生物材料保存组合物、生物材料的保存方法、生物材料的生产方法、移植材料和移植方法

摘要

提供能保存生物材料的组合物。本发明的生物材料保存组合物包含微小气泡。

说明书

技术领域

本发明涉及生物材料保存组合物、生物材料的保存方法、生物材料的生产方法、移植材料和移植方法。

背景技术

针对脏器等的功能降低或功能障碍的患者，通过实施脏器移植而进行了治疗。然而，脏器移植用的脏器的提供者主要是脑死者，因此脏器的数量不足(非专利文献1)。因此，尝试了将死体用作脏器的供给源并将由死体获得的脏器保存后进行移植。

然而，由死体获得的脏器在死后直至获得脏器所需的时间各不相同，因此存在在移植后进行再灌注时容易引起对脏器的损害、保存后的脏器的品质不恒定这样的问题。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：公益社团法人日本脏器移植网络、“脏器移植是指”、[online]、[平成30年5月31日检索]、互联网

发明内容

因此，本发明的目的在于提供能保存生物材料的组合物。

为了实现前述目的，本发明的生物材料保存组合物包含微小气泡。

本发明的生物材料的保存方法(以下也称为“第1保存方法”)包括在微小气泡的存在下保存生物材料的保存工序。

本发明的生物材料的保存方法(以下也称为“第2保存方法”)包括：将微小气泡导入生物材料中的导入工序、及

保存前述生物材料的保存工序。

本发明的生物材料的生产方法(以下也称为“生产方法”)包括保存已生产的生物材料的材料保存工序，

前述材料保存工序通过前述本发明的生物材料的保存方法来实施。

本发明的移植材料通过前述本发明的生物材料的生产方法而生产。

本发明的移植方法包括将前述本发明的移植材料移植到动物中的移植工序。

根据本发明的组合物，能够保存生物材料。

附图说明

图1是示出实施例1中的微小气泡的制造装置的示意图。

图2是示出实施例1中的细胞的存活率的图。

图3是示出实施例2中的血小板数的增减率的图。

图4是示出实施例3中的保存后的肾脏的尿量的图。

图5是示出实施例4中的细胞的存活率的图。

图6是示出实施例5中的保存后的肺的重量的图。

图7是示出实施例6中的细胞的存活率的图。

图8是示出实施例7中的细胞的存活率的图。

图9是示出实施例7中的细胞的存活率的图。

图10是示出实施例8中的细胞的存活率的相对值的图。

图11是示出实施例8中的细胞的存活率的相对值的图。

图12是示出实施例8中的细胞的存活率的相对值的图。

图13是示出实施例8中的细胞的存活率的相对值的图。

图14是示出实施例8中的细胞的存活率的相对值的图。

图15是示出实施例9中的移植后的心脏的照片。

图16是示出实施例10中的包含各气体的微小气泡的密度的图。

图17是示出实施例11中的保存后的心脏的评价结果的图。

图18是示出实施例12中的微小气泡的制造装置的示意图。

具体实施方式

＜组合物＞

如前所述，本发明的组合物包含微小气泡。本发明的组合物的特征在于包含前述微小气泡，其它构成和条件没有特别限制。根据本发明的组合物，例如，虽机理尚不明确，但能够抑制细胞保存时的细胞存活率的降低、控制细胞的活性/非活化和/或控制代谢(以下也称为“细胞保存效果”)。另外，根据本发明的组合物，例如，虽机理尚不明确，但能够抑制再灌注保存后的生物材料时所发生的对生物材料的损伤。因此，根据本发明的组合物，能够以保存后生物材料也能发挥其功能的状态进行保存(以下也称为“生物材料保存效果”)。

本发明中，“微小气泡”是指被气体除外的物质包围的、由气体形成的封闭的微小的空间，例如也可以称为微细气泡。前述微小气泡例如可列举出小气泡(Fine bubble)。前述小气泡通常是指气泡直径小于100μm的微小气泡。前述气泡直径是指气泡的当量球径。前述气泡直径可以是利用后述的测定方法而得到的微小气泡的平均直径(算术平均直径)。前述小气泡可以是微气泡(Micro bubble)，还可以是超细气泡(Ultra fine bubble)。前述微气泡通常是指气泡直径为1μm以上且小于100μm的微小气泡。前述超细气泡通常是指气泡直径小于1μm的微小气泡。

前述微小气泡以分散于介质中的形式存在。前述微小气泡以分散于前述介质的整体或一部分中的形式存在。后者的情况，也可以说前述微小气泡局部存在于前述介质的一部分中。前述介质例如可列举出液体或固体。前述液体例如可列举出包含水的水性溶剂、油性溶剂或它们的混合溶剂等。另外，前述液体包括溶胶。前述固体例如可列举出使前述液体凝固而得到的固体。另外，前述固体包含凝胶。前述液体和前述固体例如可以援用后述的本发明的对象物的制造方法中的对象物的说明。

前述微小气泡可以包含任意种类的气体。前述气体(气体成分)例如可列举出一氧化碳(CO)、一氧化氮(NO)、硫化氢(H

前述微小气泡的密度是指相对于前述介质的体积的微小气泡的数量。前述“密度”还可以称为数浓度。前述微小气泡的密度的下限值例如为5×10

前述微小气泡的密度、气泡直径和平均直径(以下也称为“特性”)可以根据分散有前述微小气泡的介质进行适宜测定。在液体的介质中分散有前述微小气泡时，前述微小气泡的特性可以通过利用粒子轨迹分析法对本发明的组合物中的气泡进行解析而算出。前述粒子轨迹分析法例如可以依据后述的实施例1、使用NanoSight(注册商标)NS300(MalvernInstrument公司制)加以实施。前述微小气泡的特性还可以利用除粒子轨迹分析法以外的其它解析方法而算出。在此情况下，其它解析方法中得到的微小气泡的特性在转换为利用前述粒子轨迹分析法得到的计算值时满足前述的示例。在固体的介质中分散有前述微小气泡时，前述微小气泡的特性可以基于前述介质的固化前的液体中的微小气泡的特性、及通过溶解固体的介质而得到的液体中的微小气泡的特性而算出。

前述气体包含CO时，前述气体中所占的CO的比例例如超过0％且为100％以下，为10～90％、10～80％、15～70％、20～60％、20～50％、20～40％，优选为20～30％。

前述气体包含H

前述气体包含O

前述气体包含CO和O

前述气体包含H

本发明的组合物例如可以使用任意的气体通过小气泡等微小气泡的制造方法而制造。因此，本发明的组合物的制造方法例如包括使用任意的气体和介质而制造微小气泡的气泡制造工序。作为具体例，本发明的组合物为液体时，前述液体的组合物例如可以使用任意的气体、前述介质及旋流方式、弹出器式(ejector)、文丘里式(Venturi)、静态混合器方式(static mixer)、微孔方式、加压溶解式或超声波空化式的微小气泡的制造装置而制造。另外，本发明的组合物为固体时，前述固体的组合物可以通过利用公知的方法将前述液体的组合物凝固而制造。前述固体为凝胶的情况，凝胶的组合物例如可以通过将前述液体的组合物与凝胶化剂混合从而制造。在前述气泡制造工序开始时，前述任意的气体状态为气体、液体或固体。本发明的组合物例如可以利用后述的本发明的对象物的制造方法而制造。前述任意的气体可以援用前述气体的说明。前述任意的气体可以是多种气体。在此情况下，可以将各气体分别供给于前述气泡制造工序，还可以将前述任意的气体的全部或一部分同时供给于前述气泡制造工序。作为具体例，前述气体为CO和O

