乙烯受体生物传感器

摘要

本公开涉及具有受体层(5)和介体层(6)的生物传感器(10)，所述受体层包括乙烯受体分子。本公开还涉及传感器单元(20)，其包括一个或多个生物传感器(10)和控制器(11)。在一些实施例中，一个或多个传感器单元(20)可以与接收器模块或网络网关无线通信。

说明书

相关申请的交叉引用

本公开要求2019年5月22日提交的美国临时专利申请No.62/674,639的权益，其全部公开内容通过引用合并于此。

背景技术

世界范围内，趋向于消费更新鲜和最少加工的食物。得益于改进的包装、存储技术和快速的全球运输，现在可以全年获得优质的新鲜水果和蔬菜。全年新鲜农产品的丰富性取决于庞大的基础设施，包括专门的冷藏设施。

在运输和存储的各个阶段中，保持水果、蔬菜和其他园艺产品(例如鲜切花)的新鲜度对于收获后工业和生产者而言是重要的。控制农产品新鲜度的方法之一是调节其对乙烯的暴露。

乙烯是植物激素，其在许多植物发育机制中起作用。重要的是，它以自动催化方式在呼吸跃变期果实的成熟中发挥作用。随着果实的成熟，它释放出更高浓度的乙烯，并且可以预测农产品的成熟度。当农产品对乙烯的暴露有限时，其自然老化过程将变慢。水果、蔬菜和花卉中的乙烯释放以变量依赖性(variant-dependent)、可预测的方式发生(Watkins1989；Chu 1984；Chu 1988；Diley 1980；Knee et al.1983；Perring&Pearson 1986)。通过对乙烯的高精度测量，可以预测呼吸跃变期果实所处的成熟和衰老阶段。因此，对乙烯的测量可以在成熟出现之前预测成熟。这允许在供应链中作出调整以防止食物浪费。例如，将苹果采摘后在受控气氛(CA)储藏室中存放数月。确定包装CA房间的正确顺序以在供应链的更下游进行消费可以最小化食物浪费并提高产品质量。可以使用高精度乙烯传感器执行这种优化。

现有的最基本的乙烯测量技术是获取空气样品，然后在实验室条件下方便地对其进行乙烯浓度测试。例如，可以将空气样品收集在样品袋中，然后送至实验室进行气相色谱测试。该技术可在样品收集条件下提供准确的乙烯测量。由于该方法的麻烦性，该技术对于连续的乙烯监测是不实用的。该技术的一个缺点是无法实时了解乙烯浓度-采样和测试存在延迟。此外，单个样本并不能提供乙烯感测可以提供的预测能力；也就是说，无法用少数延迟的数据点对水果衰老做出预测。

用于乙烯测量的另一种当前技术是使用采样泵通过检测管抽吸空气。当将空气泵送到检测器管上时，会显示特定气体的浓度。这通常通过沿检测管侧面的刻度上显示的颜色变化来完成。可以通过手动泵(例如Sensidyne的AP-1S)或通过机械泵将检测管暴露于空气中，其将空气缓慢吸入检测管，以提供较长时间的平均值读数(例如Sensidyne的GilAir5)。

该技术的分辨率仅与人们能够读取颜色变化一样，并且往往在100ppm内是准确的。如此低的分辨率无法检测到细微的变化，例如样品中的果实成熟或衰老。由于其单次性使用的一次性管，该技术也受到限制。

发明内容

本公开的一个方面是一种生物传感器，其包括：(a)参比电极，其包括(i)与基极连通的介体层；(ii)与介体层连通的受体层，其中所述受体层包含乙烯受体；和(b)与参比电极连通的对电极。在一些实施例中，基极由选自铜和银的材料组成。在一些实施例中，基极包括选自由铜和金组成的材料的涂层。在一些实施例中，参比电极和对电极形成或沉积在同一基板上。

在一些实施例中，乙烯受体与乙烯受体基因的野生型多核苷酸序列至少90％相同。在一些实施例中，乙烯受体与乙烯受体基因的野生型多核苷酸序列至少95％相同。在一些实施例中，乙烯受体与乙烯受体基因的野生型多核苷酸序列至少97％相同。在一些实施例中，乙烯受体与乙烯受体基因的野生型多核苷酸序列至少98％相同。在一些实施例中，乙烯受体与乙烯受体基因的野生型多核苷酸序列至少99％相同。在一些实施例中，乙烯受体衍生自玉米(Zea mays)或拟南芥(Arabidopsis)。在一些实施例中，乙烯受体包含与SEQ IDNO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，乙烯受体包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，乙烯受体包含与SEQ ID NO：3具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，乙烯受体包含与SEQ ID NO：4具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，介体层包含铁氰化钾、甲基紫精、二茂铁，半胱胺、巯基丙酸、巯基苯甲酸、巯基十一烷酸、氯化钌、萘酚绿或聚吡咯中的至少一种。

本公开的另一方面是一种叠层(stack)，其包括：(a)介体层，和(b)与所述介体层接触的受体层，其中所述受体层包含乙烯受体蛋白。在一些实施例中，乙烯受体蛋白具有与选自ETR1、ETR2、ETR3和ETR4的任何乙烯受体蛋白具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白选自ETR1、ETR2、ETR3和ETR4。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与SEQ ID NO：1-4中任一项具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与SEQ ID NO：1-4中的任一项具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与SEQ ID NO：1-4中的任一项具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，蛋白质包含与SEQ ID NO：1-4中任一项具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与SEQ ID NO：1-4中任一项具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与SEQ ID NO：1-4中任一项具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与SEQ ID NO：1-4中任一项具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含具有SEQ ID NO：1-4中任一项的氨基酸序列。在一些实施例中，在约0.0005mg/mm至约1.75mg/mm之间的乙烯受体蛋白包含在受体层内。在一些实施例中，在约0.0008mg/mm至约1.55mg/mm之间的乙烯受体蛋白包含在受体层内。在一些实施例中，在约0.1至约0.8mg/mm之间的乙烯受体蛋白包含在受体层内。在一些实施例中，在约0.9至约1.6mg/mm之间的乙烯受体蛋白包含在受体层内。在一些实施例中，介体层包含铁氰化钾、甲基紫精、二茂铁、半胱胺、巯基丙酸、巯基苯甲酸、巯基十一烷酸、氯化钌、萘酚绿或聚吡咯中的至少一种。

