一种检测目的基因拷贝数和病毒滴度的通用方法及应用

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通用的检测目的基因拷贝数的方法，通用的检测慢病毒滴度的方法和应用以及PCBP2基因检测试剂盒和检测目的基因拷贝数和病毒滴度的通用试剂盒。所用校准因子采用PCBP2基因，所述PCBP2基因模板的核苷酸序列如SEQ ID:NO 1或SEQ ID:NO 2所示。PCBP2基因解决了传统方法仅能检测人类样本，具有通用性；并且传统方法检测病毒滴度与流式细胞技术检测的方法吻合性差，在实际临床应用中检测病毒滴度的普适性不高，而采用PCBP2基因作为校准基因，结果稳定性好，检测慢病毒滴度更准确，与流式细胞技术检测结果更吻合，有利于临床应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通用的检测目的基因拷贝数的方法，通用的检测慢病毒滴度的方法和应用以及PCBP2基因检测试剂盒和检测目的基因拷贝数和病毒滴度的通用试剂盒。

背景技术

慢病毒载体已经广泛应用于动物模型基因治疗的研究和转基因动物的制备，而准确地测定重组慢病毒的滴度和感染效率是其关键步骤，由于病毒载体的转导效率主要取决于病毒滴度，这就使得病毒滴度的检测变得尤为重要。

病毒滴度或拷贝数检测常用的方法是ELISA法、Q-PCR、流式细胞计数法、RNA-Dot-blot、TCID50测定法以及Real-time PCR法(DNA定量检测法)，其中ELISA法、Q-PCR和RNA-Dot-blot均属于检测病毒物理滴度的方法，仅能反应病毒颗粒或核酸的数量并不能体现其感染细胞的感染能力；流式细胞计数法和Real-time PCR法可以检测活性病毒的感染滴度，是接近真实感染滴度的方法。不过流式检测工作量较大且会受到抗体亲和力、批次等原因的影响导致检出病毒滴度重复性差和误差值较大，同时对于高滴度病毒会出现低估病毒滴度的情况，需要多次条件摸索，并且仅适用于表达基因可用流式方法检测的情况；而基于RT-PCR通过DNA定量法检测感染细胞后定量载体DNA拷贝数的方式进行滴度检测，其结果更加稳定、最接近真实感染滴度，目前基于基因治疗的病毒滴度或拷贝数检测的RT-PCR方法对于人源细胞或人源样本的检测研究较多，而对于非人动物源样本如鼠源样本研究很少。在基因治疗或改造的细胞疗法临床前筛选时均需要动物实验评估基因载体或CAR表达载体或TCR-T表达载体等病毒载体在体内的维持和残留情况，目前发现的检测病毒拷贝数的内参在小鼠等非人基因组中不存在，因此仅能使用无内参的方法进行检测，但是无内参的方法稳定性和准确性均较差。

因此急需一种在人、鼠、仓鼠等多种哺乳动物间高度保守的通用基因作为校准基因以及检测靶基因滴度的方法。

发明内容

有鉴于此，发明人前期研究中发现基因PCBP2(聚胞嘧啶结合蛋白2)，该基因编码的蛋白质似乎是多功能的，它是主要的细胞多聚(rC)结合蛋白之一；该基因编码的蛋白与PCBP-1一起，作为脊髓灰质炎病毒RNA的翻译共激活因子，促进脊髓灰质炎病毒RNA的复制。它还参与了15-脂氧合酶mRNA(人乳头状细胞)的翻译控制，目前的研究较少，主要集中在神经性肿瘤以及一些实体瘤如结直肠癌、乳腺癌的早期诊断中。在发明人前期研究中，发现PCBP2在人、鼠、仓鼠等多种哺乳动物中均有表达，并且均高度保守，可以用于RT-PCR检测病毒滴度和拷贝数的方法中。

因此，本发明的目的之一在于提供一种通用的检测目的基因拷贝数的方法，结合RT-PCR检测技术进行快速、通用地检测基因修饰后目的基因在体内、体外的拷贝数情况，确保在检测过程中校正检测中待检样本的上样量，提高待检样本的检测通用性与出具结果的准确性，所述方法可提高DNA定量法检测拷贝数的通用性，能运用到动物实验(鼠、猴等)中对拷贝数的准确检测为临床试验的展开提供稳定的数据支撑。

为实现上述目的，本发明采用以下方案：

所述引物组和探针针对PCBP2基因设计，PCBP2基因(Gene ID:5094)模板的核苷酸序列为第12623-12766位的144个核苷酸如SEQ ID:NO 1所示或第22951-23054位的104个核苷酸如SEQ ID:NO 2所示。设计所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO 3或SEQID:NO 6所示，对应下游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO 4或SEQ ID:NO 7所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID:NO 5或SEQ ID:NO 8所示。

