一种纳米炭混悬注射液的制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种纳米炭混悬注射液，每1000mL纳米炭混悬注射液中，包括：纳米炭20～100g，助悬剂17～30g，pH调节剂2～4g，氯化钠8～10g，余量为注射用水；并具体公开了其制备方法，本发明采用泊洛沙姆作为助悬剂，克服了现有技术助悬剂有溶血性风险、现有方法工艺复杂以及产品稳定性差的缺陷，并且进一步规范了纳米炭原料的使用以及前处理步骤，获得了热源低、稳定性好的纳米炭注射液，利于工业化生产。

说明书

技术领域

本发明属于医学示踪诊断试剂领域，具体涉及一种纳米炭混悬注射液的制备方法和应用。

背景技术

淋巴结转移是实体癌特别是宫颈癌、甲状腺癌、胃癌等癌术后复发的重要原因，因此彻底进淋巴结清扫尤为重要，有助于延长术后生存期。实体癌即使在发病早期，也有10％～25％的患者存在局部淋巴结转移。可是，淋巴结通常隐匿在脂肪组织中，与大血管伴行，在血染术野中彻底清除这些引流的淋巴结，常常是非常困难的。而且器官的上部和下部的淋巴引流也不相同，因此，清扫淋巴结的范围与癌灶的部位有关，如果为了彻底清除淋巴结，将不必要清扫的淋巴结也包括在内，导致手术创损过大，手术后患者生存质量明显下降。因此，如能在手术中使用活体淋巴结染色示踪，帮助医生彻底清除淋巴结，是提高恶性肿瘤治疗效果的关键。临床上常使用示踪剂追踪发生转移的病灶。第三代示踪剂以纳米碳混悬溶液为代表，是目前效果最优的示踪剂，能进入淋巴系统并且被巨噬细胞吞噬后聚集于淋巴结中，使得淋巴结呈现黑色染色。相关的研究表明，肿瘤的体积约小，纳米碳混悬注射液示踪前哨淋巴结的可行性和安全性就越高。

目前，临床上已经有不少成功的经验，例如张亚

纳米炭混悬注射液中的纳米炭为粒径在纳米范围内的超微炭颗粒，而淋巴系统具有吞噬微小异物的特性，将纳米炭混悬注射液注射到局部组织后，巨噬细胞迅速吞噬这些超微炭颗粒，进入引流淋巴管和淋巴结，使其滞留大量的超微炭颗粒而染成黑色，从而实现了肿瘤区域淋巴结的活体染色，起到淋巴示踪的作用。另外，纳米炭有较强的吸附能力，能可逆吸附氨甲喋啉、丝裂霉素和平阳霉素等化疗药物，因此具有作为淋巴化疗定向载体的潜能。中国发明专利CN1181134C《一种纳米炭混悬组合物的制备方法》公开了一种用于示踪恶性肿瘤的区域引流淋巴结的纳米炭混悬液的制备方法。其技术方案的特点是：由于纳米炭表面结构为疏水性质，不能直接在水溶液中分散形成纳米炭混悬液，因此必须加入分散助悬辅料，在高剪切力研磨分散设备的机械作用下，才能形成纳米炭混悬液。纳米炭混悬液注射到局部组织后，能够选择性进入局部组织的引流淋巴结，将这些淋巴结染黑，帮助医生肉眼辨别淋巴结，达到淋巴示踪的效果，从而有利于清扫这些淋巴结。但是，其中的分散助悬辅料导致混悬液的稠度变大，有碍于进一步提高淋巴示踪速度，而且，根据美国FDA的资料，作为分散助悬辅料的聚乙烯吡咯烷酮如果进入血液，可能影响凝血功能。

发明内容

为克服现有技术缺陷，本发明采用了以下技术方案：

本发明一方面提供了一种纳米炭混悬注射液，每1000mL纳米炭混悬注射液中，包括：纳米炭20～100g，助悬剂17～30g，pH调节剂2～4g，氯化钠8～10g，余量为注射用水；