本公开的另一方面是一种参比电极，其包括沉积在基极上的叠层，其中所述叠层包括(a)介体层，和(b)与所述介体层接触的受体层，其中受体层包含乙烯受体蛋白。在一些实施例中，乙烯受体蛋白选自ETR1、ETR2、ETR3和ETR4。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与SEQ ID NO：1-4中的任一项具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与SEQ ID NO：1-4中的任一项具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，蛋白质包含与SEQ ID NO：1-4中任一项具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与SEQ ID NO：1-4中任一项具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与SEQ ID NO：1-4中任一项具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与SEQ ID NO：1-4中任一项具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含具有SEQ ID NO：1-4中任一项的氨基酸序列。在一些实施例中，在约0.0005mg/mm至约1.75mg/mm之间的乙烯受体蛋白包含在受体层内。在一些实施例中，在约0.0008mg/mm至约1.55mg/mm之间的乙烯受体蛋白包含在受体层内。在一些实施例中，在约0.1至约0.8mg/mm之间的乙烯受体蛋白包含在受体层内。在一些实施例中，在约0.9至约1.6mg/mm之间的乙烯受体蛋白包含在受体层内。在一些实施例中，基极是金属电极。在一些实施例中，金属电极由铜和金组成。在一些实施例中，基极包括含有铜或银的涂层。在一些实施例中，介体层包含铁氰化钾、甲基紫精、二茂铁、半胱胺、巯基丙酸、巯基苯甲酸、巯基十一烷酸、氯化钌、萘酚绿或聚吡咯中的至少一种。

本公开的另一方面是一种生物传感器，其包括(i)参比电极；和(ii)与参比电极连通的对电极；其中参比电极包括沉积在金属电极上的叠层，其中所述叠层包括(a)介体层，和(b)与所述介体层接触的受体层，其中所述受体层包含乙烯受体蛋白。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与乙烯受体基因的野生型多核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与乙烯受体基因的野生型多核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与乙烯受体基因的野生型多核苷酸序列至少97％相同的核苷酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与乙烯受体基因的野生型多核苷酸序列至少98％相同的核苷酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与乙烯受体基因的野生型多核苷酸序列至少99％相同的核苷酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白选自ETR1、ETR2、ETR3和ETR4。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与SEQ ID NO：1-4中的任一项具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，参比电极和对电极形成或沉积在同一基板上。在一些实施例中，介体层包含铁氰化钾、甲基紫精、二茂铁、半胱胺、巯基丙酸、巯基苯甲酸、巯基十一烷酸、氯化钌、萘酚绿或聚吡咯中的至少一种。

本公开的另一个方面是一种传感器单元，其包括：(i)一个或多个生物传感器，和(ii)与一个或多个生物传感器通信的控制器；其中，所述生物传感器包括：与对电极连通的参比电极，所述参比电极具有沉积在电极上的叠层，其中，所述叠层包括：(a)介体层，和(b)与所述介体层接触的受体层，其中所述受体层包含乙烯受体蛋白。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与乙烯受体基因的野生型多核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与乙烯受体基因的野生型多核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与乙烯受体基因的野生型多核苷酸序列至少97％相同的核苷酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与乙烯受体基因的野生型多核苷酸序列至少98％相同的核苷酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与乙烯受体基因的野生型多核苷酸序列至少99％相同的核苷酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白选自ETR1、ETR2、ETR3和ETR4。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与SEQ ID NO：1-4中的任一项具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，介体层包含铁氰化钾、甲基紫精、二茂铁、半胱胺、巯基丙酸、巯基苯甲酸、巯基十一烷酸、氯化钌、萘酚绿或聚吡咯中的至少一种。在一些实施例中，控制器包括通信模块。在一些实施例中，通信模块是无线通信模块。

本公开的另一个方面是一种传感器单元，其包括：(1)一个或多个生物传感器，和(2)与一个或多个生物传感器通信的控制器；其中，所述生物传感器包括：(a)参比电极，其包括：(i)沉积在金属电极上的介体层；和(ii)沉积在介体层上的受体层，其中所述受体层包括乙烯受体；以及(b)与参比电极连通的对电极。在一些实施例中，乙烯受体蛋白选自ETR1、ETR2、ETR3和ETR4。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与SEQ ID NO：1-4中的任一项具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，介体层包含铁氰化钾、甲基紫精、二茂铁、半胱胺、巯基丙酸、巯基苯甲酸、巯基十一烷酸、氯化钌、萘酚绿或聚吡咯中的至少一种。在一些实施例中，控制器包括通信模块。在一些实施例中，通信模块是无线通信模块。