现有技术方案中未设内参，即使设置CDKN1A内参后也只能在293T、Hela细胞系中进行VCN检测，存在检测上的局限性，并且在开展动物实验中无法得到较为准确的实验数据。PCBP2基因解决了传统方法仅能检测人类样本，具有通用性；并且传统方法检测病毒滴度与流式细胞技术检测的方法吻合性差，在实际临床应用中检测病毒滴度的普适性不高，采用PCBP2基因作为校准基因，结果稳定性好，检测慢病毒滴度更准确，与流式细胞技术检测结果更吻合，有利于临床应用。

进一步，所述方法包括以下步骤：

1)根据PCBP2基因设计上下游引物；所述PCBP2基因模板的核苷酸序列如SEQ ID:NO 1或SEQ ID:NO 2所示；

2)抽提基因组模板；

3)采用PCR SYBR染料法、PCR TaqMan探针法中的任一种方法检测并计算目的基因的拷贝数和扩增效率。

进一步，测定目的基因拷贝数用分析软件分析数据，根据标准曲线计算拷贝数，拷贝数/cell＝(目的基因拷贝数/校准基因PCBP2拷贝数)×2。

进一步，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO 3或SEQ ID:NO 6所示，对应所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO 4或SEQ ID:NO 7所示。

进一步，所用探针的核苷酸序列如SEQ ID:NO 5或SEQ ID:NO 8所示。

具体的，所述PCBP2基因模板的核苷酸序列是PCBP2基因(Gene ID:5094)的第12623-12766位的144个核苷酸，第22951-23054位的104个核苷酸。

具体的，抽提目的基因组模板的方法为：向细胞样品中加入适量组织裂解液和蛋白酶K，细胞样品55℃孵育过夜消化裂解；之后利用RNase和5M NaCl溶液去除蛋白，将上清转移至新的2ml离心管中；加入预冷的无水乙醇沉淀DNA；沉淀DNA后弃上清，加入70％乙醇去除盐离子后用TE buffer重悬溶解DNA，4℃短期保存或-20℃长期保存。

本发明的目的之三在于提供一种通用的检测慢病毒滴度的方法，该方法检测非人病毒滴度真实和准确，并优于流式检测方法。

为实现上述目的，本发明采用以下方案：

所述方法包括以下步骤：

1)根据PCBP2基因设计上下游引物：所述PCBP2基因模板的核苷酸序列如SEQ ID:NO 1或SEQ ID:NO 2所示；

2)抽提感染病毒细胞的基因组模板；

3)测定病毒滴度用分析软件分析数据，根据标准曲线计算病毒滴度，病毒滴度＝(铺进去细胞数×拷贝数/cell)/加入病毒的量，结果用TU/mL表示。

进一步，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO 6所示，对应所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO 7所示。

进一步，还可根据PCBP2基因设计探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID:NO 8所示。

本发明的目的之四在于提供所述通用的检测目的基因拷贝数的方法、通用的检测慢病毒滴度的方法和针对PCBP2基因设计的引物组的应用，具体为在提高DNA定量法检测拷贝数的通用性和检测病毒滴度中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下方案：

所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO 3或SEQ ID:NO 6所示，对应下游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO 4或SEQ ID:NO 7。

进一步，所述检测对象包括人和动物。

进一步，所述拷贝数的检测包括体内拷贝和体外拷贝。

本发明的目的之五在于提供三种试剂盒，使用所述试剂盒可以方便准确的检测PCBP2基因和/或目的基因体内外的基因拷贝数和病毒滴度。

为实现上述目的，本发明采用以下方案：

PCBP2基因检测试剂盒，所述试剂盒包括针对PCBP2基因设计的引物组，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO 3或SEQ ID:NO 6所示，对应下游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO 4或SEQ ID:NO 7所示。

一种检测目的基因拷贝数和病毒滴度的通用试剂盒，所述试剂盒包含引物组和染料，所述引物组针对PCBP2基因设计，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO 3或SEQ ID:NO 6所示，对应下游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO 4或SEQ ID:NO7所示。

一种检测目的基因拷贝数和病毒滴度的通用试剂盒，所述试剂盒包含引物组和探针，所述引物组和探针针对PCBP2基因设计，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQID:NO 3或SEQ ID:NO 6所示，对应下游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO 4或SEQ ID:NO 7所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID:NO5或SEQ ID:NO 8所示。

本发明的有益效果在于：

1)所述用于检测目的基因的引物组和探针可提高DNA定量法检测拷贝数的通用性；检测方法能运用到动物实验(鼠、猴等)中对拷贝数的准确检测为临床试验的展开提供稳定的数据支撑；所述检测方法获得滴度和拷贝数较为接近病毒真实的感染效率，并且检测结果十分稳定，故实现了通量、通用的检测病毒滴度、拷贝数；

