一种大豆不育基因突变体、应用及大豆不育系的构建方法

摘要

本发明涉及农业育种技术领域，具体而言，涉及一种大豆不育基因突变体、应用及大豆不育系的构建方法。本发明提供了大豆不育基因突变体，该突变体包括Glyma.13G114200基因单个碱基的突变和/或缺失形成的突变体，将上述突变体应用于大豆不育系的构建或育种中，采用CRISPR‑Cas9基因编辑工具直接对野生型大豆进行基因编辑进行大豆不育系的构建，或者应用含有上述基因突变体的大豆与野生型大豆杂交，而后在后代中以育性作为筛选标准或者通过分子标记筛选含不育基因的后代植株，实现了快速得到或鉴定大豆的不育品系，与采用杂交方法获得不育系相比，大大地缩短了育种周期。

说明书

技术领域

本发明涉及农业育种技术领域，具体而言，涉及一种大豆不育基因突变体、应用及大豆不育系的构建方法。

背景技术

大豆是世界重要的粮油兼用作物，也是人类优质蛋白及畜牧业饲料蛋白的主要来源。20世纪50年代以前，中国曾是世界上最大的大豆生产国和出口国，到1996年，我国成为大豆纯进口国，目前我国大豆进口量约占中国大豆消费市场的90％，受国际市场影响严重，因此，发展国产大豆势在必行，但由于产量低，比较效益差，农民种植意愿不强等原因，需要给予高补贴才能保障国内大豆产业的发展。

杂种优势利用是大幅度提高作物产量最有效的措施之一，目前种植杂交大豆平均增产15％左右，可大幅增加农民种植效益。雄性不育系是杂种优势利用的重要物质基础，分为核不育系(GMS)和细胞质雄性不育系(CMS)，也称为质-核互作雄性不育。

1、大豆核雄性不育(GMS)

(1)结构性雄性不育

Singh等(1978)报导了一个大豆结构性不育系，属于核雄性不育，是由隐性单基因控制，其特点是花粉正常可育，但花药不开裂，无法完成正常的授粉、受精的过程。Winger(1979)，Johns和Palmer(1982)曾先后报道过另一种结构性不育。其遗传特点是雄性不育植株上能够形成正常花粉，但由于花蕾结构畸形，阻碍了花丝的正常伸长，使雄蕊无法达到柱头而不能自花授粉。这类不育系由于得不到百分之百的不育株，同时，植株生长不十分正常，不育性也不完全可靠，无法用于杂交种生产。

(2)部分雄性不育

此类雄性不育是核不育的另一种类型，部分雄性不育是“雄性不育的不完全表现”。在大豆中已经发现了多个这一类型的不育。Caviness等(1970)报导的部分雄性不育系Arkansas，它的育性随着温度的变化而改变。当昼夜温度分别为21℃/16℃，29℃/21℃和35℃/27℃时，该不育系的单株荚数分别为4.7、8.7和0，即高温促使不育，低温恢复可育(Caviness and Fagala,1973)。最典型的大豆部分雄性不育应属于Stelley等(1980)报导的msp部分不育，他详细地描述了msp在纯合状态下的表现，并证明了msp植株在低温条件下(昼夜温度24℃/18℃或24℃/21℃)表现完全不育；而在比较高温条件下(昼夜温度35℃/27℃或35℃/32℃)，表现几乎完全可育。Carlson和Williams(1985)对msp与温度的关系也进行了研究，他是将白天的温度固定为24℃，而夜间的温度分别为15℃、18℃、21℃和24℃，结果表明夜晚温度降低与花粉可育之间有很高的相关性，即夜晚的温度低可育率高。这类不育系也可以称为温敏型雄性不育，因为它的育性随着温度的变化而改变。