本公开的另一方面是一种系统，其包括上述多个传感器单元，其中多个传感器单元各自独立地与接收器模块、网关或存储模块无线通信。

本公开的另一方面是一种容器，其包括上述传感器单元中的至少一个。在一些实施例中，每个容器与接收器模块、网关或存储模块无线通信。

本公开的另一方面是一种使用上述任何生物传感器或传感器单元中检测乙烯的存在的方法。在一些实施例中，可使用上述任何生物传感器或传感器单元进行乙烯浓度的定量测量。

附图说明

为了总体上理解本公开的特征，参考附图。在附图中，相同的附图标记始终用于标识相同的元件。

图1示出了根据本公开的一个实施例的生物传感器的俯视图。

图2A示出了根据本公开的一个实施例的参比电极的侧视图。

图2B示出了根据本公开的另一实施例的生物传感器的侧视图。

图3A示出了根据本公开的一个实施例的与控制器通信的生物传感器的示意图。

图3B示出了根据本公开的一个实施例的包括生物传感器和控制器的传感器单元的示意图。

图3C示出了根据本公开的一个实施例的包括多个生物传感器和控制器的传感器单元的示意图。

图3D示出了根据本公开的一个实施例的包括生物传感器、控制器和无线通信模块的传感器单元的示意图。

图3E示出了根据本公开的一个实施例的包括生物传感器、控制器、电源、模数转换器和无线通信模块的传感器单元的示意图。

图4示出了根据本公开的一个实施例的与无线网关进行无线通信的多个传感器单元。

图5提供了列出暴露测试到约7.5ppm/min的乙烯的结果的图。在标准大气条件下，在一个约5L的密闭容器中，将乙烯生物传感器暴露于约7.5ppm/min的乙烯气体中。电压输出以统计学上显著的方式与容器内的总乙烯浓度相关。

图6提供了列出在标准大气条件下约10至约110ppm的乙烯的暴露测试结果的图。生物传感器暴露于约10至约110ppm的乙烯。每10ppm读取一次读数。

图7提供了列出使用本公开的生物传感器进行乙烯测试的结果的图，其中乙烯浓度峰值对应于质量控制数据，其指示了水果成熟度的变化。

具体实施方式

还应理解，除非有明显的相反指示，否则在本文要求保护的任何方法中，包括多个步骤或动作，该方法的步骤或动作的顺序不必限于描述该方法的步骤或动作的顺序。

如本文所用，除非上下文另外明确指出，否则单数术语“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物。类似地，除非上下文另外明确指出，否则单词“或”旨在包括“和”。术语“包括”限定为包含地，以使“包括A或B”表示包括A、B或A和B。

如在说明书和权利要求书中所使用的，“或”应被理解为具有与以上定义的“和/或”相同的含义。例如，当将列表中的项目分开时，“或”或“和/或”应解释为包含性的，即包含多个或元素列表中的至少一个，但也包括超过一个，以及可选的其他未列出的项目。仅明确指出相反的术语，例如“仅一个”或“恰好一个”，或当在权利要求书中使用时，“由……组成”将指的是仅包括多个或元素列表中的恰好一个元素。元素。通常，当在排他性术语(例如“任一”、“其一”、“仅其一”或“恰好其一”)前时，本文中使用的术语“或”仅应理解为指示排他的替代物(即“一个或另一个而非二者”)。当在权利要求书中使用时，“基本上由……组成”应具有在专利法领域中所使用的普通含义。

术语“包括(comprising)”、“包含(including)”、“具有(having)”等可互换使用并且具有相同的含义。类似地，“包括(comprises)”、“包含(includes)”、“具有(has)”等可互换使用并且具有相同的含义。具体而言，每个术语的定义均与美国专利法中常见的“包括”定义一致，因此应解释为一个开放术语，表示“至少以下”，并且还应解释为不排除其他特征、限制、方面等。因此，例如，“具有组件a、b和c的设备”是指该设备至少包括组件a、b和c。类似地，短语：“一种涉及步骤a、b和c的方法”是指该方法至少包括步骤a、b和c。此外，尽管这里可以以特定顺序概述步骤和过程，但是本领域技术人员将认识到排序步骤和过程可以变化。

如本文在说明书和权利要求书中所使用的，在提及一个或多个元素的列表时，短语“至少一个”应理解为是指选自元素列表中的任意一个或多个元素的至少一个元素，但不一定包括元素列表中具体列出的每个元素中的至少一个，并且不排除元素列表中元素的任何组合。该定义还允许除了短语“至少一个”所指代的元素列表中特别识别的元件之外的元素可以可选地存在，无论与那些特别识别的元素有关还是无关。因此，作为非限制性示例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)可以在一个实施例中指代至少一个A、任选地包括超过一个A而B不存在(并且任选地包括除B以外的元素)；在另一个实施例中指代至少一个B、任选地包括超过一个B而A不存在(并且任选地包括除A以外的元素)；在又一个实施例中，指代至少一个A、任选地包括过一个A和至少一个B、任选地包括超过一个B(以及任选地包括其他元素)；等等。

本公开涉及一种生物传感器，其包括参比电极和对电极，其中所述参比电极包括包含乙烯受体分子的层。

图1A描绘了根据本公开的一个实施例的生物传感器10的俯视图。在一些实施例中，生物传感器10包括参比电极2和对电极3。在一些实施例中，参比电极2和对电极3设置在基板1上。在一些实施例中，基板1是非导电基板，例如玻璃纤维环氧树脂或酚醛树脂。在一些实施例中，基板选自碳、玻璃纤维环氧树脂、酚醛树脂、绝缘的金属基板、聚酰亚胺膜和含氟聚合物/聚酰亚胺膜复合物。在一些实施例中，生物传感器10还包括一个或多个引线，以允许生物传感器与其他组件和/或设备通信。在一些实施例中，引线由衬底内的导电迹线组成，其连接到参比电极表面和对电极。在一些实施例中，引线由组成电极的相同金属组成。

在一些实施例中，参考图2A，参比电极2包括受体层5、介体层6和基极7。基极7可以由本领域技术人员已知的任何材料组成。例如，基极7可以由铜、金、铝或银组成。在一些实施例中，基极7可以由氧化铟锡、金或银电极组成。在一些实施例中，电极7包括导电金属涂层。在一些实施例中，金属涂层包括铜和/或银。