本发明的组合物例如还可以包含表面活性剂等其它成分。前述表面活性剂例如可列举出阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、两性表面活性剂等离子性表面活性剂或非离子表面活性剂。前述阴离子系表面活性剂例如可列举出月桂基硫酸钠等单烷基阴离子性表面活性剂等。前述阳离子性表面活性剂例如可列举出二甲基二(十八烷基)氯化铵等二烷基阳离子表面活性剂等。前述非离子系表面活性剂例如可列举出聚(氧亚乙基)辛基苯基醚等醚型非离子系表面活性剂等。本发明的组合物例如包含表面活性剂、优选包含阳离子性表面活性剂，由此能够改善前述微小气泡的密度。

如前所述，本发明的组合物能够保存生物材料。因此，本发明的组合物例如可以适宜地用作生物材料保存组合物。

＜生物材料保存组合物＞

如前所述，本发明的生物材料保存组合物包含微小气泡。本发明的生物材料保存组合物的特征在于包含微小气泡，其它构成和条件没有特别限制。根据本发明的组合物，例如，虽机理尚不明确，但能够抑制再灌注保存后的生物材料时发生的对生物材料的损伤。因此，根据本发明的生物材料保存组合物，例如，能够以保存后生物材料也能够发挥其功能的状态进行保存。根据本发明的生物材料保存组合物，例如，能够简便地实施后述的本发明的生物材料的保存方法和生物材料的生产方法。本发明的生物材料保存组合物例如可以援用前述本发明的组合物的说明。

本发明中，“生物材料”例如可列举出生物体的一部分或脏器等。前述生物体的一部分例如可列举出四肢、手指、面部、骨骼、肌肉、发根、牙齿、牙周韧带等。前述脏器可列举出眼球、角膜、肺、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、胆囊、食道、胃、小肠、大肠、精巢、卵巢、中枢神经、外周神经、血管、皮肤等。前述生物材料例如可以是由生物体或死体分离得到的生物材料，还可以通过分化和诱导由胚胎干细胞(ES)、诱导多能干细胞(iPS)等多能细胞、干细胞等细胞制备的生物材料。对于前述生物材料，例如已分离的细胞、细胞片和细胞成分除外。前述细胞片例如包含将1种以上的细胞片层叠而成的层叠体。

前述生物材料的来源例如为动物。前述动物没有特别限制，例如可列举出人、除人外的非人动物等，前述非人动物例如可列举出小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、猴、兔子、绵羊、马、猪等哺乳类动物、苍蝇等非哺乳类动物。

本发明的生物材料保存组合物中，“生物材料保存”例如是指在将生物材料保持原样的状态；以及保存后使用时，使前述生物材料保持能够发挥其功能的状态，还可以是任意者的含义。

本发明的生物材料保存组合物中，前述微小气泡可以包含任意种类的气体。前述气体例如可以援用前述本发明的组合物中的气体(气体成分)的说明。前述微小气泡能够进一步抑制细胞保存时的细胞存活率的降低，能够以生物材料能发挥其功能的状态进行保存，因此优选包含CO和H

本发明的生物材料保存组合物中，前述微小气泡分散于介质中而存在。前述介质例如可列举出液体或固体。前述液体和前述固体例如可以援用前述本发明的组合物的说明和后述的本发明的对象物的制造方法中的对象物的说明。

本发明的生物材料保存组合物中，前述微小气泡的特性、CO、H

本发明的生物材料保存组合物还可以包含其它成分。前述其它成分例如可列举出生物材料或细胞的保存中使用的通常的成分，例如可列举出缓冲剂；氨基酸、糖、维生素等营养成分；生长因子等蛋白质；DMSO等冷冻保存剂；盐；血清、血浆等血液成分；前述表面活性剂等。前述其它成分可以包含公知的生物材料的保存液。前述保存液例如可列举出University of Wisconsin(UW)液、组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐(histidine-tryptophan-ketoglutarate：HTK)液、Celsoir液、ET-Kyoto液、IGL-1液、Polysol液、Euro-Collins(EC)液等。

＜包含微小气泡的对象物的制造方法＞

如前所述，本发明的包含微小气泡的对象物的制造方法包括将微小气泡导入对象物中的导入工序。本发明的对象物的制造方法的特征在于包括前述导入工序，其它工序和条件没有特别限制。根据本发明的对象物的制造方法，例如，虽机理尚不明确，但可以制造能够抑制后述的细胞保存时的细胞的存活率降低的对象物。另外，根据本发明的对象物的制造方法，例如，虽机理尚不明确，但可以制造能够抑制再灌注保存后的生物材料时发生的对生物材料的损伤的对象物。根据本发明的对象物的制造方法，例如，能够制造本发明的组合物。因此，本发明的对象物的制造方法还可以称为本发明的组合物的制造方法。本发明的对象物的制造方法例如可以援用前述本发明的组合物和生物材料保存组合物的说明。

在前述导入工序中，将微小气泡导入对象物中。在前述导入工序中，前述对象物的物性可以是液体，还可以是固体。前述液体例如包含溶胶，前述固体包括溶胶。前述对象物可列举出例如为水等水性溶剂；油性溶剂；生理盐水、University of Wisconsin(UW)液、组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐(histidine-tryptophan-ketoglutarate：HTK)液、Celsoir液、ET-Kyoto液、IGL-1液、Polysol液、Euro-Collins液等保存液；Lactec D输液、Veen F、SOLYUGEN D、SOLULACT、乳胶蛋白凝胶等细胞外液(输液)、它们的混合溶剂等。

在前述导入工序中，向前述对象物中导入微小气泡的导入方法例如可以使用前述对象物和任意的气体导入前述微小气泡，还可以通过使前述对象物与包含前述微小气泡的介质接触或混合，从而导入前述微小气泡。前者的情况，前述导入工序例如可以与前述本发明的组合物中的气泡制造工序同样地来实施。后者的情况，前述导入工序例如通过使前述对象物与前述本发明的组合物接触或进行混合来实施。前述导入工序能够进一步增强前述细胞保存效果或前述生物材料保存效果，因此优选使用CO和H

导入至前述对象物的气体为任意的气体。前述任意的气体可以援用前述本发明的组合物中的气体(气体成分)的说明。前述任意的气体可以是多种气体。在前述对象物中导入包含多种气体的微小气泡时，可以分别导入1种以上的气体，还可以同时导入多种气体。作为具体例，前述气体为CO和O

在前述导入工序中，被导入至前述对象物中的前述微小气泡的特性、气体的浓度、CO、H

前述导入工序例如可以在表面活性剂的存在下实施。通过在表面活性剂的存在下实施前述导入工序，从而能够改善得到的对象物中的微小气泡的密度。

＜第1生物材料的保存方法＞

如前所述，本发明的生物材料的保存方法包括在微小气泡的存在下保存生物材料的保存工序。本发明的第1保存方法的特征在于包括在前述微小气泡的存在下保存前述生物材料的保存工序，其它工序和条件没有特别限制。根据本发明的第1保存方法，例如，能够抑制再灌注保存后的生物材料时发生的对生物材料的损伤。因此，根据本发明的第1保存方法，例如，能够以保存后生物材料也能够发挥其功能的状态进行保存。本发明的第1保存方法例如可以援用前述本发明的组合物、生物材料保存组合物和对象物的制造方法的说明。