2)检测方法不仅能在常用的293T、Hela细胞系中进行载体拷贝数(VCN)检测，也能在CHO工具细胞系中进行VCN检测；

3)所述引物组和探针保证了其可运用于染料法或探针法RT-PCR检测，确保在不同模板间的准确扩增，保证检测结果的准确性；

4)所述检测方法和试剂盒检测准确、稳定性重复性好。

附图说明

图1为PCBP2-75引物在质粒、人基因组、鼠基因组为模板的染料法RT-PCR中检测标准曲线。

图2为PCBP2-144引物在质粒、人基因组、鼠基因组为模板的染料法RT-PCR中检测标准曲线。

图3为PCBP2-75引物在质粒、人基因组、鼠基因组为模板的探针法RT-PCR中检测标准曲线。

图4为PCBP2-144引物在质粒、人基因组、鼠基因组为模板的探针法RT-PCR中检测标准曲线。

图5为PCBP2作为内参在鼠细胞来源样本检测慢病毒滴度。

图6为以PCBP2作为内参检测在人细胞来源样本检测慢病毒滴度。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1 PCBP2在PCR SYBR染料法进行拷贝数检测中的通用性

分别针对PCBP2基因(Gene ID:5094)的第12623-12766位的144个核苷酸如SEQID:NO 1所示，第22951-23054位的104个核苷酸如SEQ ID:NO 2所示来设计二对引物，如下表所示。

质粒抽提

向细胞样品中加入适量组织裂解液和蛋白酶K，细胞样品55℃孵育过夜消化裂解；之后利用RNase和5M NaCl溶液去除蛋白，将上清转移至新的2ml离心管中；加入预冷的无水乙醇沉淀DNA；沉淀DNA后弃上清，加入70％乙醇去除盐离子后用TE buffer重悬溶解DNA，4℃短期保存或-20℃长期保存。

基因组抽提

向人源或鼠源细胞样品中加入适量组织裂解液和蛋白酶K，细胞样品55℃孵育过夜消化裂解；之后利用RNase和5M NaCl溶液去除蛋白，将上清转移至新的2ml离心管中；加入预冷的无水乙醇沉淀DNA；沉淀DNA后弃上清，加入70％乙醇去除盐离子后用TE buffer重悬溶解DNA，4℃短期保存或-20℃长期保存。

1)PCR SYBR染料法进行荧光定量PCR扩增

用灭菌纯化水稀释上述引物至100×，使用时将上下游引物稀释制备成10×预混液使用；其次，用灭菌纯水将质粒按10倍或5倍梯度稀释，将不同浓度滴度的重组质粒作为荧光定量PCR反应的阳性标准模板。PCR体系为(10ul)：模板4.5ul，上下游引物混合物(10×)0.4ul，CXR 0.1ul，

实验结果如图1-2和下表所示，图1为PCBP2-75分别以质粒(A)、人基因组(B)以及鼠基因组(C)为模板进行SYBR染料法进行荧光定量的引物扩增效率；图2为PCBP2-144分别以质粒(A)、人基因组(B)、鼠基因组(C)为模板进行SYBR染料法进行荧光定量的引物扩增效率。

结果表明采用设计的二组引物，以质粒、人基因组、鼠基因组为模板进行扩增时，此引物的扩增效率达到了88％以上甚至99.594％，说明此引物扩增效率良好，对质粒、人基因组以及鼠基因组来源的样本均可使用染料法进行荧光定量PCR，具有通用性。

实施例2 PCBP2在单重PCR TaqMan探针法进行拷贝数检测中的通用性

1)针对PCBP2基因(Gene ID:5094)的第12623-12766位的144个核苷酸如SEQ ID:NO 1所示，第22951-23054位的104个核苷酸如SEQ ID:NO2所示来设计引物和探针，所述引物采用实施例2的引物，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID:NO 7所示。

2)质粒抽提

向细胞样品中加入适量组织裂解液和蛋白酶K，细胞样品55℃孵育过夜消化裂解；之后利用RNase和5M NaCl溶液去除蛋白，将上清转移至新的2ml离心管中；加入预冷的无水乙醇沉淀DNA；沉淀DNA后弃上清，加入70％乙醇去除盐离子后用TE buffer重悬溶解DNA，4℃短期保存或-20℃长期保存。