图2B示出了具有参比电极2的替代性生物传感器10，该参比电极2包括受体层5、介体层6和电极7。图2B还包括与受体层5连通的对电极3。在一些实施例中，对电极3由选自金、银、铜或其任何组合的材料组成。在一些实施例中，图2B的对电极3可以由多孔材料组成，例如由1H-1,2,3-三唑和二价金属离子(Mg、Mn、Fe、Co、Cu和Zn)组成的金属三唑盐。在其他实施例中，图2B的对电极包括一个或多个孔或刺孔，以促进乙烯气体穿过对电极层3并渗透到受体层5。在一些实施例中，孔或刺孔的半径范围可在约2埃至约2mm之间。

在一些实施例中，介体层6包括导电且生物相容的材料，其用于介导受体层和金属电极之间的电子转移。还据信，介体层6用于稳定本文所述的受体层的组分。进一步认为，介体层6促进了与乙烯受体蛋白的交联相互作用，使得乙烯受体蛋白被固定在介体层6的表面上。据信，由乙烯和乙烯受体分子之间可逆的化学相互作用引起的电子运动由于介体层的电导率和随后的电压输出(在约0至约7V之间)而受到促进。

在一些实施例中，介体层6包含选自铁氰化钾、氯化铁、甲基紫精、二茂铁、半胱胺、巯基丙酸、巯基苯甲酸、巯基十一烷酸、氯化钌、萘酚绿或聚吡咯的至少一种组分。在一些实施例中，介体层6包括(i)第一组分，其选自铁氰化钾、氯化铁、甲基紫精、二茂铁、半胱胺、巯基丙酸、巯基苯甲酸、巯基十一烷酸、氯化钌、萘酚绿或聚吡咯的第一组分；和(ii)第二组分。

在一些实施例中，介体层6包括下表1中列出的组分。

表1列出了可以使用的介体层以及每个介体层的组分。

在一些实施例中，受体层5包括乙烯受体蛋白。术语“乙烯受体”或“乙烯受体蛋白”是指来自植物中存在的任何乙烯受体家族的乙烯受体。举例来说，在拟南芥中，乙烯受体蛋白包括ETR1、ERS1、ETR2、ERS2和EIN4。玉米乙烯受体蛋白包括ZmERS1和ZmETR2(包括ZmETR2变体ZmETR9和ZmETR40)。在一些实施例中，也可以使用来自莴苣(Lactuca Sativa)、苔藓植物(Bryophyta)、矮牵牛(Petunia)和番茄(Solanum lycopersicum)的基因的乙烯受体蛋白。分离乙烯受体的方法在本文中进行了描述，并且也在美国专利号7,951,993和7,105,654中进行了描述，其公开内容通过引用整体并入本文。

本公开的乙烯受体可以从任何植物物种中分离，并且包括示例性乙烯受体的物种同源物。在这方面，在一些实施例中，乙烯受体蛋白是天然存在的。天然存在的乙烯受体的实例包括乙烯受体1(ETR1)(例如衍生自ARABIDOPSIS THALIANA)、乙烯受体2(ETR 2)(例如衍生自ARABIDOPSIS THALIANA)、乙烯受体3(ETR3)(例如衍生自ORYZA SATIVA INDICA)或乙烯受体4(ETR4)(例如衍生自ORYZA SATIVA JAPONICA)。

在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与乙烯受体基因的野生型多核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与乙烯受体基因的野生型多核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与乙烯受体基因的野生型多核苷酸序列至少97％相同的核苷酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与乙烯受体基因的野生型多核苷酸序列至少98％相同的核苷酸序列。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含与乙烯受体基因的野生型多核苷酸序列至少99％相同的核苷酸序列。

在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少80％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少85％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少95％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ IDNO：1的氨基酸序列具有至少96％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少97％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少98％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少99％同一性。在一些实施例中，乙烯受体包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少80％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少85％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少90％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少95％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ IDNO：2的氨基酸序列具有至少96％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少97％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少98％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少99％同一性。在一些实施例中，乙烯受体包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少80％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少85％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少90％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少95％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ IDNO：3的氨基酸序列具有至少96％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少97％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少98％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少99％同一性。在一些实施例中，乙烯受体包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少80％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少85％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少90％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少95％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ IDNO：4的氨基酸序列具有至少96％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少97％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少98％同一性。在一些实施例中，乙烯受体与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少99％同一性。在一些实施例中，乙烯受体包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

在其他实施例中，乙烯受体还包括具有天然存在和诱导突变的蛋白质，所述突变包括插入、删除和点突变。在其他实施例中，乙烯受体蛋白是非天然存在的。

在一些实施例中，约10至约1000纳克之间的乙烯受体蛋白包含在在受体层内。在一些实施例中，约20至约600纳克之间的乙烯受体蛋白包含在在受体层内。在一些实施例中，约50至约300纳克之间的乙烯受体蛋白包含在在受体层内。在一些实施例中，对于所施加的介体层的每立方厘米组分，施加约0.015毫克的乙烯受体蛋白。在一些实施例中，对于所施加的介体层的每立方厘米组分，施加约0.04毫克的乙烯受体蛋白。在一些实施例中，对于所施加的介体层的每立方厘米组分，施加约0.002毫克的乙烯受体蛋白。

在一些实施例中，参比电极的总厚度在约0.1mm至约1.5mm之间的范围内。在一些实施例中，参比电极的每个单独层的厚度不超过约1mm。

可以根据本领域技术人员已知的任何方法分离和收集上述乙烯受体。例如，乙烯受体的产生可以包括以下步骤：(1)在载体宿主中表达乙烯结合蛋白；(2)将载体宿主扩增至所需量；(3)从载体宿主中提取/分离所需蛋白。在一些实施例中，在能够被载体宿主表达的质粒内表达能够与乙烯结合的蛋白的基因序列。载体宿主通常是原核细胞，但也可能包括真核细胞。插入基因序列的质粒必须能够被载体宿主翻译。将质粒成功插入载体宿主后，扩增宿主。在细菌中，扩增通常涉及在肉汤溶液中培养细菌宿主约8至约12小时。将细菌宿主与肉汤孵育后，将所得细菌离心，然后进行蛋白分离方法。蛋白提取的方法可以是化学方法，通过去污剂方法，也可以是机械方法，如超声处理或热处理。蛋白提取的一种替代方法是将特异性标签(例如组氨酸标签)连接到质粒上，并使用色谱柱纯化带有组氨酸标签的蛋白质。分离和收集乙烯受体的其他方法在美国专利公开号2002/0012982A1和US20020127587A1；美国专利号4,431,739、4,366,246和3,585,179；以及在EP0001929B1和EP0001929A2中有所描述，其公开内容通过引用整体并入本文。