在前述保存工序中，在微小气泡的存在下保存生物材料。具体而言，在前述保存工序中，在包含前述微小气泡的介质的存在下保存生物材料。前述介质例如可以援用前述本发明的组合物中的介质的说明和前述本发明的对象物的制造方法中的对象物的说明。作为具体例，在前述保存工序中，可以保存通过使包含前述生物材料的液体(例如，浸渍有前述生物材料的液体)与包含前述微小气泡的介质接触或混合而得到的混合物，或者还可以保存通过使前述生物材料与包含前述微小气泡的介质接触或混合而得到的混合物。前述保存工序中的保存方法例如可以利用单纯浸渍保存法、持续灌注保存法、气相保存法等公知的方法来实施。前述气相保存法例如可以参照日本特开2015-174823号公报。另外，在前述保存工序中，还可以通过利用包含前述微小气泡的介质持续地灌注前述生物材料来进行保存。

在前述保存工序中，保存前述生物材料的保存条件例如可以基于前述生物材料的种类和公知的保存条件来实施。作为具体例，前述介质为液体且常压(约1013hPa)时，前述生物材料的保存温度例如为0～37℃、4～37℃。前述保存期间例如为0～7天、为1～7天。在前述保存工序中，将作为前述生物材料的肾脏通过包含前述微小气泡的介质持续地灌注并保存时，前述介质的灌注速度例如为60bpm(每分钟节拍数，Beats Per Minute)。前述灌注时的压力的上限和下限例如分别为30mmHg和20mmHg、或者60mmHg和40mmHg。前述灌注时的血管阻力例如为0.25mmHg/ml/分钟(minute)以下。

本发明的第1保存方法中，前述微小气泡可以包含任意的气体作为气体。前述气体例如可以援用前述本发明的组合物中的气体(气体成分)的说明。前述微小气泡能够进一步抑制细胞保存时的细胞存活率的降低，能够以生物材料能发挥其功能的状态进行保存，因此优选包含CO和H

本发明的第1保存方法中，前述微小气泡的特性、气体的浓度、CO、H

本发明的第1保存方法例如能够进一步抑制再灌注保存后的生物材料时发生的对生物材料损伤，因此优选包括用包含前述微小气泡的液体灌注前述生物材料的灌注工序。前述灌注工序例如在前述保存工序之前加以实施。前述灌注工序中，使用前述液体的生物材料的灌注方法例如可以根据前述生物材料的种类，利用单纯灌注法、机械灌注法等公知的方法来实施。作为具体例，前述生物材料具有血管或淋巴管时，前述灌注工序例如通过将包含前述微小气泡的液体导入前述血管或淋巴管中来实施。前述灌注工序后，在前述保存工序中，如前所述，可以浸渍于包含前述微小气泡的液体中，来保存前述生物材料(单纯浸渍法)；还可以使用灌注装置等，利用包含前述微小气泡的液体对前述生物材料进行连续或非连续地灌注，由此进行保存(持续灌注法)；还可以在高压气体的存在下保存前述生物材料(气相保存法)。作为前述在高压气体的存在下进行保存的方法，例如可以参照日本特开2015-174823号公报的方法。前述液体例如可以援用前述本发明的组合物中的介质的说明和前述本发明的对象物的制造方法中的对象物的说明。

＜第2生物材料的保存方法＞

如前所述，本发明的生物材料的保存方法包括将微小气泡导入生物材料中的导入工序、及保存前述生物材料的保存工序。本发明的第2保存方法的特征在于将前述微小气泡导入生物材料中，其它工序和条件没有特别限制。根据本发明的第2保存方法，例如，能够抑制再灌注保存后的生物材料时发生的对生物材料的损伤。因此，根据本发明的第2保存方法，例如，能够以保存后生物材料也能够发挥其功能的状态进行保存。本发明的第2保存方法例如可以援用前述本发明的组合物、生物材料保存组合物、对象物的制造方法和第1保存方法的说明。

在前述导入工序中，将微小气泡导入前述生物材料中。具体而言，在前述导入工序中，例如，可以通过使前述生物材料与包含前述微小气泡的介质接触来实施。前述介质例如可以援用前述本发明的组合物中的介质的说明和前述本发明的对象物的制造方法中的对象物的说明。包含前述微小气泡的介质可以在前述生物材料的表面接触，可以在前述生物材料的内部接触，或在两者来接触。通过将微小气泡导入前述生物材料整体中，从而能够进一步抑制再灌注保存后的生物材料时发生的对生物材料损伤，因此优选在前述生物材料的内部接触。包含前述微小气泡的介质与前述生物材料的表面接触时，在前述导入工序中，例如，通过用包含前述微小气泡的介质清洗前述生物材料来实施。包含前述微小气泡的介质在前述生物材料的内部接触时，在前述导入工序中，例如，通过用包含前述微小气泡的液体灌注前述生物材料来实施。前述灌注例如可以援用前述本发明的第1保存方法中的灌注工序的说明，可以利用血管或淋巴管等循环系统来实施。另外，包含前述微小气泡的介质在前述生物材料的表面和内部接触时，在前述导入工序中，例如，可以通过将前述生物材料浸渍于包含前述微小气泡的介质中来实施。在前述介质中的浸渍时间例如为1分钟～6小时。浸渍于前述介质中时的温度例如为0～37℃、4～37℃。

前述导入工序可以对经分离的生物材料实施，或者还可以对分离前的生物材料实施。对前述分离后的生物材料实施前述导入工序时，通过使经分离的生物材料与包含前述微小气泡的介质接触来实施。对前述分离前的生物材料实施前述导入工序时，在前述导入工序中，通过在具有导入微小气泡的生物材料的动物中导入微小气泡来实施。具体而言，前述导入工序例如通过对前述动物给予包含微小气泡的介质来实施。对前述动物的给予路径例如可列举出局部给予、经肠给予、非经口给予等。前述局部给予例如可列举出皮肤上部给予、吸入给予、灌肠给予、滴眼给予、滴耳给予、经鼻给予、阴道内给予等。前述经肠给予例如可列举出经口给予、经管给予、灌肠给予等。前述非经口给予例如可列举出经静脉给予、经动脉给予、肌肉给予、心脏内给予、皮下给予、骨内给予、皮内给予、腹腔内给予、脊髓腔内给予、膀胱内给予、经皮给予、吸入给予等。

对分离前的生物材料实施前述导入工序时，本发明的第2保存方法例如优选进一步包括分离前述导入工序后的生物材料的分离工序。前述分离工序中，前述生物材料的分离方法例如可以根据前述生物材料的种类来适宜确定。

接着，在前述保存工序中，保存前述生物材料。前述生物材料的保存例如可以在前述微小气泡的存在下实施，还可以在没有前述微小气泡的存在下实施。在前述微小气泡的存在下实施前述保存工序时，前述保存工序例如可以与前述本发明的第1保存方法中的保存工序同样地加以实施。在没有前述微小气泡的存在下实施前述保存工序时，前述保存工序例如可以利用单纯浸渍保存法、持续灌注保存法、气相保存法等公知的保存方法来实施。前述气相保存法例如可以参照前述的日本特开2015-174823号公报。另外，在前述保存工序中，还可以通过利用包含前述微小气泡的介质持续地灌注前述生物材料来进行保存。