(3)隐性单基因控制的完全雄性不育

在大豆的核基因变异引起的不育中，最有实用价值、且研究比较透彻的当属这一类型的不育。自从Brim等(1971)报导了第一个ms不育系以来，已经有11个不同的、相互独立的雄性不育、雌性可育突变被发现，并已将不育位点初步定位到不同的染色体基因组上。这类不育突变在ms位点上的杂合植株会分离出3(可育)：1(不育)的后代，说明不育是由隐性单基因控制。ms不育系优点明显，被广泛应用于大豆的遗传、轮回选择等研究。2019年，Thu等将ms4突变基因精细定位到包含23个编码基因的216kb的区域内，其中，Glyma.02G243200是拟南芥MMD1(MALEMEIOCYTE DEATH 1)的同源基因，编码PHD蛋白，用MS4基因互补拟南芥突变体的突变性状，可以鉴定到控制ms4突变体的不育基因。

2、大豆细胞质雄性不育(CMS)

最早的有关大豆细胞质雄性不育系的报导，是Davis(1985)在一项美国专利中描述的。不育细胞质来源于栽培大豆品种Elf，有两对保持基因r1r1、r2r2，分别来自栽培大豆Bedford和Braxfon，至少一个等位基因R1或R2的存在，即可使该不育系恢复可育。专利公布至今已20年，没有任何关于该不育系的细胞学、分子生物学，以及该不育系实际应用的报道。孙寰等(1993)在一个栽培大豆与一年生野生大豆的远缘杂交组合167×035中，发现F1花粉高度不育，根据正反交F1育性的差异，表明167细胞质对育性有影响，经5代连续回交，于1993年育成具有野生大豆表现型的细胞质雄性不育系OA及其同型保持系OB。在1995年育成栽培大豆不育系YA及保持系YB；同时找到了恢复系，实现了“三系”配套，即RN型细胞质雄性不育系统，相继研究者又发现了“ZD”、“M”、“XXT”、“N”等类型不育细胞质雄性不育类型。

可见，目前成功商业应用的大豆不育系均需要利用细胞质雄性不育系通过杂交获得，育种周期长，且稳定性不强，亟需一种更加快捷、高效构建大豆不育系的方法。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大豆不育基因突变体，该突变体在编码花粉发育的基因Glyma.13G114200发生了点突变，导致花粉不发育或者发育不完全，能够在后代中实现育性分离。

本发明另一目的在于提供上述突变体的应用，由于上述突变体能够引起花粉败育，因此，将上述突变体应用于大豆不育系的构建或育种中，能够实现快速得到大豆的不育品系，与采用杂交方法构建不育系相比，能大大缩短育种周期。

本发明的另一目的在于提供利用上述突变体进行大豆不育系构建的方法，该方法采用CRISPR-Cas9基因编辑工具直接对野生型大豆进行基因编辑，成功获得不育的大豆植株；或应用包含上述突变体的大豆与野生型大豆杂交，而后在后代中以育性作为筛选标准或者通过分子标记筛选含不育基因的后代植株，实现了快速得到或鉴定大豆的不育品系，得到的不育品系植株中存在上述突变体引入的核基因缺陷，因此，其不育特性具有强的稳定性。

本发明是这样实现的：

本发明提供一种大豆不育基因突变体，所述大豆不育基因突变体包括Glyma.13G114200基因单个碱基的突变和/或缺失形成的突变体。

上述突变体包括Glyma.13G114200基因第1470bp位碱基G缺失、Glyma.13G114200基因第787bp处碱基C突变为T、Glyma.13G114200基因第73bp处碱基C缺失或Glyma.13G114200基因第1817～1827共11bp碱基缺失中的一种或两种以上组合。Glyma.13G114200基因第1470bp位碱基G缺失，使得1618～1620位形成终止密码子TAA，Glyma.13G114200基因的翻译过程提前中止于第539位氨基酸，无法实现完整翻译，最终导致大豆花粉发育失败，形成花药中不含有花粉的不育系植株。而Glyma.13G114200基因第787bp处碱基C突变为T，虽然不会导致基因翻译中止，但是使得对应的原精氨酸突变为半胱氨酸，蛋白质结构域分析发现该突变导致Kinesin蛋白氨基端的一个保守的motor结构域的发生了改变，影响了Kinesin蛋白的驱动活性，最终形成败育的花粉。Glyma.13G114200基因第73bp位碱基C缺失，使得121～123位形成终止密码子TGA，Glyma.13G114200基因的翻译过程提前中止于第40位氨基酸，无法实现完整翻译，最终导致大豆花粉发育失败，形成花药中不含有花粉的不育系植株。Glyma.13G114200基因第1817～1827共11位碱基缺失，使得1909～1911位形成终止密码子TAA，Glyma.13G114200基因的翻译过程提前中止于第636位氨基酸，无法实现完整翻译，最终导致大豆花粉发育失败，形成花药中不含有花粉的不育系植株。