进一步的，所述纳米炭混悬注射液，包括：纳米炭50g，助悬剂20g，pH调节剂3g，氯化钠9g，余量为注射用水；

进一步的，所述纳米炭为纳米炭颗粒、石墨烯中的任意一种；优选的，所述纳米炭为纳米炭颗粒；进一步优选的，所述纳米炭为炭黑；

进一步优选的，所述纳米炭的粒径为100nm～220nm；优选的，所述纳米炭的粒径为160～180nm；

进一步的，所述助悬剂为泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷酮C30(PVP C30)、吐温-80中的任一种；优选的，所述助悬剂为泊洛沙姆；更优选泊洛沙姆188；

进一步的，所述pH调节剂为枸橼酸钠、醋酸钠、硼酸钠、磷酸钠、碳酸氢钠中的任一种；优选的，所述pH调节剂为枸橼酸钠；

本发明的第二方面提供了一种上述任一种纳米炭混悬注射液的制备方法，包括以下步骤：

S1纳米炭的前处理：将纳米炭经过乙酸乙酯脱脂后先采用酸洗涤，然后用水洗涤纳米炭近中性，然后再采用碱洗涤，然后用水洗涤纳米炭近中性，即得；

S2：按照上述配方用量称取各原辅料，然后取上述配方量90％v/v的注射用水，加入称取的氯化钠搅拌至完全溶解获得盐溶液；

S3：向S2获得的盐溶液中加入称取的枸橼酸钠和泊洛沙姆搅拌至完全溶解获得辅料液；

S4：向S3获得的辅料液中加入称取的纳米炭并搅拌均匀然后加入余量注射用水定容获得定容液；

S5：然后将S4获得的定容液以转速15000～20000rpm匀浆3～10min，然后以15000～30000psi压力均质1～5次后，再灌装、轧盖，然后在115～130℃下蒸汽灭菌10～30min，即得；

进一步的，步骤S1所述的纳米炭质量：乙酸乙酯体积为1g:5～12/ml；

进一步的，步骤S1所述的酸为HNO

更进一步的，所述HNO

更进一步的，步骤S1所述的纳米炭质量：酸体积为1g:3～5/ml，优选的，步骤S1所述的纳米炭质量：酸体积为1g:4/ml；

更进一步的，步骤S1所述的纳米炭质量：碱体积为1g:3～5/ml；优选的，步骤S1所述的纳米炭质量：碱体积为1g:4/ml；

进一步的，S5所述的匀浆转速为18000rpm，匀浆时间为5min；

进一步的，S5所述的均质压力20000psi，均质次数为3次；

进一步的，S5所述的灭菌温度为121℃，灭菌时间为15min。

有益效果

1.由于炭黑为化工产品，所含的灰份和重金属与注射剂原料药的要求存在一定差距，并且纳米炭由于生产原料和生产方法的影响，残留有微量脂溶性物质，故为达到药用要求，本发明采用一系列前处理手段，提高了纳米炭的纯度，使其符合注射剂原料药要求；

2.本发明采用泊洛沙姆作为助悬剂，避免了聚乙烯吡咯烷酮进入血液后导致的溶血现象，克服了现有技术中需要使用振动磨分散原辅料，以及制备成注射液后最终产品粒径稳定，货架期延长；并且可以采用目前常规的湿热灭菌工艺，且灭菌后不影响粒径和稳定性，即极大地降低了制备工艺的复杂性并降低了成本，利于工业化生产。

具体实施方式

在一个具体的实施方式中，本发明采用的纳米炭颗粒为日本三菱化学株式会社生产的精细化工产品40号炭黑、MA100号炭黑或MA77号炭黑；

在一个具体的实施方式中，本发明采用的泊洛沙姆为泊洛沙姆188。

在一个具体的实施方式中，本发明采用的纳米炭混悬注射液的制备方法中，所述S1纳米炭的前处理具体包括：

S11：依次以纳米炭质量：乙酸乙酯体积1g:5mL、1g:1mL、1g:4mL以及1g:1mL的投料量加入乙酸乙酯脱脂4次，干燥后得纳米炭粗品；

S12：以纳米炭粗品质量：10％v/vHNO

S13：以纳米炭粗品质量：0.1mol/L NaOH水溶液体积为1g:4mL加入0.1mol/L NaOH水溶液洗涤一次，然后继续以纳米炭粗品质量：纯化水体积1g：4mL加入水冲洗6次，得碱洗纳米炭，干燥后即得；