本发明的第2保存方法中，前述微小气泡的特性、气体的浓度、CO、H

本发明的第2保存方法例如在前述导入工序后还可以包括用液体灌注前述生物材料的灌注工序。前述液体例如为包含糖的液体，作为具体例，可列举出前述保存液等。前述液体还可以不包含前述微小气泡。

＜生物材料的生产方法＞

如前所述，本发明的生物材料的生产方法包括保存已生产的生物材料的材料保存工序，前述材料保存工序通过前述本发明的生物材料的保存方法来实施。本发明的生产方法的特征在于前述材料保存工序通过前述本发明的生物材料的保存方法来实施，其它工序和条件没有特别限制。根据本发明的生产方法，例如，能够生产再灌注保存后的生物材料时发生的对生物材料损伤得到抑制的生物材料。因此，根据本发明的生产方法，例如，能够生产以保存后生物材料也能发挥其功能的状态进行了保存的生物材料。本发明的保存方法例如可以援用前述本发明的组合物、生物材料保存组合物、对象物的制造方法和保存方法的说明。

如前所述，前述材料保存工序可以利用前述本发明的保存方法实施，可以援用其说明。前述本发明的保存方法可以是前述本发明的第1保存方法，还可以是前述本发明的第2保存方法。利用前述本发明的第1保存方法实施前述材料保存工序时，本发明的生产方法例如能够进一步抑制再灌注保存后的生物材料时发生的对生物材料损伤，因此优选包含将前述微小气泡导入生物材料中的导入工序。前述导入工序可以援用例如前述本发明的第2保存方法中的导入工序的说明。前述导入工序优选包括用包含前述微小气泡的液体灌注前述生物材料的灌注工序。前述灌注工序可以援用例如前述本发明的第1保存方法中的灌注工序的说明。

＜移植材料＞

如前所述，本发明的移植材料通过前述本发明的生物材料的生产方法而生产。本发明的移植材料的特征在于通过前述本发明的生物材料的生产方法而生产，其它构成和条件没有特别限制。本发明的移植材料例如能够抑制再灌注保存后的移植材料时发生的对移植材料的损伤。因此，根据本发明的移植材料，例如，在保存后移植材料也以能够发挥其功能的状态进行保存并且在移植后也良好地发挥作用。另外，根据本发明的移植材料，例如，能够缩短前述移植材料的预处理时间。本发明的移植材料例如可以援用前述本发明的组合物、生物材料保存组合物、对象物的制造方法、保存方法和生产方法的说明。

＜移植方法＞

如前所述，本发明的移植方法包括将前述本发明的移植材料移植到动物中的移植工序。本发明的移植方法的特征在于包括将前述本发明的移植材料移植到动物中的移植工序，其它工序和条件没有特别限制。本发明的移植方法中使用的移植材料例如能够抑制再灌注保存后的移植材料时发生的对移植材料的损伤。因此，本发明的移植方法中使用的移植材料例如以在保存后移植材料也能发挥其功能的状态进行保存。因此，根据本发明的移植方法，移植后的移植材料良好地发挥作用。另外，根据本发明的移植方法，例如，能够缩短前述移植材料的预处理时间。本发明的移植方法例如可以援用前述本发明的组合物、生物材料保存组合物、对象物的制造方法、保存方法、生产方法和移植材料的说明。

前述移植工序中，前述动物没有特别限制，例如可列举出人、除人外的非人动物等，前述非人动物例如为小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、猴、兔子、绵羊、马、猪等哺乳类动物、苍蝇等非哺乳类动物。前述移植工序中，前述动物的种类与前述保存后的移植材料的来源可以相同或不同。

进而在前述移植工序之前，本发明的移植方法还可以包括利用清洗液对前述移植材料进行清洗的清洗工序。在此情况下，前述移植工序可以是将前述清洗后的移植材料移植到前述动物中的工序。前述清洗工序是通过利用清洗液对前述保存后的移植材料进行清洗，从而降低例如前述保存后的移植材料中包含的保存液的量的工序。本发明的移植方法通过包括前述清洗工序，从而在例如移植前述移植材料时，能够进一步降低保存液对所移植的动物产生的副作用。

前述清洗液例如可列举出生理盐水、磷酸缓冲生理盐水、林格氏溶液等。

前述移植工序中，前述保存后的移植材料的移植方法没有特别限制，可以根据前述保存后的移植材料进行适宜确定。前述移植方法例如可以参照下述参考文献1。

参考文献1：“使用了脏器移植实验手册大鼠/小鼠的移植、缺血再灌注损伤模型”、株式会社秀潤社、主编：野泽真澄、编辑：田中弥生、1999年

＜微小气泡的密度改善剂＞

本发明的微小气泡的密度改善剂(以下也称为“改善剂”)包含表面活性剂作为有效成分。本发明的微小气泡的密度改善剂的特征在于包含表面活性剂作为有效成分，其它构成和特征没有特别限制。根据本发明的改善剂，在制造包含微小气泡的介质时，能够改善得到的产物中的微小气泡的密度。本发明的改善剂例如可以援用前述本发明的组合物、生物材料保存组合物和对象物的制造方法的说明。

本发明的改善剂的剂型没有特别限制，例如可列举出片剂、液体制剂、颗粒剂、散剂等。本发明的改善剂还可以包含除表面活性剂以外的成分。在此情况下，本发明的改善剂例如还可以称为微小气泡的密度改善组合物。

实施例

接着，对本发明的实施例进行说明。但是，本发明不受下述实施例限制。

[实施例1]

确认了：通过本发明的生物材料保存组合物，能够保存细胞。

(1)组合物的制造

使用图1所示的文丘里式的微小气泡的制造装置100来制造本发明的组合物。如图1所示，制造装置100具有以马达1为基准、以依次使连接管2a、文丘里管3a、连接管4a、4b、管2b、文丘里管3b和连接管4c彼此连通的方式连接而成的循环系统的流路。将形成于文丘里管3a的侧面的突出部的开口密封。另外，形成于文丘里管3b的侧面的突出部的开口以与三通旋塞5连通的方式连接。首先，将三通旋塞5开放，将DMEM培养基从三通旋塞5导入制造装置100内的流路中。此时，以前述流路内不包含气体的方式进行填充。另外，一并测定填充的DMEM培养基的液量。接着，对于一氧化碳(住友精化株式会社制、CO浓度：99.999(v/v)％)和医用氧气(住友精化株式会社制、O

(2)组合物的特性

对于由前述实施例1(1)得到的组合物，静置约2小时后，使用NanoSight(注册商标)NS300(Malvern Instrument公司制)，利用默认的参数测定了前述组合物的物性。需要说明的是，前述测定在25℃下进行。其结果是，前述组合物中的微小气泡的平均直径为114.8nm，微小气泡的密度为6.46×10

(3)细胞的保存

将大鼠心肌横纹肌细胞(H9c2细胞、从浜松医科大学获得)的细胞悬浮液以80％汇合/孔的方式接种于96孔板中后，培养1～2天。培养基的组成是在前述组合物添加10％FBS(胎牛血清)。另外，培养条件为37℃、5％CO

进行前述添加后，在4℃的条件下将前述孔板保存24小时。进而，在37℃、5％CO

图2是示出细胞的存活率的图。图2中，横轴表示微小气泡所包含的气体的种类和体积比(V

[实施例2]