本发明还提供了上述大豆不育基因突变体在构建大豆不育系和/或育种中的应用。

优选地，所述育种的方法包括轮回选择育种、回交育种或第三代智能核不育育种。

轮回选择育种是一种周期性的群体改良方法，它通过反复的鉴定、选择、重组过程，使群体内的优良或增效基因频率逐步增加，不良或减效基因频率不断压低，达到改善群体内目标形状的平均表现的目的。轮回选择尤其适合于对呈数量遗传的形状进行改良，如提高产量及其构成因素、改善种子和植株品质、提高抗病虫性和对不良环境的耐受性等。

可选的实施方式中，将上述含有上述不育基因突变体的大豆作为母本，与不同来源大豆品种和资源材料混合种植，通过自然界昆虫传粉，使需要人工去雄杂交变为开放式昆虫转粉杂交。收取不育突变体种子，继续种植，后代不育基因分离群体，继续通过互交、回交和轮回选择等方式进行昆虫杂交，尽可能多地将不同来源亲本的优良基因进行聚合，从中选育优良大豆材料，即可实现大豆不育系的构建。

回交育种是把供体的目标性状通过回交导入受体的育种方法。其中，缺少目标性状的优良品种重复用作亲本，称轮回亲本，又因其是目标性状的接受者，也称受体。用另一具有目标性状的品种作另一亲本，只在开始回交时用1次，称非轮回亲本。因是目标性状的提供者，故称供体。回交育种过程中，从回交一代开始，每代都从杂种中选择具有供体的目标性状的个体与轮回亲本杂交。如此继续进行多次，直到最后得到所有性状与受体相似，但增加了从供体转来的目标性状的后代时为止。然后再进行1～2次自交，选出被转移性状为纯合的个体，进而育成新品种或品系。在理论上每回交1次，杂种后代所含轮回亲本的遗传成分将递增一半，一般经5～6次回交，其后代的主要性状已接近轮回亲本。

在可选实施方式中，选择有发展前途的品种作为受体，例如吉林20，将上述含有上述不育基因突变体的大豆作为供体，进行回交转育，得到所有性状与受体样本一致的不育植株，而后再通过自交，得到纯合大豆不育系。

上述第三代智能核不育育种是将决定大豆不育性状的自构建载体转入到大豆种子中，从而获得大豆不育系的育种方法，本发明所述自构建载体包括三个部分：(1)由35S驱动Glyma.13G114200基因的过表达部件，(2)由花药特异启动子驱动的可以杀死花药的部件，(3)由种子特异表达基因启动子驱动的颜色模块基因。

本发明提供了一种大豆不育系的构建方法，该构建方法包括采用基因编辑工具在野生型大豆中构建上述的大豆不育基因突变体，或应用包含上述大豆不育基因突变体的大豆与野生型大豆杂交，然后筛选后代中不育植株。

优选地，所述基因编辑工具包括CRISPR-Cas9。

上述野生型大豆包括Williams 82。

在可选的实施方式中，所述突变体包括Glyma.13G114200基因第73bp处碱基C缺失，所述基因编辑工具包括靶向突变位点的引物对，所述引物对的前向引物包括5’-ATGCTTCAGGTACGCCGGG-3’，所述引物对的反向引物包括5’-CCCGGCGTACCTGAAGCAT-3’。

