拮抗性CD73抗体

摘要

本发明涉及CD73的新颖拮抗性抗体。本发明还涉及编码此类抗体分子的核酸；制备此类抗体分子的方法；表达或能够表达此类抗体分子的宿主细胞；包含此类抗体分子的组合物；以及此类抗体分子或此类组合物的用途，特别是用于癌症疾病领域中的治疗目的。

说明书

发明领域

本发明涉及新颖的CD73结合多肽。本发明还涉及编码此类多肽的核酸；制备此类多肽的方法；表达或能够表达此类多肽的宿主细胞；包含此类多肽的组合物；和此类多肽或此类组合物的用途，特别是用于癌症疾病领域中的治疗目的。

发明背景

癌症是以异常细胞生长为特征的疾病，其可能扩散至全身。在发达国家，其是死亡的第二最常见病因。男性中最常见的癌症类型是肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌和胃癌，且女性中的最常见类型是乳癌、结肠直肠癌、肺癌和子宫颈癌。尽管存活机会主要取决于癌症类型和鉴别阶段，但肺癌的整体10年存活率为约5％。

在过去，治疗癌症的最常见方式是经由手术、放射治疗或使用化学治疗药物。然而，近年来，已表明癌症免疫疗法可提供作为用于肿瘤学的治疗方式的远大前景。

癌症免疫疗法是活化免疫系统以攻击癌症的肿瘤学分支，其与直接切除或治疗肿瘤的现有常用治疗方法完全不同。此治疗概念是基于鉴别出T细胞表面上的诸多起到抑制这些细胞的免疫功能的作用的蛋白质。免疫疗法阻断此类抑制分子以增加免疫系统的活性或刺激涉及免疫效应细胞活化的路径。在这些蛋白质中，尤其列示CD73和PD-1。

分化簇73(CD73)还称为细胞外-5'-核苷酸酶(细胞外-5'NT，EC 3.1.3.5)，其是发现于大部分组织中、但尤其表达于内皮细胞和造血细胞亚组中的糖基-磷脂酰肌醇(GPI)连接的细胞表面酶(Resta等人，Immunol Rev 1998；161:95-109和Colgan等人，PurinergicSignal 2006；2:351-60)。

CD73是表达于癌细胞、基质细胞和肿瘤驻留免疫细胞上的细胞表面酶，其将AMP转化成腺苷和无机磷酸盐。腺苷具有免疫抑制性且能够影响若干免疫细胞类型的功能。腺苷对免疫抑制细胞(例如调控性T细胞、MDSC和M2巨噬细胞)具有活化作用且对效应细胞(例如树突状细胞、效应T细胞和NK细胞)具有抑制作用。中和性CD73抗体可通过阻断酶活性和/或通过减小CD73细胞表面水平来抑制CD73功能。这将减少免疫抑制性腺苷且由此增加T细胞活性。

双重阻断CD73和免疫检查点(包括PD1和可能的其他免疫检查点)可进一步恢复T细胞功能性，从而与PD1单一疗法相比改善癌症患者中的客观反应并延长整体存活。

已经报道CD73在许多不同癌症上表达，包括结肠癌、肺癌、胰脏癌、卵巢癌、膀胱癌、白血病、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、黑色素瘤、甲状腺癌、食道癌、前列腺癌和乳癌(Jin等人，Cancer Res 2010；70:2245-55和Stagg等人，PNAS 2010；107:1547-52)。此外，癌症中的CD73表达与诸多肿瘤适应症(尤其胃肠道肿瘤、乳房肿瘤和NSCLC肿瘤)中的较短整体存活相关(Wang等人，Prognostic value of CD73-adenosinergic pathway in solidtumor:A meta-analysis and systematic review,Oncotarget 2017；Inoue等人，Prognostic impact of CD73 and A2A adenosine receptor expression in non-small-cell lung cancer,Oncotarget 2017)。还已提出将CD73活性作为乳头状甲状腺癌中的预后标记。通过生成免疫抑制性腺苷，CD73在免疫细胞上具有广泛功能且在肿瘤内产生免疫抑制性微环境。腺苷强力抑制T细胞应答，例如增殖、细胞毒性和细胞因子产生。另外，腺苷改变了树突状细胞的分化，由此损害T细胞应答。腺苷还作用于NK细胞，从而抑制其细胞毒性功能。另外，腺苷对免疫抑制细胞类型具有刺激作用。腺苷会引起免疫抑制性MDSC的扩增和巨噬细胞至抑制性M2表型的分化。(Antonioli等人，Immunity,inflammation andcancer:a leading role for adenosine.Nature Reviews Cancer 2013；Beavis等人，CD73:A potent suppressor of antitumor immune responses,Trends in Immunology,2012)。除对免疫细胞的作用外，CD73还可用于调控细胞-细胞和细胞-基质相互作用以及血管生成。腺苷还可直接作用于癌细胞并调控细胞生长以及细胞凋亡且与药物抗性有关(Hunsucker等人，Pharmacol Ther 2005；1:1-30)。因此，CD73可直接和间接调控癌症进展，此突出显示了其作为新颖治疗靶标的潜力。Allard等人已报导，靶向CD73增强抗PD-1和抗CTLA-4mAb的抗肿瘤活性(Clin Cancer Res 2013；19:5626)。

靶向相同路径的其他药剂包含A2AR拮抗剂。然而，由于腺苷受体过多，可预期A2AR拮抗剂相对于CD73抑制剂不能完全防止腺苷介导的活性。

不可水解性ADP类似物腺苷5′-(α,β-亚甲基)二磷酸盐(APCP)是CD73酶活性的抑制剂且市面有售。AB421是由Arcus Biosciences开发的小分子CD73抑制剂。