确认了：通过本发明的生物材料保存组合物，能够保存血小板。

(1)组合物的制造

设为体积比(V

(2)组合物的特性

代替前述实施例1(1)的组合物，使用前述实施例2(1)的组合物，静置约2小时，除此以外与前述实施例1(2)同样地进行测定。其结果是，前述组合物中的微小气泡的平均直径为93.6nm，微小气泡的密度为6.87×10

(3)血小板的保存

由源自兔子的耳静脉的外周血制备血小板。具体而言，由兔子的耳静脉每1次采血8mL后，在得到的血液中加入3mL的抗凝剂(10％ACD-A液、3.13％柠檬酸钠)并缓慢振荡。接着，通过对振荡后的血液实施2次离心分离而分离了血小板。首先，在24℃的条件下依据PRP(Platelet Rich Plasma：富含血小板血浆)的制备方法以200×g实施10分钟的离心分离。接着，对于得到的PRP，在24℃的条件下以2000×g再次实施10分钟的离心分离，分离了血小板。在得到的血小板5×10

图3是示出血小板数的增减率的图。图3中，横轴表示保存天数，纵轴表示血小板数的增减率。如图3所示，对于任意的保存天数，实施例与比较例相比，血小板数显著增加，且血小板数不依赖于保存天数地为恒定的。由这些结果可知：通过本发明的生物材料保存组合物，能够保存血小板。另外，本发明的生物材料保存组合物能够保存血小板等细胞，因此启示出也能够保存由细胞构成的生物材料。

[实施例3]

确认了：通过本发明的生物材料保存组合物，能够保存肾脏。

(1)组合物的制造

设为体积比(V

(2)肾脏的制备

从死后经过30分钟或40分钟的大鼠摘取肾脏，通过将前述组合物L导入肾脏的血管中进行放血。进行前述放血后，浸渍于前述组合物UW中。在该状态下、以4℃将肾脏保存1小时或2小时。对于前述保存后的肾脏，使用前述组合物UW实施体外循环。此外，在体外循环开始后，在10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟或100分钟后测量从尿管得到的尿量(累计值)，由此评价了肾功能(实施例)。另外，比较例使用前述灌注保存液，除此以外同样地评价了肾功能。将这些结果示于图4。

图4是将死后经过40分钟的肾脏保存1小时后的肾脏的尿量的图。图4中，横轴表示体外循环开始后的时间，纵轴表示尿量。如图4所示，可知：对于任意的时间，实施例与比较例相比，尿量均增加。即，与比较例相比，实施例的肾功能得到了维持。另外，实施例与比较例的尿量差在体外循环开始后50分钟及之后变得特别显著。由这些结果可知：根据本发明的生物材料保存组合物，能够抑制再灌注时的肾脏损伤，由此，在移植后能够恢复肾功能。需要说明的是，将死后经过30分钟的肾脏以4℃保存2小时的情况也是同样的。另外，由这些结果可知：通过本发明的生物材料保存组合物，能够保存肾脏、即能够保存细胞片的层叠体那样的复杂的结构物。

[实施例4]

确认了：通过本发明的生物材料保存组合物，能够保存细胞。

(1)组合物的制造

代替一氧化碳和医用氧气而使用硫化氢(住友精化株式会社制)和医用氧气，设为体积比(V

(2)组合物的特性

代替前述实施例1(1)的组合物，使用前述实施例4(1)的组合物，除此以外与前述实施例1(2)同样地进行测定。其结果是，前述组合物中的微小气泡的平均直径为115.8nm，微小气泡的密度为8.32×10

(3)细胞的保存

代替前述实施例1(1)的组合物，使用前述实施例4(1)的组合物，除此以外与前述实施例1(3)同样地测定吸光度，由此研究了细胞的存活率。对照使用含10％FCS的DMEM培养基，除此以外同样地进行测定。将这些结果示于图5。

图5是示出细胞的存活率的图。图5中，横轴表示样品的种类，纵轴表示吸光度。如图5所示，与对照相比，包含含有H

[实施例5]

确认了：通过本发明的生物材料保存组合物，能够保存肺。

(1)组合物的制造

设为体积比(V

(2)肺的制备

从生物体的大鼠或由氯化钾致死后经过40分钟或2小时的大鼠摘取肺，将前述组合物L导入肺的血管，由此进行放血。进行前述放血后，成为浸渍于前述组合物UW中的状态。在该状态下，以4℃将肺保存24小时。进行前述保存后，测定肺的重量，由此评价了能否保存脏器(实施例)。对照1摘取后未保存，除此以外同样地进行，对照2代替前述组合物L和组合物UW而使用前述Lactec和UW液，除此以外同样地进行评价。将这些结果示于图6。

图6是示出保存后的肺的重量的图。图6中，(A)表示从生物体的大鼠摘取的肺的结果，(B)表示牺牲后经过2小时的源自大鼠的肺的结果。另外，图6中，横轴表示样品的种类，纵轴表示肺的重量。如图6所示，对照2中，肺的重量增加，而实施例中，肺重量的增加得到抑制，与对照1为相同程度。由这些结果可知：根据本发明的组合物或细胞保存组合物，能够防止保存时的肺的重量增加、即肺的浮肿。需要说明的是，使用源自牺牲后40分钟的大鼠的肺的情况也是同样的。由这些结果可知：通过本发明的生物材料保存组合物，能够保存肺、即能够保存细胞片的层叠体那样的复杂的结构物。

[实施例6]

确认了：通过本发明的生物材料保存组合物，能够保存细胞。

(1)组合物的制造

代替一氧化碳和医用氧气而使用空气(住友精化株式会社制)，代替前述DMEM培养基而使用HUVEC用培养基，除此以外与前述实施例1(1)同样地制造了组合物。HUVEC用培养基使用内皮细胞基础培养基2(EGM2：Endothelial Cell Basal Medium 2)。

(2)组合物的特性

代替前述实施例1(1)的组合物，使用前述实施例6(1)的组合物，除此以外与前述实施例1(2)同样地进行测定。其结果是，前述组合物中的微小气泡的平均直径为126.2nm，微小气泡的密度为6.84×10

(3)细胞的保存

将人血管内皮细胞(HUVEC细胞、从Promo Cell公司获得)悬浮于前述组合物中，将得到的细胞悬浮液以80％汇合/孔的方式接种于96孔板中。此外，在下述条件1或2进行培养。进行前述培养后，对于各细胞，使用前述MTT法试剂盒，并依据附带的手册测定各孔的吸光度，由此研究了细胞的存活率。对照使用前述HUVEC用培养基，除此以外同样地进行研究。此外，将对照的存活率作为100％，计算出存活率的相对值。将这些结果示于图7。

条件1：

在组合物(微小气泡的密度：6.84×10

条件2：

在HUVEC用培养基的存在下、以0.5～1％O

图7是示出细胞的存活率的图。图7中，(A)表示前述条件1的结果，(B)表示前述条件2的结果。另外，图7中，横轴表示样品的种类，纵轴表示存活率的相对值。如图7所示，以任意的条件在包含微小气泡的组合物的存在下进行保存(培养)的情况，与在对照的存在下进行保存(培养)的情况相比，细胞的存活率均得到改善。由这些结果可知：通过本发明的生物材料保存组合物，能够保存细胞。另外，本发明的生物材料保存组合物能够保存细胞，因此启示出也能够保存由细胞构成的生物材料。

[实施例7]