3)基因组抽提

向人源或鼠源细胞样品中加入适量组织裂解液和蛋白酶K，细胞样品55℃孵育过夜消化裂解；之后利用RNase和5M NaCl溶液去除蛋白，将上清转移至新的2ml离心管中；加入预冷的无水乙醇沉淀DNA；沉淀DNA后弃上清，加入70％乙醇去除盐离子后用TE buffer重悬溶解DNA，4℃短期保存或-20℃长期保存。

4)PCR TaqMan探针法进行荧光定量PCR扩增

用灭菌纯化将引物干粉稀释成100×，使用时将上下游引物稀释制备成10×预混液使用，其次，用灭菌纯化将探针稀释成10×工作液使用，再用灭菌纯水将质粒按10倍或5倍梯度稀释，将不同浓度滴度的重组质粒作为荧光定量PCR反应的阳性标准模板。PCR体系为(20ul)：模板4.5ul，上下游引物混合物(10×)0.8ul，探针(10×)0.5ul，TaqMan FastAdvanced Master Mix 10ul，Nuclear-free water 2.9ul。反应条件为先50℃2min，95℃预变性10min，然后按95℃变性15s，60℃退火、延伸1min，共计40个循环进行。反应在荧光定量PCR扩增仪上进行。

实验结果如图3、图4和下表所示，图3为PCBP2-75引物和探针组以质粒为模板进行扩增时扩增效率；图4为PCBP2-144引物和探针组分别以质粒(A)、人基因组(B)、鼠基因组(C)为模板进行扩增时扩增效率；结果表明采用此引物和探针，以质粒、人基因组以及鼠基因组为模板进行扩增时，此引物的扩增效率达到了96.234％-106.082％，对于不同来源的模板均扩增稳定，可以运用到拷贝数检测当中。

实施例3慢病毒滴度检测

1)制备的病毒感染CHO细胞(小鼠卵巢细胞系)，感染72h后进行基因组提取，获得10个不同的转导病毒的样品，分别编号：174、205、206、207、209、215、216、80、87和89，采用多重TaqMan探针法，测定病毒滴度用分析软件分析数据，根据标准曲线计算病毒滴度，病毒滴度＝(铺进去细胞数×拷贝数/cell)/加入病毒的量，结果用TU/mL表示。

2)分别采用传统无内参方法、CDKN1A作为内参和使用PCBP2作为内参的检测方法，对17个转导进CHO细胞系的病毒样本，并对不同方法的差异进行了比较，最终发现PCBP2作为内参检测小鼠来源的样本病毒滴度优于现行的传统无内参方法和最新的使用CDKN1A内参的方法。

实验结果(下表)显示本发明开发的使用PCBP2作为内参的检测病毒滴度的方法能够在小鼠细胞系来源的样本中检测出滴度，并且该滴度检测方法检测的滴度与采用流式细胞仪检测病毒真实感染效率的方法一致性好，并且使用PCBP2作为内参的方法检测滴度的准确性显著高于传统检测滴度方法和使用CDKN1A作为内参的方法。

实施例4拷贝数检测、准确性、稳定性验证

1)制备的病毒感染PBMC细胞(人外周血来源单核细胞，共6个不同批次的样本)，进行基因组提取，分别编号：20180701-21、20180701-25、20180701-19、20180702-21、20180702-25以及20180702-28，采用TaqMan探针法，测定病毒拷贝数用分析软件分析数据，根据标准曲线计算病毒拷贝数，拷贝数/cell＝(目的基因拷贝数/校准基因PCBP2拷贝数)×2。

2)以TaqMan探针法进行检测，设计引物如下表所示，其中PCBP2的引物和探针采用实施例2的引物和探针：

实验结果如图5-6和下表所示，设计的引物序列扩增效率良好，并且检测的拷贝数与慢病毒载体携带的目的基因在被转导细胞表面的表达阳性率相关，并且检测结果十分稳定。我们所检测的目的基因在50％-60％表达时其拷贝数在1.4-2.0之间，检测的拷贝数较为稳定，拷贝数的数值仅与基因表达阳性率相关，不会因为批次和检测时间的原因，而导致拷贝数出现较大偏差。

因此，选择PCBP2作为校正基因，PCBP2此基因在人、鼠、仓鼠等20余种物种间部分序列高度保守，在保守的区域设计引物与探针、基于TaqMan qPCR对此引物和探针进行了工作效率的验证，结果显示PCBP2在人、鼠、仓鼠、质粒等不同模板中均能表现出良好的扩增效率，进而实现了用一个通用型的校正基因对不同物种的检测上样量的校正，满足了在不同工具细胞293T或CHO上进行滴度检测工作；并且在多重PCR的体系中对Luc、PCBP2仍然保持了良好的扩增效率，使用PCBP2作为内参获得滴度和拷贝数较为接近病毒真实的感染效率，并且检测结果十分稳定，故实现了通量、通用的检测病毒滴度。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。