空白，也有利于开展飘鱼和寡鳞飘鱼物种多样性和遗传多样性研究。

附图说明

图1为本发明中COI基因测序序列比对结果，相同的碱基用连接号标识，差异的碱基用星号标识。飘鱼和寡鳞飘鱼从第4位点（COI-4）开始，碱基序列出现差异，其中飘鱼第4位点（COI-4）和第6位点（COI-6）碱基分别是T和A，30尾寡鳞飘鱼第4位点（COI-4）和第6位点（COI-6）碱基分别是C和G。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步阐明本发明，但并不是对本发明做任何形式的限定，仅仅作示例说明。

实施例1

1、PCR引物

设计一对特异性PCR扩增引物，引物序列为：F：5’-TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3’（SEQ ID NO.1），下游引物为R：5’-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’（SEQ ID NO.2）。

2、样本采集

从滆湖采集飘鱼和寡鳞飘鱼共60尾，其中飘鱼和寡鳞飘鱼个体各30尾。

3、基因组DNA提取

取每尾鱼的肌肉组织用于基因组DNA提取。采用Takara公司的光谱性基因组提取试剂盒提取DNA，用去离子水溶解DNA，紫外分光光度计测定DNA溶液OD值并稀释至80ng/μL，-20℃保存备用。

4、PCR扩增与检测

已提取的DNA为模板，用上述引物（F和R）进行PCR扩增。PCR反应体系为50 mL：1 mL模板DNA(800ng/μL)；PCR缓冲液 5 mL(10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl

PCR产物在1.5 %琼脂糖凝胶电泳中检测分离，120 V电压下电泳30 min之后，经凝胶成像分析系统确定 PCR 扩增产物的大小及纯度。

5、测序比对

检测后的PCR扩增产物直接送至生物公司纯化测序，获得COI基因片段，经分析获得长度为600bp的COI基因序列片段。经多重比对后可以发现COI基因从第4位点（COI-4）的碱基序列存在差异：30尾飘鱼第4位点（COI-4）和第6位点（COI-6）碱基分别是T和A，30尾寡鳞飘鱼第4位点（COI-4）和第6位点（COI-6）碱基分别是C和G。

实施例2

按照实施例1方法，从太湖、高邮湖、洪泽湖、骆马湖和庆安水库采集样本，将样本扩大到飘鱼和寡鳞飘鱼个体各80尾，结果依然显示飘鱼COI基因第4位点（COI-4）和第6位点（COI-6）碱基分别是T和A，30尾寡鳞飘鱼第4位点（COI-4）和第6位点（COI-6）碱基分别是C和G。

序列表

<110> 江苏省淡水水产研究所

<120> 一种基于COI基因片段的飘鱼和寡鳞飘鱼的分子鉴别方法

<141> 2020-12-01

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tcgactaatc ataaagatat cggcac 26

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

acttcagggt gaccgaagaa tcagaa 26

<210> 3

<211> 600

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gaattaagcc aacctggatc acttctgggc gacgatcaaa tttataacgt tattgttact 60

gcccatgcct tcgtaataat tttctttata gtaataccaa ttcttattgg ggggtttgga 120

aactgactcg tgccattaat gattggggca ccggacatag cattcccacg aataaataac 180

ataagctttt gacttctacc tccctctttc ctcctactat tagcctcttc tggcgttgaa 240

gccggggccg gtactggatg aacagtttac ccgccacttg caggcaacct tgctcatgca 300

ggggcatccg tagacctaac aattttctca cttcacctag caggtgtatc atcaatttta 360

ggggcaatta acttcattac cacaaccatt aacatgaaac caccagccat ctctcaatac 420

caaacacccc tatttgtctg agctgtactt gtgacagccg tgctccttct tctatcccta 480

ccagtgctag ctgctggaat tacaatgctc cttacagatc gaaacttaaa tactacattc 540

tttgatccgg cggggggagg agacccgatc ttataccaac acctattctg attcttcggc 600

<210> 4

<211> 600

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gaactgagtc aaccgggatc acttctgggc gacgatcaaa tttataatgt tattgttact 60

gcccatgcct tcgtaataat tttctttata gtaatgccaa ttcttatcgg agggtttgga 120

aactgactcg tgccactaat gattggggca ccggacatag ccttcccccg aataaataat 180

ataagcttct gactcctacc cccctctttc ctcctgctcc tagcctcctc tggcgttgag 240

gccggagccg gtacaggatg aacagtctac cccccactcg caggcaatct tgcccatgca 300

ggagcatccg tagacctaac aatcttctca cttcacttag caggtgtgtc ctcaatttta 360

ggcgcaatta attttatcac cacaaccatt aatatgaaac caccagccat ttctcagtac 420

caaacacctc tatttgtttg agccgtactt gtaacagccg tacttcttct cctgtcccta 480

ccagtcttag cggctggaat tacaatgctc cttacagacc gaaacctaaa tactaccttc 540

tttgatccgg cagggggagg agacccaatc ttataccaac acttattctg attcttcggc 600