不希望受任何特定理论的束缚，据信当乙烯气体分子8与受体层5内的乙烯受体分子结合时，发生电子转移(参见图2A和2B，其中乙烯分子8与在受体层5内的乙烯受体结合)。在本公开的生物传感器的情况下，电子传递可以从受体层5传递至介体层6，并最终传递至电极7(参见图2A和2B)。进一步据信，多个结合事件产生电子运动，该电子运动可以测量为电压变化。所产生的电压变化可以与大气中乙烯的浓度线性相关。据信可以通过将乙烯传感器暴露于已知的乙烯气体浓度的标准并测量所得的电压输出来进行相关。例如，在一段时间内，可以使乙烯传感器暴露于以百万分之几增加的乙烯中，从而测量电压的变化。然后，这些数据点可用于估计线性方程，该线性方程将电压输出关联至与传感器的结合的乙烯并产生乙烯空气浓度。

可以根据本领域技术人员已知的任何方法来制造生物传感器10。在一些实施例中，将包含介体层的所需组分的溶液滴涂到电极7或经涂覆的电极7上。上文表1中描述了任何介体层6的组分以及这些组分相对于彼此的浓度。在沉积介体层6之后，可以将受体层5滴涂到介体层上。在一些实施例中，乙烯受体蛋白包含在缓冲溶液中，并且该缓冲溶液被施加到干燥的介体层5上以提供受体层6(在其干燥后)。受体溶液通常由pH范围为约7至约9的溶液组成，用于蛋白质的裂解。典型的裂解缓冲溶液包含约50至约100mM的Tris-HCl、约100至约300mM的NaCl、约1mM的二硫苏糖醇(DTT)或约1％的NP-40。另外，可以在蛋白质裂解后将蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂混合物添加到缓冲溶液中。表2列出了其他缓冲溶液。

表2列出了各种缓冲液及其对应的pKa值。本文所述的任何乙烯受体蛋白可与表2的任何缓冲液一起提供在溶液中。

本公开的另一方面是一种传感器单元20，其结合了本公开的一个或多个生物传感器10。如图3A和3B所示，传感器单元20可以耦合至控制器11，使得可以测量和/或记录由于乙烯与乙烯受体分子的结合而引起的电流变化。在一些实施例中，传感器单元20包括生物传感器10和控制器11，其中生物传感器10和控制器11设置在分开的壳体中(图3A)。替代地，传感器单元20包括生物传感器10和控制器11，其中生物传感器10和控制器11耦合在一起，例如在同一壳体内或两者都设置在芯片上。图3C示出了包括至少两个生物传感器10的传感器单元20，每个传感器独立地与控制器11通信。图3C示出了仅包括两个生物传感器10的传感器单元20，本领域技术人员将理解，可以将任何数量的生物传感器10耦合至单个控制器11，例如，3、4、5、10或更多个生物传感器。

在一些实施例中，控制器包括无线通信模块。在一些实施例中，无线通信模块被包括在控制器11内(即，在同一芯片或模块内)。在其他实施例中，参考图3D，无线通信模块12与控制器11分离。在一些实施例中，参考图3E，传感器单元20可以包括一个或多个生物传感器10；电源13；无线通信模块12；和模数转换器14。在一些实施例中，每个传感器单元20可以进一步包括存储模块，例如存储模块，如易失性(例如RAM等)和非易失性(例如ROM、闪存等)存储器，附加处理器或可编程电路、其他通信方式(例如有线网络通信)、计时器、振荡器、运动检测器、GPS模块、或任何其他辅助设备或电路。

在一些实施例中，多个传感器单元20可以彼此无线通信或者与网关30、服务器31、存储设备等无线通信(参见图4)。在一些实施例中，每个传感器单元20可以经由红外脉冲、无线电波、超声波或另一无线通信介质进行通信。在一些实施例中，无线通信通过标准协议进行，例如Zigbee网状网络、LoRaWAN、802.11WiFi或蓝牙。也可以使用专有的解决方案。无线通信协议通常将使用专门为此目的设计的集成电路或模块来实现。适用于此目的的模块包括由Digi International、Synapse Wireless、Motorola或Panasonic制造的模块。

在一些实施例中，传感器单元20具有用于彼此、与无线网关和/或与其他网络单元进行通信的装置，从而建立任何合适种类的传感器网络。传感器单元的网络(“传感器网络”)可以或多或少地组织起来，没有或有任何级别的中央控制。在一些实施例中，无线网关可以充当用于组织无线传感器的公共网络控制器，例如，通过在IP网络配置中分配IP地址。在一些实施例中，无线网关是网络单元，该网络单元在某种意义上利用传感器网络的各个传感器单元与一个或多个外部单元之间的访问。无线网关可以例如包括常规的无线网络网关硬件，用于在不同网络之间建立访问和路由，例如具有WiFi功能的无线传感器和Internet或任何其他网络，或例如GSM或其他蜂窝网络通信单元。因此，无线网关可以包括常规网关、访问点、路由器，网桥、网络地址分配或解析、安全控制器、Web服务器等中的一项或多项功能和任务。在一些实施例中，无线网关还执行从传感器网络的各个传感器单元收集并可能完善数据和信息的任务。