确认了：通过本发明的生物材料保存组合物，能够保存细胞。

(1)组合物的制造

代替前述DMEM培养基而使用前述HUVEC用培养基，除此以外与前述实施例1(1)同样地制造了不同的体积比(V

(2)组合物的特性

代替前述实施例1(1)的组合物，使用前述实施例7(1)的组合物，除此以外与前述实施例1(2)同样地进行测定。其结果是，前述组合物中的微小气泡的平均直径为132.3nm，微小气泡的密度为8.89×10

(3)细胞的保存

将人血管内皮细胞悬浮于HUVEC用培养基中，将得到的细胞悬浮液接种于96孔板中。此外，培养至达到汇合后，进而，以下述条件3或4进行培养。进行前述培养后，对于各细胞，使用前述MTT法试剂盒，并依据附带的手册，测定了各孔的吸光度。对照未添加前述组合物，除此以外同样地进行测定。将这些结果示于图8和9。

条件3：

在组合物(微小气泡的密度：8.89×10

条件4：

在HUVEC用培养基的存在下、以0.5～1％O

图8是示出前述条件3中的细胞的存活率的图。图8中，横轴表示微小气泡所包含的气体的种类和体积比(V

接着，图9是示出前述条件4中的细胞的存活率的图。图9中，横轴表示微小气泡所包含的气体的种类和体积比(V

由这些结果可知：通过本发明的生物材料保存组合物，能够保存细胞。另外，本发明的生物材料保存组合物能够保存细胞，因此启示出也能够保存由细胞构成的生物材料。

[实施例8]

通过气泡密度不同的生物材料保存组合物，能够保存细胞。

(1)组合物的制造

代替前述DMEM培养基而使用HUVEC用培养基，除此以外与前述实施例1(1)同样地制造了体积比(V

(2)组合物的特性

代替前述实施例1(1)的组合物，使用前述实施例8(1)的组合物，除此以外与前述实施例1(2)同样地进行测定。其结果是，各组合物中的微小气泡的平均直径和微小气泡的密度为如下述。

组合物(CO/O

组合物(空气)平均直径：126.2nm、密度：6.84×10

组合物(H

(3)细胞的保存

将前述大鼠心肌横纹肌细胞(H9c2细胞)或前述人血管内皮细胞(HUVEC细胞)的细胞悬浮液以80％汇合/孔的方式接种于96孔板中后，以下述条件5～9进行培养。在各条件的组合物添加培养基中，以各组合物稀释为规定倍率(1倍(未稀释)、1/2倍、1/5倍、1/10倍、1/50倍、1/100倍或1/1000倍)的方式添加前述组合物。进行前述培养后，对于各细胞，使用前述MTT法试剂盒，并依据附带的手册测定各孔的吸光度，由此研究了细胞的存活率。对照未添加前述组合物，除此以外同样地进行研究。此外，将对照的存活率作为100％，计算出存活率的相对值。将这些结果示于图10～14。

条件5(H9c2细胞)：

在未添加组合物的培养基的存在下、以0.5～1％O

条件6(H9c2细胞)：

在添加组合物(空气)后的培养基的存在下、以0.5～1％O

条件7(H9c2细胞)：

在未添加组合物的培养基的存在下、以0.5～1％O

条件8(HUVEC细胞)：

在未添加组合物的培养基的存在下、以0.5～1％O

条件9(HUVEC细胞)：

在未添加组合物的培养基的存在下、以0.5～1％O

图10是示出前述条件5中的细胞的存活率的图。图10中，横轴表示前述组合物的稀释系列，纵轴表示存活率的相对值。如图10所示，与对照相比，前述组合物的浓度(微小气泡的密度)依赖性地提高了细胞的存活率。

图11是示出前述条件6中的细胞的存活率的图。图11中，横轴表示前述组合物的稀释系列，纵轴表示存活率的相对值。如图11所示，与对照相比，前述组合物的浓度(微小气泡的密度)依赖性地提高了细胞的存活率。

图12是示出前述条件7中的细胞的存活率的图。图12中，横轴表示前述组合物的稀释系列，纵轴表示存活率的相对值。如图12所示，与对照相比，前述组合物的浓度(微小气泡的密度)依赖性地提高了细胞的存活率。

图13是示出前述条件8中的细胞的存活率的图。图13中，横轴表示前述组合物的稀释系列，纵轴表示存活率的相对值。如图13所示，与对照相比，前述组合物的浓度(微小气泡的密度)依赖性地提高了细胞的存活率。

图14是示出前述条件9中的细胞的存活率的图。图14中，横轴表示前述组合物的稀释系列，纵轴表示存活率的相对值。如图14所示，与对照相比，前述组合物的浓度(微小气泡的密度)依赖性地提高了细胞的存活率。

由以上的结果可知：通过气泡密度不同的生物材料保存组合物，能够保存细胞，通过气泡密度不同的生物材料保存组合物，能够抑制细胞培养时的细胞存活率的降低。另外，微小气泡的密度依赖性地细胞保存效果增强，而不依赖于包含微小气泡的气体的种类，因此前述微小气泡还具有细胞保存效果和生物材料保存效果。进而，可知：基于各组合物的微小气泡的含量，通过将微小气泡的密度设定为5×10

[实施例9]

确认了：通过本发明的生物材料保存组合物，能够保存心脏。

(1)组合物的制造

设为体积比(V

(2)组合物的特性

使用与前述ETK类似的生理盐水制造前述组合物时，得到的组合物中的微小气泡的平均直径为131nm，微小气泡的密度为8.04×10

(3)心脏的制备

向6周龄的LEW/SsN Slc雄大鼠(n＝5)以成为50mg/kg(药剂/体重)的方式给予戊巴比妥(共立制药株式会社制)，进行深度麻醉。接着，从前述大鼠摘取心脏。进而，切开前述心脏的大动脉和肺动脉后，注入前述组合物并去除血液，制备了心脏。

(4)心脏的保存

心脏的保存使用日本特开2015-174823号公报的保存装置来实施。具体而言，在日本特开2015-174823号公报的图2的保存装置内配置装有蒸馏水的烧瓶。进而，在前述烧瓶内配置生物体材料吊挂装置，将前述心脏吊挂在前述生物体材料吊挂装置上。然后，通过医用气体供给单元，以前述保存室内的一氧化碳的分压(PCO)为0.15MPa、氧气的分压(PO

进行前述保存后，将前述心脏移植至大鼠中，确认了前述心脏的大小和搏动。对照1代替前述组合物而使用不包含微小气泡的ETK进行灌注，除此以外同样地实施。另外，对照2代替前述组合物而使用溶解有CO和O

图15是示出移植后的心脏的照片，图15的左上所示的图是示出前述保存装置中的保存状态的示意图。图15中，(A)示出对照1的结果，(B)示出使用前述组合物的结果，(C)示出对照2的结果。如图15所示，使用前述组合物对心脏进行灌注、保存时，与对照1和2相比，由心脏的淤血所致的肿胀或浮肿得到抑制，维持保存前的心脏大小。另外，对照1中，未能确认心脏的搏动，对照2中，几乎未能确认心脏的搏动。相对于此，使用前述组合物对心脏进行灌注、保存时，能够确认前述心脏的搏动。由这些结果可知：通过本发明的生物材料保存组合物，能够保存心脏。

[实施例10]