在可选实施方式中，所述突变体包括Glyma.13G114200基因第1817～1827共11bp碱基缺失，所述基因编辑工具包括靶向突变位点的引物对，所述引物对的前向引物包括5’-ACAAGACGACCCCTCTGAGA-3’，所述引物对的反向引物包括5’-TCTCAGAGGGGTCGTCTTGT-3’。

在可选实施方式中，所述筛选后代中不育植株的方法包括花粉败育筛选的方法和/或分子标记鉴定的方法。

优选地，所述筛选后代中花粉败育植株的方法包括通过观察筛选花药中未发育形成花粉的植株，该方法适用于筛选采用Glyma.13G114200基因DNA第1470bp位碱基G缺失突变体构建的大豆不育系。

优选地，所述筛选后代中花粉败育植株的方法包括通过观察筛选花药中花粉为不规则球形的植株，和/或，通过染色法筛选花粉败育率达到95.1％以上的植株，该方法适用于采用Glyma.13G114200基因第787bp处碱基C突变为T突变体构建大豆不育系时。

优选地，所述分子标记鉴定的方法包括，采用分子标记对大豆种子基因进行扩增，扩增产物酶切后经凝胶电泳检测判断基因组来源大豆种子的育性。通过酶切产物条带大小，很容易区分大豆种子的不同基因型，实现在种植前对植株的基因型进行确定，可以极大地减少后续的种植及鉴定工作。

在可选实施方式中，所述分子标记包括特异引物对，所述特异引物对上游序列5’-GATTGTGGGCCCTCTAGTCAA-3’和下游序列5’-ACGAGCATTGCAGCACACATTA-3’，所述大豆种子基因包括Glyma.13G114200基因的点突变，所述Glyma.13G114200基因的点突变包括第1470bp位碱基G缺失。

在可选实施方式中，所述分子标记包括特异引物对，所述特异引物对包括上游引物5’-ACATCTTAGGCGCTTAATTGGCAT-3’和下游引物5’-ACCTACCTTCATGTCACAAGACAACT-3’，所述大豆种子基因包括Glyma.13G114200基因的点突变，所述Glyma.13G114200基因的点突变包括第787bp处碱基C突变为T。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种大豆不育基因突变体，该突变体包括Glyma.13G114200基因单个碱基的突变和/或缺失形成的突变体，基因Glyma.13G114200是控制大豆花粉发育的基因，本发明提供的突变体中，基因Glyma.13G114200发生的点突变能够导致花粉不发育或者发育不完全，从而在后代中实现育性分离。

本发明还提供了上述突变体的应用，由于上述突变体能够引起花粉败育，因此，本发明将上述突变体应用于了大豆不育系的构建或育种中，实现了快速得到大豆的不育品系，与采用杂交方法构建不育系相比，大大地缩短了育种周期。

本发明还提供了利用上述突变体进行大豆不育系构建的方法，该方法采用CRISPR-Cas9基因编辑工具直接对野生型大豆进行基因编辑，或者应用含有上述基因突变体的大豆与野生型大豆杂交，而后在后代中以花粉育性作为筛选标准或者采用分子标记进行筛选，筛选不育的后代植株，得到的不育植株核基因中存在Glyma.13G114200基因点突变形成的基因缺陷，使得后代不育植株的不育性状具有强稳定性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例5中所得含有突变体大豆与野生型大豆花粉染色结果图；

图2为实施例5中所得含有突变体大豆与野生型大豆果荚对比图；

图3为实施例6中酶切前PCR产物的电泳条带结果图；

图4为实施例6中酶切后PCR产物的电泳条带结果图；

图5为实施例7中酶切前PCR产物的电泳条带结果图；

图6为实施例7中酶切后PCR产物的电泳条带结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种大豆不育基因突变体，该突变体Glyma.13G114200基因第1470bp位碱基G缺失。