另外，无线网关30可以包括传感器单元20，或者它可以是完全专用于从所有传感器单元20收集数据的无传感器单元。无线网关30可以进一步包括定位装置，用于为其自身获取初始位置，例如通过GPS装置(如果位于生物质和重型建筑物或容器之外)是可行的。网关30还可以由用户手动地提供其位置，或者它可以简单地定义与传感器单元20有关的世界中心，即它们的定位网格中的原点或其他参考位置。

在一些实施例中，通过将生物传感器10暴露于固定浓度的乙烯来对其进行校准，并且测量电压。建立电压与乙烯浓度之间的线性关系，该线性关系可用于测量超出测试范围的乙烯浓度。

实例

通过质粒表达的乙烯受体基因，例如ETR1、ETR2或ETR3，被转化到细菌中。转化后，将细菌划线接种到琼脂平板上，孵育12-24小时后在表面上形成菌落。如果使用抗菌抗性质粒，则琼脂还应包含所选的抗生素。挑选菌落并测序以确保质粒DNA的正确插入。选择正确表达的菌落后，细菌在LB肉汤中扩增以获得所需的产量。通常，细菌在37摄氏度的2mL-1L肉汤中生长12-18小时。

在细菌生长之后，将细菌离心，并除去LB肉汤。用蛋白质提取剂处理细菌沉淀，并根据特定于所用试剂的方案进行蛋白质提取。如果蛋白质的浓度已知，则可以通过离心进行特异性蛋白质分离，也可以通过抗体pulldown方案进行，或者通过将质粒序列修改为包括特异性结合位点(例如聚组氨酸尾巴)，并使用亲和柱分离蛋白质。

将包括本文描述的组分的乙烯生物传感器(约200uL的约10％吡咯介体层和在约2平方英寸的铜电极上的约0.015mg/mm的拟南芥ETR1)置于标准大气条件下5L气密真空室中。由铝电极、吡咯介体和100ng蛋白质组成的生物传感器以约0.125ppm/sec的浓度暴露于乙烯中约375秒。在乙烯暴露期间连续测量传感器的电压输出(见图5)。电压输出与乙烯对生物传感器的线性暴露线性相关，从而在电压和乙烯浓度之间建立标准关系。这种相关性具有统计学意义，R平方值约为0.97。通过将乙烯暴露与电压输出相关联而产生的所得方程式可用于预测标准范围以外的乙烯浓度。此标准品在更大的乙烯浓度范围内重复使用，参见图6，该图分析了具有铜电极、约100uL吡咯介体和约100uL蛋白质的生物传感器的性能。该图支持更大范围的乙烯浓度下电压与乙烯浓度之间的线性关系。

在苹果的受控气氛存储中测试了传感器(约200uL的约5％吡咯介体和在约2平方英寸的铝电极上的约0.015mg/mm的拟南芥ETR1)。描述了2,000箱蜜脆苹果(honey crispapple)在1摄氏度、约2％O

序列表

<110> 斯特雷拉生物技术公司

K·K·斯佐夫

<120> 电化学乙烯生物传感器

<130> Strella-002WO

<150> US 62/674,639

<151> 2018-05-22

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 738

<212> PRT

<213> 拟南芥

<220>

<221> misc_feature

<223> 乙烯受体1 (ETR1)

<400> 1

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1 5 10 15

Leu Met Lys Tyr Gln Tyr Ile Ser Asp Phe Phe Ile Ala Ile Ala Tyr

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Phe Ser Ile Pro Leu Glu Leu Ile Tyr Phe Val Lys Lys Ser Ala Val

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Arg Thr Val Ala Leu Val Met Thr Thr Ala Lys Val Leu Thr Ala Val

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Leu Ser Val Lys Thr Arg Glu Leu Phe Leu Lys Asn Lys Ala Ala Glu

115 120 125

Leu Asp Arg Glu Met Gly Leu Ile Arg Thr Gln Glu Glu Thr Gly Arg

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His Val Arg Met Leu Thr His Glu Ile Arg Ser Thr Leu Asp Arg His

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Thr Ile Leu Lys Thr Thr Leu Val Glu Leu Gly Arg Thr Leu Ala Leu

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Leu Ser Tyr Thr Leu Arg His Gln His Pro Val Glu Tyr Thr Val Pro

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Ile Gln Leu Pro Val Ile Asn Gln Val Phe Gly Thr Ser Arg Ala Val

210 215 220

Lys Ile Ser Pro Asn Ser Pro Val Ala Arg Leu Arg Pro Val Ser Gly

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Ile Leu Lys Ser Ser Asn Leu Leu Ala Thr Leu Met Asn Asp Val Leu

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Asp Leu Ser Arg Leu Glu Asp Gly Ser Leu Gln Leu Glu Leu Gly Thr

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Phe Asp Val Lys Leu Gly Ile Ser Glu Arg Ser Asn Glu Ser Lys Gln

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Ser Gly Ile Pro Lys Val Pro Ala Ile Pro Arg His Ser Asn Phe Thr

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Gly Leu Lys Val Leu Val Met Asp Glu Asn Gly Val Ser Arg Met Val

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Arg Ile His Glu Lys Phe Thr Lys Gln Arg His Gln Arg Pro Leu Leu

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Val Ala Leu Ser Gly Asn Thr Asp Lys Ser Thr Lys Glu Lys Cys Met

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Ile Arg Asp Val Leu Ser Asp Leu Leu Glu Pro Arg Val Leu Tyr Glu

725 730 735

Gly Met

<210> 2

<211> 773

<212> PRT

<213> 拟南芥

<220>

<221> misc_feature

<223> 乙烯受体2 (ETR2)

<400> 2

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<210> 3

<211> 836

<212> PRT

<213> 水稻

<220>

<221> misc_feature

<223> 籼稻（大米）的乙烯受体3 (ETR3)