确认了：能够不依赖于气体的种类地制造包含同等程度的密度的微小气泡的组合物。

(1)组合物的制造

除了一氧化碳和医用氧气之外，使用二氧化碳(住友精化株式会社制)和氮气(住友精化株式会社制)，代替前述DMEM培养基而使用生理盐水，除此以外与前述实施例1(1)同样地制造包含微小气泡的组合物，所述微小气泡含有氧气、一氧化碳、氧气与一氧化碳的混合气体、二氧化碳或氮气作为气体。需要说明的是，除气体以外的制造条件完全相同。

(2)组合物的特性

代替前述实施例1(1)的组合物，使用前述实施例10(1)的组合物，除此以外与前述实施例1(2)同样地进行测定。需要说明的是，对各组合物实施3次同样的测定。其结果是，前述组合物中的包含各气体的微小气泡的平均直径如下所述。将各气体的微小气泡的密度示于图16。

组合物(O

组合物(CO) 平均直径：117.0nm

组合物(CO/O

组合物(CO

组合物(N

图16是示出包含各气体的微小气泡的密度的图。图16中，横轴表示微小气泡所包含的气体的种类，纵轴表示微小气泡的密度。如图16所示，在相同条件下进行制造时，不依赖于导入微小气泡中的气体的种类，微小气泡的密度为约1×10

[实施例11]

确认了：通过用本发明的生物材料保存组合物对生物材料进行预处理，从而能够保存生物材料。

(1)组合物的制造

代替前述DMEM培养基而使用前述生理盐水，除此以外与前述实施例1(1)同样地制造了不同的体积比(V

(2)组合物的特性

代替前述实施例1(1)的组合物，使用前述实施例11(1)的组合物，除此以外与前述实施例1(2)同样地进行测定。其结果是，前述组合物中的微小气泡的平均直径为约100nm，微小气泡的密度为约1×10

(3)心脏的预处理

向6周龄的LEW/SsN Slc雄大鼠(n＝6)给予戊巴比妥(共立制药株式会社制)以成为50mg/kg(药剂/体重)，进行深度麻醉。接着，从前述大鼠摘取心脏。进而，切开前述心脏的大动脉和肺动脉并摘取。

(4)心脏的保存

接着，在得到的心脏中注入前述组合物并去除血液，对心脏进行预处理。进行前述预处理后，在前述心脏中注入UW液并进行灌注。此外，将前述心脏浸渍于UW液中，在4℃的冰箱内保存24小时。

进行前述保存后，将前述心脏移植至大鼠中，确认了前述搏动。基于是否在心室和心房这两者中产生了搏动或仅在心室产生了搏动而评价了前述搏动。具体而言，在心脏的心室和心房这两者产生搏动时，评价为心脏的功能得到了维持，仅在心脏的心室产生搏动时，评价为心脏的功能未得到维持。对照代替前述组合物而使用不包含微小气泡的生理盐水进行灌注，除此以外同样地实施。将这些结果示于图17。

图17是示出保存后的心脏的评价结果的图。图17中，横轴表示样品的种类，纵轴表示样品数量。如图17所示，通过本发明的组合物进行预处理的实施例的心脏中，6例中有4例维持了心脏的功能，而对照的心脏中，6例中仅1例在保存后维持了心脏的功能。需要说明的是，虽未图示，但实施例的心脏为鲜红色，启示出心脏内的血液循环良好，而对照的心脏为深褐色，心脏内的血液循环差，启示出还原型血红蛋白储存于心肌之间。由这些结果可知：通过用本发明的生物材料保存组合物对生物材料进行预处理，从而能够保存生物材料。

[实施例12]

确认了：在表面活性剂存在下制造微小气泡，由此能够改善溶剂中的微小气泡的密度。

使用以成为10mmol/L的方式添加了作为阳离子性表面活性剂的二甲基二(十八烷基)氯化铵(FUJIFILM Corporation和光纯药株式会社制)的蒸馏水和图18的制造装置200，制造了本发明的组合物。如图18所示，制造装置200具备：2个注射器20a、b(10mL注射器)和文丘里式的三通旋塞21(具有狭窄部的三通旋塞)。2个注射器20a、b的顶端部与三通旋塞21嵌合。首先，由三通旋塞21解除注射器20a、b。接着，在注射器20a的内部以注射器20a内不含空气的方式导入含有前述阳离子性表面活性剂的蒸馏水5mL，再次与三通旋塞21嵌合。进行前述嵌合后，将注射器20a内的蒸馏水导入三通旋塞21中，挤出至三通旋塞21的注射器20b的嵌合口。另一方面，向注射器20b中以相对于导入注射器20a中的蒸馏水5mL约为5mL的方式导入空气，再次与三通旋塞21嵌合。然后，在注射器20a、b内使活塞往复10次(约2秒/1次往复)，进而对注射器21a、b进行5～10秒的超声波处理(60W)。通过进一步实施2次同样的处理，从而制造了组合物(实施例12-1)。另外，未添加前述阳离子性表面活性剂，除此以外同样地制造了组合物(实施例12-2)。进而，代替前述二甲基二(十八烷基)氯化铵，以成为100mmol/L的方式添加作为阴离子系表面活性剂的月桂基硫酸钠(SDS、和光纯药株式会社制)或者以成为10mmol/L的方式添加作为非离子系表面活性剂的聚(氧亚乙基)辛基苯基醚(Triton X-100、和光纯药株式会社制)，除此以外同样地制造了组合物(SDS：实施例12-3、Triton X-100：实施例12-4)。此外，对于得到的各组合物，与前述实施例1(2)同样地测定了前述组合物的物性。需要说明的是，前述测定在25℃下进行。其结果是，实施例12-1的组合物中的微小气泡的平均直径为222.1nm，微小气泡的密度为1.79×10

[参考例1]

实施例1～12的组合物中，确认了实质上不存在未形成微小气泡的气体。

使用图1所示的文丘里式的微小气泡的制造装置100，制造了参考例1中使用的组合物。首先，在图1的装置100内导入40mL的超纯水(Milli-Q水)后，振荡装置100，由此将装置100内的气泡排出至装置100外。接着，将5mL的前述一氧化碳采取至注射器后，与三通旋塞5连接。然后，在马达1的驱动开始后，使三通旋塞5开放，将一氧化碳导入装置100内。在该状态下，使马达1驱动5分钟、10分钟或30分钟，制造了组合物。停止马达1的驱动后，将得到的组合物回收至烧杯中。回收时的组合物的温度为27℃(5分钟循环)、29～30℃(10分钟循环)、38～39℃(30分钟循环)。将前述组合物静置30分钟，使大的气泡脱气。

对于脱气后的组合物，进而，静置规定时间(0小时、1小时、2小时或3小时)，在下述GC(气相色谱)的测定条件下测定静置后的组合物中包含的一氧化碳的量。一氧化碳通过使一氧化碳甲烷化后，测定得到的甲烷来进行测定。另外，代替一氧化碳而使用硫化氢，使马达1驱动5分钟，将脱气后的组合物静置规定时间(0小时、1小时、2小时、3小时或19小时)后，在下述GC的测定条件下进行测定，测定了前述组合物中包含的硫化氢的量。需要说明的是，对于经过规定时间后的各组合物，使用激光棒确认了含有微小气泡。将一氧化碳的测定结果示于下述表1，将硫化氢的结果示于下述表2。

(GC条件(一氧化碳))

装置：GC-2014FID(株式会社岛津制作所制)