实施例1～7

1.1实施例1～7的组成(每1000mL纳米炭混悬注射液)

实施例1：制备方法包括以下步骤：

S1纳米炭的前处理：S11：500mL反应瓶中加入90.0g 40号炭黑、450mL乙酸乙酯以及大磁子，搅拌水浴加热至乙酸乙酯回流，保温搅拌1小时，趁热抽滤；滤饼用常温乙酸乙酯90mL洗涤，抽滤得滤饼；滤饼再次转入500mL反应瓶中，加入360mL乙酸乙酯和大磁子，搅拌水浴加热至乙酸乙酯回流，水浴保温搅拌1小时，趁热抽滤；滤饼用常温乙酸乙酯90mL洗涤，抽滤得到滤饼；滤饼在85℃下真空干燥2小时，得炭黑粗品88.6g；S12：称取73.0g粗品炭黑，加入300mL10％v/v硝酸水溶液和磁子，在室温下搅拌打浆2小时抽滤，滤饼用纯化水300mL室温搅拌打浆6次，最后抽滤滤液pH为6～7后停止洗涤得酸洗炭黑；S13：将酸洗炭黑转入烧杯中，加入300mL0.1mol/L氢氧化钠和磁子，在室温下搅拌打浆1小时抽滤，滤饼用超纯水300mL室温搅拌打浆6次，最后滤液pH约为7后停止洗涤得碱洗炭黑，碱洗炭黑在120℃下鼓风干燥5小时，得固体71.8g。收率：98.4％。

S2：按照上述配方用量称取各原辅料，然后取上述配方量90％v/v的注射用水，加入氯化钠搅拌至完全溶解获得盐溶液；

S3：向S2获得的盐溶液中加入称取的枸橼酸钠和泊洛沙姆搅拌至完全溶解获得辅料液；

S4：向S3获得的辅料液中加入称取的纳米炭并搅拌均匀然后加入余量注射用水定容获得定容液；

S5：然后将S4获得的定容液以转速15000rpm匀浆10min，然后以15000psi压力均质1次后，再灌装、轧盖，然后在115℃下蒸汽灭菌30min，即得。

实施例2：制备方法包括以下步骤：

S1纳米炭的前处理：S11：500mL反应瓶中加入90.0g 40号炭黑、450mL乙酸乙酯以及大磁子，搅拌水浴加热至乙酸乙酯回流，保温搅拌1小时，趁热抽滤；滤饼用常温乙酸乙酯90mL洗涤，抽滤得滤饼；滤饼再次转入500mL反应瓶中，加入360mL乙酸乙酯和大磁子，搅拌水浴加热至乙酸乙酯回流，水浴保温搅拌1小时，趁热抽滤；滤饼用常温乙酸乙酯90mL洗涤，抽滤得到滤饼；滤饼在85℃下真空干燥2小时，得炭黑粗品88.6g；S12：称取73.0g粗品炭黑，加入300mL10％v/v硝酸水溶液和磁子，在室温下搅拌打浆2小时抽滤，滤饼用纯化水300mL室温搅拌打浆6次，最后抽滤滤液pH为6～7后停止洗涤得酸洗炭黑；S13：将酸洗炭黑转入烧杯中，加入300mL 0.1mol/L氢氧化钠和磁子，在室温下搅拌打浆1小时抽滤，滤饼用超纯水300mL室温搅拌打浆6次，最后滤液pH约为7后停止洗涤得碱洗炭黑，碱洗炭黑在120℃下鼓风干燥5小时，得固体71.8g。收率：98.4％。