<400> 3

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Leu Leu Arg Ser Leu Ile Thr Trp Tyr Tyr Leu Glu Phe Met Pro Lys

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Leu Arg Pro Phe Tyr Phe Leu Phe Tyr Leu Thr Leu Pro Ser Cys Ala

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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Trp Ser Met Asp Ser Ile Phe

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Met Val Val Leu Leu Leu Thr Thr Ala Lys Phe Leu Thr Ala Leu Val

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Arg Val Lys Val Arg Glu Ser Leu Leu Trp Leu Lys Ala Arg Glu Leu

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Asp Arg Glu Val Val Leu Met Lys Arg Gln Glu Glu Ala Ser Trp His

245 250 255

Val Arg Met Leu Thr His Glu Ile Arg Lys Ser Leu Asp Arg His Thr

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Val Leu Tyr Thr Thr Leu Ile Glu Leu Ser Leu Val Leu Gly Leu Thr

275 280 285

Asn Cys Ala Val Trp Met Pro Ala Ala Gly Glu Met Cys Leu Thr His

290 295 300

Glu Leu Arg Arg Asp Gly Gly Gly Glu Asp Gly Val Val Gly Val Asp

305 310 315 320

Asp Ala Asp Val Val Glu Val Arg Gly Ser Asp Gly Val Lys Leu Leu

325 330 335

Gly Pro Asp Ser Val Leu Ala Ala Ala Ser Gly Gly Lys Glu Glu Gly

340 345 350

Thr Gly Ala Val Ala Ala Ile Arg Met Pro Met Leu Lys Val Ser Asp

355 360 365

Phe Lys Gly Gly Thr Pro Glu Val Ile Gln Thr Ser Tyr Ala Val Leu

370 375 380

Val Leu Val Pro Pro Ala Gly Lys Ser Trp Gly Arg His Glu Met Glu

385 390 395 400

Ile Val Glu Val Val Ala Gly Gln Val Ala Val Ala Leu Ser His Ala

405 410 415

Thr Leu Leu Glu Glu Ser Arg Ala Met Arg Asp Arg Leu Ala Glu Gln

420 425 430

Asn Arg Glu Leu Leu Gln Ala Arg Arg Asp Ala Leu Met Ala Asn Glu

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Ala Pro Glu Gln Arg Leu Val Val Asp Thr Met Ala Arg Thr Ala Thr

485 490 495

Val Val Ser Thr Leu Val Asn Asp Val Met Glu Met Ser Ala Asp Ser

500 505 510

Arg Glu Arg Phe Pro Leu Glu Thr Arg Pro Phe His Leu His Ala Met

515 520 525

Ile Arg Asp Ala Ala Cys Val Ala Arg Cys Leu Cys Asp Phe Arg Gly

530 535 540

Phe Gly Phe Ala Val His Val Glu Asn Ala Leu Pro Asp Leu Val Val

545 550 555 560

Gly Asp Glu Arg Arg Ile Phe His Val Leu Leu His Met Val Gly Asn

565 570 575

Leu Ile Gly Arg Thr Glu Pro Gly His Val Thr Leu Arg Val Arg Ala

580 585 590

Ala Asp Asp Asp Val Leu Asp Asp Arg Leu Gly Gln Arg Trp Asp Pro

595 600 605

Arg Trp Pro Ser Tyr Ser Thr Gly Tyr Ser Ser Val Lys Phe Val Ile

610 615 620

Gly Val Lys Arg Gln Gln Asn Gly Asp Ala Gly Ser Pro Leu Ser Arg

625 630 635 640

Arg Pro Ser Gly Lys Gly Ile Asp Leu Arg Leu Ser Phe Ser Met Cys

645 650 655

Arg Lys Leu Val Gln Met Met Gln Gly Asn Ile Trp Ala Ile Asn Asp

660 665 670

Pro Gln Gly Leu Pro Glu Ser Met Thr Leu Val Leu Arg Phe Gln Leu

675 680 685

Gln Ser Pro Leu Thr Ser Ser Ser Leu Gly Gly Ser Phe Glu Gln Lys

690 695 700

His Ser Ser Pro Ser Cys Gln Ile Ala Gly Leu Lys Val Leu Leu Ile

705 710 715 720

Asp Asp Asp Asp Asp Ile Asn Leu Val Val Ala Arg Lys Leu Leu Glu

725 730 735

Lys Leu Gly Cys Val Val Ser Ser Pro Pro Ser Gly Ser Gly Phe Leu

740 745 750

Ser Ser Val Gly Ser Ser Ala Ala Ala Phe Gln Leu Val Met Val Asn

755 760 765

Leu Glu Met Lys Arg Val Lys Ala Leu Asp Val Ala Thr Arg Ile Ser

770 775 780

Gln Tyr Arg Ser Gly Arg Trp Pro Ile Val Met Ala Met Ala Ser Asp

785 790 795 800

Gln Lys Ala Trp Glu Lys Cys Ala Gln Ser Gly Ile Asn Gly Ile Leu

805 810 815

Lys Lys Pro Val Ile Leu Gln Glu Leu Lys Asp Glu Leu Ala Arg Ile

820 825 830

Leu Gln Ser Thr

835

<210> 4

<211> 777

<212> PRT

<213> 水稻

<220>

<221> misc_feature

<223> 粳稻（大米）的乙烯受体4 (ETR4)