填充剂的种类：MS-13X(Molecular Sieve 13X)(GL Sciences Inc.制)

柱的种类：岛津GC用不锈钢柱(内径3mm、长度3m、株式会社岛津制作所制)

温度

气化器：220℃

柱：50℃

检测器：250℃

载气

N

流量：20mL/分钟

甲烷转化器(Methanizer)：400℃

(GC条件(硫化氢))

装置：GC-2014FPD(株式会社岛津制作所制)

柱的种类：5rings Shimalite(注册商标)TPA(聚苯基醚(5rings)OS-124/Shimalite TPA)

(内径3.2mm、长度3.1m、信和化工株式会社制)

温度

气化器：200℃

柱

开始温度：50℃

在开始温度下的保持时间：3分钟

升温速度：50℃/分钟

结束温度：100℃

在结束温度下的保持时间：5分钟

检测器：250℃

载气

N

流量：20mL/分钟

[表1]

单位：μmol/L

(*)：低于检测界限

N.D.：未检测出

[表2]

单位：μmol/L

(*)：低于检测界限

-：未测定

如前述表1所示，对于前述组合物中的一氧化碳，在静置后迅速脱气，在1小时后之后几乎成为小于检测极限的量。另外，如前述表2所示，对于前述组合物中的硫化氢，在静置后迅速脱气，2小时后之后变为几乎小于检测极限的量。

由这些结果可知：实施例1～12的组合物在制造后静置约2小时而使用，因此实质上不存在除微小气泡以外的气体、即实质上不存在溶解气体。另外，由于不存在溶解气体，因此确认了各实施例中得到证实的细胞保存效果或生物材料保存效果等是通过本发明的组合物中包含的微小气泡的作用而得到的。

[参考例2]

实施例1～12的组合物中，确认了在使用时存在微小气泡。

代替40mL的超纯水而使用50mL的生理盐水，代替5mL的CO而使用10mL的CO，除此以外与参考例1同样地制造了参考例2中使用的组合物。将得到的组合物静置30分钟，使大的气泡脱气后，进而，静置规定时间(0小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时)，与前述实施例1(2)同样地测定静置后的组合物中包含的微小气泡的密度和平均直径(参考例2-1)。进而实施2次同样的组合物的制造和测定(参考例2-2和2-3)。将这些结果示于下述表3。

[表3]

-：未测定

如前述表3所示，静置后1～2小时中，参考例2-1～2-3中任意的组合物中均包含约1×10

[参考例3]

包含N

代替一氧化碳而使用医用N

对于脱气后的组合物，进而，静置规定时间(0或1小时)，在下述GC(气相色谱)的测定条件下测定静置后的组合物中包含的N

(GC条件(N

装置：GC-2014TCD(株式会社岛津制作所制)

填充剂的种类：Porapak(注册商标)Q(GL Sciences Inc.制)

柱的种类：岛津GC用不锈钢柱(内径3mm、长度2m、株式会社岛津制作所制)

温度

气化器：150℃

柱：40℃

检测器：100℃

载气

He(氦气)

流量：30mL/分钟

[表4]

单位:μmol/L

N.D.:未检测出

如前述表4所示，前述组合物中的N

以上参照实施方式对本发明进行了说明，但本发明不限定于上述实施方式。本发明的构成、详细而言，可以在本发明的范围内进行本领域技术人员能理解的各种变更。

该申请主张以2018年5月31日申请的日本申请特愿2018-105405和2018年12月3日申请的日本申请特愿2018-226902为基础的优先权，其公开内容全部引入其中。

＜附录＞

上述的实施方式和实施例的一部分或全部如以下的附录那样记载，但不限定于以下内容。

(附录1)

一种生物材料保存组合物，其包含微小气泡。

(附录2)

根据附录1所述的生物材料保存组合物，其中，前述微小气泡包含选自由氢气(H

(附录3)

根据附录1或2所述的生物材料保存组合物，其中，前述微小气泡包含生物气作为气体。

(附录4)

根据附录1～3中任一项所述的生物材料保存组合物，其中，前述微小气泡包含一氧化碳(CO)和硫化氢(H

(附录5)

根据附录4所述的生物材料保存组合物，其中，前述微小气泡包含氧气作为气体。

(附录6)

根据附录1～5中任一项所述的生物材料保存组合物，其中，前述微小气泡的密度为5×10

(附录7)

根据附录1～6中任一项所述的生物材料保存组合物，其还包含介质，

前述介质为液体和固体中的至少一者。

(附录8)

一种生物材料的保存方法，其包括在微小气泡的存在下保存生物材料的保存工序。

(附录9)

根据附录8所述的保存方法，其中，前述微小气泡包含附录1～7中任一项所述的生物材料保存组合物中的微小气泡。

(附录10)

根据附录8或9所述的保存方法，其包括将前述生物材料用包含前述微小气泡的液体进行灌注的灌注工序。

(附录11)

根据附录8～10中任一项所述的保存方法，其中，前述生物材料包含生物体的一部分或脏器中的至少一者。

(附录12)

根据附录11所述的保存方法，其中，前述生物体的一部分包含选自由四肢、手指、面部、骨骼、肌肉、发根、牙齿和牙周韧带组成的组中的至少1种。

(附录13)

根据附录11所述的保存方法，其中，前述脏器包含选自由眼球、角膜、肺、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、胆囊、食道、胃、小肠、大肠、精巢、卵巢、中枢神经、外周神经、血管和皮肤组成的组中的至少1种。

(附录14)

一种生物材料的保存方法，其包括：

将微小气泡导入生物材料中的导入工序、及

保存前述生物材料的保存工序。

(附录15)

根据附录14所述的生物材料的保存方法，其中，前述微小气泡包含附录1～7中任一项所述的生物材料保存组合物中的微小气泡。

(附录16)

根据附录14或15所述的生物材料的保存方法，其中，在前述保存工序中，在微小气泡的存在下保存生物材料。

(附录17)

根据附录16所述的生物材料的保存方法，其中，前述微小气泡包含附录1～7中任一项所述的生物材料保存组合物中的微小气泡。

(附录18)

根据附录14～17中任一项所述的保存方法，其中，前述生物材料包含生物体的一部分或脏器中的至少一者。

(附录19)

根据附录18所述的保存方法，其中，前述生物体的一部分包含选自由四肢、手指、面部、骨骼、肌肉、发根、牙齿和牙周韧带组成的组中的至少1种。

(附录20)

根据附录18所述的保存方法，其中，前述脏器包含选自由眼球、角膜、肺、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、胆囊、食道、胃、小肠、大肠、精巢、卵巢、中枢神经、外周神经、血管和皮肤组成的组中的至少1种。

(附录21)

一种生物材料的生产方法，其包括保存已生产的生物材料的材料保存工序，

前述材料保存工序通过附录8～20中任一项所述的生物材料的保存方法来实施。

(附录22)

一种移植材料，其通过附录21所述的生物材料的生产方法而生产。

(附录23)

一种移植方法，其包括将附录22所述的移植材料移植到动物中的移植工序。

(附录24)

一种微小气泡的密度改善剂，其包含表面活性剂作为有效成分。

如以上说明所述，根据本发明，能够保存生物材料。本发明例如能够抑制再灌注保存后的生物材料时发生的对生物材料的损伤。因此，本发明例如在对生物材料进行保存或移植的生命科学领域、医疗领域、医药领域等中是极其有用的。