S2：按照上述配方用量称取各原辅料，然后取上述配方量90％v/v的注射用水，加入氯化钠搅拌至完全溶解获得盐溶液；

S3：向S2获得的盐溶液中加入称取的枸橼酸钠和泊洛沙姆搅拌至完全溶解获得辅料液；

S4：向S3获得的辅料液中加入称取的纳米炭并搅拌均匀然后加入余量注射用水定容获得定容液；

S5：然后将S4获得的定容液以转速20000rpm匀浆3min，然后以30000psi压力均质1次后，再灌装、轧盖，然后在130℃下蒸汽灭菌10min，即得；

实施例3：其制备方法同实施例1。

实施例4：其制备方法同实施例2。

实施例5：其制备方法包括以下步骤：

S1纳米炭的前处理：S11：500mL反应瓶中加入90.0g 40号炭黑、450mL乙酸乙酯以及大磁子，搅拌水浴加热至乙酸乙酯回流，保温搅拌1小时，趁热抽滤；滤饼用常温乙酸乙酯90mL洗涤，抽滤得滤饼；滤饼再次转入500mL反应瓶中，加入360mL乙酸乙酯和大磁子，搅拌水浴加热至乙酸乙酯回流，水浴保温搅拌1小时，趁热抽滤；滤饼用常温乙酸乙酯90mL洗涤，抽滤得到滤饼；滤饼在85℃下真空干燥2小时，得炭黑粗品88.6g；S12：称取73.0g粗品炭黑，加入300mL10％v/v硝酸水溶液和磁子，在室温下搅拌打浆2小时抽滤，滤饼用纯化水300mL室温搅拌打浆6次，最后抽滤滤液pH为6～7后停止洗涤得酸洗炭黑；S13：将酸洗炭黑转入烧杯中，加入300mL0.1mol/L氢氧化钠和磁子，在室温下搅拌打浆1小时抽滤，滤饼用超纯水300mL室温搅拌打浆6次，最后滤液pH约为7后停止洗涤得碱洗炭黑，碱洗炭黑在120℃下鼓风干燥5小时，得固体71.8g。收率：98.4％；

S2：按照上述配方用量称取各原辅料，然后取上述配方量90％v/v的注射用水，加入氯化钠搅拌至完全溶解获得盐溶液；

S3：向S2获得的盐溶液中加入称取的枸橼酸钠和泊洛沙姆搅拌至完全溶解获得辅料液；

S4：向S3获得的辅料液中加入称取的纳米炭并搅拌均匀然后加入余量注射用水定容获得定容液；

S5：然后将S4获得的定容液以转速18000rpm匀浆5min，然后以20000psi压力均质3次后，再灌装、轧盖，然后在121℃下蒸汽灭菌15min，即得。

实施例6：其制备方法同实施例5。

实施例7：其制备方法同实施例5。

8.实验例——处方筛选

注：以下实验中，“w”表示未灭菌，“m”表示已灭菌，注：“NA”表示未测量。

8.1助悬剂筛选

8.1.1处方和制备工艺：在处方其余组分和用量、以及制备工艺不变的基础上，对处方中助悬剂的种类进行筛选，处方设计如下表1所示。处方设计(规格：50mg/ml，批量：50支)

表1

对比例1～6的制备工艺包括：S1纳米炭的前处理：S11：500mL反应瓶中加入90.0g40号炭黑、450mL乙酸乙酯以及大磁子，搅拌水浴加热至乙酸乙酯回流，保温搅拌1小时，趁热抽滤；滤饼用常温乙酸乙酯90mL洗涤，抽滤得滤饼；滤饼再次转入500mL反应瓶中，加入360mL乙酸乙酯和大磁子，搅拌水浴加热至乙酸乙酯回流，水浴保温搅拌1小时，趁热抽滤；滤饼用常温乙酸乙酯90mL洗涤，抽滤得到滤饼；滤饼在85℃下真空干燥2小时，得炭黑粗品88.6g；S12：称取73.0g粗品炭黑，加入300mL10％v/v硝酸水溶液和磁子，在室温下搅拌打浆2小时抽滤，滤饼用纯化水300mL室温搅拌打浆6次，最后抽滤滤液pH为6～7后停止洗涤得酸洗炭黑；S13：将酸洗炭黑转入烧杯中，加入300mL0.1mol/L氢氧化钠和磁子，在室温下搅拌打浆1小时抽滤，滤饼用超纯水300mL室温搅拌打浆6次，最后滤液pH约为7后停止洗涤得碱洗炭黑，碱洗炭黑在120℃下鼓风干燥5小时，得固体71.8g；S2：按照上述配方用量称取各原辅料，然后取上述配方量90％的注射用水，加入氯化钠搅拌至完全溶解获得盐溶液；S3：向S2获得的盐溶液中加入称取的枸橼酸钠和聚维酮C30(对比例2～6分别为吐温80、聚氧乙烯(35)蓖麻油、羟丙基纤维素、脱氧胆酸钠、HPMC)搅拌至完全溶解获得辅料液；S4：向S3获得的辅料液中加入称取的纳米炭并搅拌均匀然后加入余量注射用水定容获得定容液；S5：然后将S4获得的定容液以转速18000rpm匀浆5min，然后以20000psi压力均质3次后，再灌装、轧盖，然后在121℃下蒸汽灭菌15min，即得。