<400> 4

Met Ala Met Val Thr Ala Arg Gln Phe Leu Ala Ser Ala Ala Glu Leu

1 5 10 15

Gly Ser Gly Arg Arg Arg Cys Gly Gly Gly Gly Ala Cys Asp Met Arg

20 25 30

Glu Asp Gly Gly Val Glu Ala Leu Met Gln Cys Gln Arg Val Ser Asp

35 40 45

Leu Leu Ile Ala Ala Ser Phe Leu Ser Ile Pro Leu Glu Leu Phe Tyr

50 55 60

Phe Ala Thr Cys Ala Asp Leu Ser Glu Val Lys Cys Ala Val Leu His

65 70 75 80

Phe Cys Ala Phe Ile Val Leu Cys Gly Ala Thr His Leu Leu Ala Ala

85 90 95

Phe Thr His Ala His Pro His Ser Ala Pro Leu Leu Arg Ala Leu Thr

100 105 110

Ala Ala Lys Val Leu Ala Ala Val Ala Ser Ser Ala Ala Ala Val Ser

115 120 125

Leu Leu Thr Phe Ile Pro Lys Leu Leu Arg Ile Lys Val Arg Glu Ser

130 135 140

Leu Leu Arg Asp Lys Ala Ser Arg Leu His Arg Asp Leu Gly Leu Val

145 150 155 160

Arg Arg Arg Glu Glu Ala Thr Ser Arg Ala Val Arg Glu Leu Thr Gly

165 170 175

Arg Ile Arg Ala Ser Pro Pro Asp Ala His Ala Ile Leu Arg Thr Thr

180 185 190

Ala Leu Gln Leu Ala Asp Ala Leu Gly Leu His Ala Cys Ala Val Trp

195 200 205

Met Pro Ala Ala Gly Arg Pro His Asp Leu Val Leu Val His His Leu

210 215 220

Thr Ser Arg Pro Asp Asp Ala Ala Asp Leu Leu Leu Glu Val Gly Asp

225 230 235 240

Ala Cys Thr Val Ala Ala Asp Asp Pro Asp Val Val Asp Val Met Ala

245 250 255

Ser Lys Val Ala Lys Val Leu Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Met Ala

260 265 270

Ser Ser Val Gly Ala Ala Pro Ala Gly Ala Val Ala Ala Ile Arg Ile

275 280 285

Pro Ile Leu Arg Val Ser Ile Tyr Asp Gly Gly Gly Thr Pro Glu Val

290 295 300

Thr Glu Ala Ser Tyr Ala Ile Leu Val Leu Leu Leu Pro Pro His Asp

305 310 315 320

Ala Ala Gly Gly Trp Ser Ser His Asp Leu Glu Ile Val Gln Val Val

325 330 335

Ala Asp Gln Ala Ala Val Ala Leu Ser His Ala Ala Val Leu Glu Glu

340 345 350

Ser Arg Ser Met Arg Asp Arg Phe Ala Glu Gln His Arg Ala Leu Met

355 360 365

Gln Ala Lys His Arg Ala Ala Met Ala Thr Arg Ala Phe Ser Ser Ile

370 375 380

Gln Ser Ala Met Cys His Ala Met Arg Arg Pro Val His Ser Val Val

385 390 395 400

Gly Leu Val Ser Met Leu Gln His Pro Glu Ala Asp Thr Met Arg Pro

405 410 415

Glu Gln Arg Leu Ala Val Asp Ala Ile Ala Arg Thr Ser Asn Leu Leu

420 425 430

Ser Ala Leu Met Asp Glu Val Thr Val Asn Arg Gln His Leu Ser Val

435 440 445

Gln Arg Lys Pro Phe Ser Leu His Ala Leu Ile Lys Glu Ala Ile Ser

450 455 460

Val Ala Gly Cys Leu Ser His Cys Gly Gly Ala Gly Phe Leu His Gln

465 470 475 480

Pro Glu Cys Ala Leu Pro Glu Trp Val Val Gly Asp Glu Arg Arg Val

485 490 495

Phe His Leu Leu Leu Asp Met Val Gly Thr Leu Leu Asn Arg Cys Asn

500 505 510

Thr Gly Ser Gly Ala Cys Arg Leu Ser Phe Ser Val Arg Ile Cys Asn

515 520 525

Val Gly Glu Glu Arg Tyr Ser Leu Asp Trp Ile Pro Met Arg Pro Thr

530 535 540

Phe Ser Gly Cys Asn Val Cys Val Lys Phe Lys Val Gly Ile Gly Arg

545 550 555 560

Ser Arg Ser Cys Ala Ile Glu Arg Ser Leu Pro Cys Glu Leu Pro Arg

565 570 575

Arg Ser Ala Ala Thr Thr Ser Ser Gln Met Gly His Ile Phe Ser Gly

580 585 590

Tyr Phe Asn Lys Ile Val Gln Met Met Asn Gly Asn Met Trp Ser Ala

595 600 605

Ser Asp Ser Glu Gly Val Gly Glu Ser Val Thr Leu Ile Leu Gln Phe

610 615 620

Lys Leu Gln Gln Gly His Val Glu Ala Ser Pro Pro Tyr Ile Pro His

625 630 635 640

Leu Asn Gly Leu Arg Val Leu Leu Ala Asp Asp Asp Ala Met Asn Arg

645 650 655

Gly Val Thr Lys Lys Ile Leu Glu Arg Leu Gly Cys Gln Val Met Ser

660 665 670

Ala Pro Ser Gly Ala His Cys Leu Ser Leu Leu Ala Ser Ala Glu Ala

675 680 685

Ser Phe Gln Leu Val Val Leu Asp Leu Asp Asp Arg Ala Val Pro Ser

690 695 700

Ala Ala Met Asp Arg Phe Glu Val Ala Leu Arg Ile Arg Glu Leu Arg

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Asn Ser Cys Trp Leu Leu Ile Val Ile Ala Val Ala Ala Gly Val Val

725 730 735

Ala Thr Asp Asp Gly Gly Ala Val Gln Glu Leu Cys Gln Arg Ala Gly

740 745 750

Ile Asn Gly Leu Val Gln Lys Pro Val Thr Leu Pro Ala Leu Gly Ala

755 760 765

Gln Leu Cys Arg Val Leu Gln Asp Asn

770 775