实施例2

本实施例提供一种大豆不育基因突变体，该突变体Glyma.13G114200基因第787bp处碱基C突变为T。

实施例3

本实施例提供一种大豆不育基因突变体，该突变体Glyma.13G114200基因第73bp处碱基G缺失。

实施例4

本实施例提供一种大豆不育基因突变体，该突变体Glyma.13G114200基因第1817～1827共11bp碱基缺失。

实施例5

本实施例提供了一种含有大豆不育基因突变体的大豆不育系的构建方法，该方法能够同时获得实施例3和实施例4所述两种大豆不育基因突变体，具体包括以下步骤：

5.1多靶点载体的构建

参考华南农业大学刘耀光院士采用的多靶点载体构建方法(DOI:https://doi.org/10.1016/j.molp.2015.04.007)，通过使用在线网站CRISPR direct(http://crispr.dbcls.jp/)，选择实施例3所述不育基因突变体目标区域NGG序列上游的19个碱基作为靶点序列，命名为ms-T1，同时选择实施例4所述不育基因突变体目标区域NGG序列上游的20个碱基作为靶点序列，命名为ms-T2，针对两条靶点序列人工合成对应引物对，所述ms-T1对应引物对包括前向引物5’-ATGCTTCAGGTACGCCGGG-3’(SEQ ID No.1)和反向引物5’-CCCGGCGTACCTGAAGCAT-3’(SEQ ID No.2)，所述ms-T2对应引物对包括前向引物包括5’-ACAAGACGACCCCTCTGAGA-3’(SEQ ID No.3)和反向引物包括5’-TCTCAGAGGGGTCGTCTTGT-3’(SEQ ID No.4)，然后在ms-T1对应引物对序列前连接gRNA-AtU3d载体的启动子接头，在ms-T2对应引物对序列前连接gRNA-AtU6-29载体的启动子接头，如表1所示，表中小写字母表示启动子接头，然后两组引物对组成的靶向序列分别连接对应的gRNA：AtU3d和AtU6-29，最后将连接了gRNA的靶向序列AtU3d-T1-gRNA和AtU6-29-T2-gRNA连接到pYLCRISPR/Cas9-DB大载体上。

表1实施例1构建多靶点载体的引物信息表

5.2转基因植株的培育

将步骤1.1中得到多靶点载体转化至农杆菌EHA101中，随后用农杆菌EHA101侵染大豆Williams 82子叶节30min后，将子叶放于共培养培养基中，在25℃、16h光/8h暗的条件下培养4天，而后转入B5芽诱导培养基中诱导不定芽。4周后，不定芽经芽伸长培养基培养，培养条件为25℃，16h光/8h暗。待其伸长大约到5～7cm时，再将其转移到生根培养基中生根，根系健壮后移到土里，获得转基因植株。

5.3T1代花粉败育率鉴定

收获步骤1.2中获得转基因植株的大豆种子，与野生大豆共同栽培后，待花开放时，取授粉前花苞放于70％乙醇中室温固定2小时。然后剥离萼片及花瓣，滴加碘-碘化钾溶液，用平头镊子将花药压破，释放出花粉，在显微镜下观察转基因植株和野生大豆植株花粉育性情况，结果如图1所示，图中A为野生型大豆的花粉镜检结果，B为含有突变体大豆的花粉镜检结果，图2为转基因植株和野生大豆植株结果后的植株对比图，其中C为野生型大豆的果荚，D为含有突变体大豆的果荚，通过观察，可以发现含有突变体的大豆植株与野生型相比，在植株高度上转基因植株和野生大豆植株没有明显差异。在生殖发育方面，突变体植株表现出不育的特征，其表现在于荚不发育形成正常的果荚，且碘-碘化钾染色分析，发现所得突变体植株的花粉表现出膨大和数目减少的特征。

实施例6

随机选取15枚应用实施例1提供的突变体构建大豆不育系获得的大豆种子，利用分子标记鉴定方法，鉴定所得大豆种子的不育性状，并区分所得大豆种子的杂合情况，具体包括以下步骤：