8.1.2 pH值、粒径检测结果见表2

表2

8.1.3实验结论

从以上检测结果来看，聚维酮C30、吐温80、聚氧乙烯(35)蓖麻油在灭菌前粒径均小于200nm，但灭菌后粒径均超限，脱氧胆酸钠灭菌前后均小于200nm，但其pH值超6-8范围，其余均不符合要求，故选择泊洛沙姆做助悬剂。

8.2.筛选主药

8.2.1处方和制备工艺：在处方其余组分和用量、以及制备工艺不变的基础上，对处方中主药的种类进行评价筛选，处方设计如下表3所示。处方设计(规格：50mg/ml，批量：50支)

表3

8.2.2 pH值、粒径检测结果见表4

表4

8.2.3实验结论

从以上检测结果来看，实施例5～7选择这三种型号的炭黑均能获得符合要求的pH和粒径。

8.3辅料用量筛选

在基本处方的基础上，保持处方种类、型号和工艺不变，对处方辅料的用量进行筛选。

8.3.1处方和制备工艺处方设计(规格：50mg/ml，批量：50支)如下表5所示：

表5

对比例7～14的制备工艺同实施例5。

8.3.2 pH值、粒径检测结果如下表6所示

表6检测结果

8.3.3实验结论

从以上检测结果来看，枸橼酸钠和氯化钠用量的改变对粒径的影响较小；泊洛沙姆在1.7％、2.5％和3％占比时对粒径影响较小，不加泊洛沙姆时发现均质后粒径是微米级的，未分散开。枸橼酸钠在0.24％～0.36％之间，最优值0.3％；氯化钠在0.8％～1.0％之间，最优值0.9％；泊洛沙姆在1.7％～3.0％之间，最优值2.0％。

8.4稳定性考察

8.4.1稳定性实验：分别对供试品(采用实施例5)进行高温光照、加速试验、长期试验

(1)高温光照：供试品开口置适宜的结静容器中，60℃温度下放置10天，于第10天、第10天和第30天取样，按该样品的稳定性重点考察项目进行检测(pH值、含量、粒径、Zeta电位)。若供试品各项指标低于规定限度则在40℃条件下同方法进行。若60℃无明显变换，不再进行40℃试验。

(2)加速试验：供试品按照市售包装。在40℃±2℃的条件下放置6个月，所用设备应能控制温度±2℃、相对湿度±5％，并能对真实温度与湿度进行监测。在试验期间第1个月、2个月、3个月、6个月末分别取样一次，按该样品的稳定性重点考察项目检测。

(3)长期试验：供试品3批，市售包装，温度25℃±2℃，相对湿度65％±5％的条件下放置。取样点3个月、6个月。

表7

8.4.2 pH值、粒径、Zeta电位检测结果如下表8所示：

表8

8.4.3实验结论：

从以上检测结果来看，灭菌前后pH值变化不大，放置光照和高温条件10天，pH增长0.4左右，但到了30天后pH值增幅较大，接近限度(6-8)，后找到原因是胶塞相容性的问题；为保证结果稳定，均质次数选择3次，粒径在灭菌前后相差20nm左右，光照和高温条件几乎无增长，结果均小于200nm；灭菌前后Zeta电位的绝对值均大于30mV。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，均在本发明的保护范围内。