6.1提取待测15枚大豆组织基因组DNA，此DNA作为PCR扩增模板。

6.2进行PCR扩增，扩增体系为：5μL的2×Taq Master mix，上游引物(5’-GATTGTGGGCCCTCTAGTCAA-3’，如SEQ ID No.5所示)、下游引物(5’-ACGAGCATTGCAGCACACATTA-3’，如SEQ ID No.6所示)各加入0.5μL，1μL大豆DNA，加入4μL的ddH

6.3进行PCR产物酶切

向PCR产物中加入0.4μL的BstXⅠ、1μL的10倍CutSmart buffer、3μL PCR产物和5.6μL ddH

6.4利用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，成像并记录条带数量和大小，通过获得不同数量和长度大小的条带进行大豆材料的准确区分，结果如图4所示。

PCR扩增的产物大小、相应的限制性内切酶和酶切后的片段大小等特征如下所述：

PCR扩增的产物为961bp，PCR产物利用限制性内切酶BstXⅠ酶切，纯合可育(基因型MS/MS，标记为a)大豆的酶切片段为一个，长度为961bp；杂合可育(基因型MS/ms,标记为h)大豆的酶切片段为三个，长度分别为961bp、811bp和150bp；纯合不育(基因型ms/ms,标记为b)大豆酶切片段为两个，长度分别为811bp和150bp。由图3和图4对比可以看出，编号为1、11和15的大豆种子为纯合可育型的，编号为2～6、8、10、13和14的大豆种子为杂合可育型的，编号为7、9和12的大豆种子为纯合不育型的，因此，编号为7、9和12的种子可以作为不育系在育种中使用。

实施例7

随机选取9枚应用实施例2提供的突变体构建大豆不育系获得的大豆种子，利用分子标记鉴定方法，鉴定所得大豆种子的不育性状，并区分所得大豆种子的杂合情况，具体包括以下步骤：

7.1提取待测9枚大豆组织基因组DNA，此DNA作为PCR扩增模板。

7.2进行PCR扩增，扩增体系为：5μL的2×Taq Master mix，上游引物(5’-ACATCTTAGGCGCTTAATTGGCAT-3’，如SEQ ID No.7所示)、下游引物(5’-ACCTACCTTCATGTCACAAGACAACT-3’，如SEQ ID No.8所示)各加入0.5μL，1μL大豆DNA，加入4μL的ddH

7.3进行PCR产物酶切

向PCR产物中加入0.4μL的Bsm Ⅰ、1μL的10倍CutSmart buffer、0.8μL PCR产物和7.8μL ddH

7.4利用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，成像并记录条带数量和大小，通过获得不同数量和长度大小的条带进行大豆材料的准确区分，结果如图6所示。

PCR扩增的产物大小、相应的限制性内切酶和酶切后的片段大小等特征如下所述：

PCR扩增的产物为1046bp，PCR产物利用限制性内切酶Bsm Ⅰ酶切，纯合可育(基因型MS/MS，标记为a)大豆的酶切片段为一个，长度为1046bp；杂合可育(基因型MS/ms,标记为h)大豆的酶切片段为三个，长度分别为1046bp、643bp和403bp；纯合不育(基因型ms/ms,标记为b)大豆酶切片段为两个，长度分别为643bp和403bp。由图5和图6对比可以看出，编号为3、4和8的大豆种子为纯合可育型的，编号为1和6的大豆种子为杂合可育型的，编号为2、5、7和9的大豆种子为纯合不育型的，因此，编号为2、5、7和9的种子可以作为不育系在育种中使用。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林省农业科学院 广州大学

<120> 一种大豆不育基因突变体、应用及大豆不育系的构建方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cccggcgtac ctgaagcat 19

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

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<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tctcagaggg gtcgtcttgt 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

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<211> 22

<212> DNA

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<400> 6

acgagcattg cagcacacat ta 22

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<211> 24

<212> DNA

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<400> 7

acatcttagg cgcttaattg gcat 24

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<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

acctaccttc atgtcacaag acaact 26