WO 2016/075099公开了抗CD73结合分子，例如抗体和其抗原结合片段(包括MEDI9447抗体)。MEDI9447通过抑制CD73的酶活性以水解单磷酸腺苷(AMP)且通过诱导CD73内化来降低CD73功能。

WO 2016/081748公开了抑制人CD73的酶活性的抗体和使CD73内化至细胞中的抗体(包括BMS 986179抗体)。

本发明的目标是提供可用于治疗若干癌症疾病的经改善的药理学活性剂。

具体而言，本发明的目标是提供与当前使用和/或本领域已知的药剂、组合物和/或方法相比提供某些优点的此类药理学活性剂、组合物和/或治疗方法。这些优点包括体内功效、改善的治疗和药理学性质、较少副效应和其他有利性质(例如改善的制备便利性或减小的产品成本)，尤其是与本领域已知的候选药物相比。

发明概述

根据第一方面，提供抗CD73抗体分子。如本文进一步所述的，本发明的抗CD73抗体分子较其他抗CD73抗体具有令人吃惊且有利的性质。举例而言，其显示经改善的逆转AMP介导的T细胞抑制的能力(例如如通过较高T细胞增殖水平和较强IFNγ分泌诱导所证实)。已知IFNγ是由T细胞介导的抗肿瘤应答的关键因子(Tannenbaum,C.和Hamilton,T.Immune-inflammatory mechanisms in IFNγ-mediated anti-tumor activity,Seminars inCancer Biology,2000)。另外，与先前技术的抗CD73抗体相比，本文所述的抗CD73抗体表现出改善的CD73抑制。本发明的抗体同等程度地抑制细胞结合性CD73以及非细胞结合性CD73。与参考抗CD73抗体相比，本发明的抗CD73抗体表现出改善的腺苷生成抑制。另外，其对人CD73具有高亲和力。

还提供编码抗CD73抗体分子的核酸分子、表达载体、宿主细胞和制备本发明的抗CD73抗体分子的方法。还提供包含本发明的抗CD73抗体分子的药物组合物。本文所公开的抗CD73抗体分子可用于治疗癌性病症，包括实体肿瘤和软组织肿瘤。

更具体而言，本发明的抗CD73抗体分子包含：

(a)重链CDR，其包含SEQ ID NO:25(hcCDR1)、SEQ ID NO:26(hcCDR2)和SEQ IDNO:27(hcCDR3)的氨基酸序列；和轻链CDR，其包含SEQ ID NO:28(lcCDR1)、SEQ ID NO:29(lcCDR2)和SEQ ID NO:30(lcCDR3)的氨基酸序列；或

(b)重链CDR，其包含SEQ ID NO:31(hcCDR1)、SEQ ID NO:32(hcCDR2)和SEQ IDNO:33(hcCDR3)的氨基酸序列；和轻链CDR，其包含SEQ ID NO:34(lcCDR1)、SEQ ID NO:35(lcCDR2)和SEQ ID NO:36(lcCDR3)的氨基酸序列；或

(c)重链CDR，其包含SEQ ID NO:37(hcCDR1)、SEQ ID NO:38(hcCDR2)和SEQ IDNO:39(hcCDR3)的氨基酸序列；和轻链CDR，其包含SEQ ID NO:40(lcCDR1)、SEQ ID NO:41(lcCDR2)和SEQ ID NO:42(lcCDR3)的氨基酸序列；或

(d)重链CDR，其包含SEQ ID NO:43(hcCDR1)、SEQ ID NO:44(hcCDR2)和SEQ IDNO:45(hcCDR3)的氨基酸序列；和轻链CDR，其包含SEQ ID NO:46(lcCDR1)、SEQ ID NO:47(lcCDR2)和SEQ ID NO:48(lcCDR3)的氨基酸序列；或

(e)重链CDR，其包含SEQ ID NO:49(hcCDR1)、SEQ ID NO:50(hcCDR2)和SEQ IDNO:51(hcCDR3)的氨基酸序列；和轻链CDR，其包含SEQ ID NO:52(lcCDR1)、SEQ ID NO:53(lcCDR2)和SEQ ID NO:54(lcCDR3)的氨基酸序列；或

(f)重链CDR，其包含SEQ ID NO:55(hcCDR1)、SEQ ID NO:56(hcCDR2)和SEQ IDNO:57(hcCDR3)的氨基酸序列；和轻链CDR，其包含SEQ ID NO:58(lcCDR1)、SEQ ID NO:59(lcCDR2)和SEQ ID NO:60(lcCDR3)的氨基酸序列；或

(g)重链CDR，其包含SEQ ID NO:61(hcCDR1)、SEQ ID NO:62(hcCDR2)和SEQ IDNO:63(hcCDR3)的氨基酸序列；和轻链CDR，其包含SEQ ID NO:64(lcCDR1)、SEQ ID NO:65(lcCDR2)和SEQ ID NO:66(lcCDR3)的氨基酸序列；或

(h)重链CDR，其包含SEQ ID NO:67(hcCDR1)、SEQ ID NO:68(hcCDR2)和SEQ IDNO:69(hcCDR3)的氨基酸序列；和轻链CDR，其包含SEQ ID NO:70(lcCDR1)、SEQ ID NO:71(lcCDR2)和SEQ ID NO:72(lcCDR3)的氨基酸序列。

根据本发明的另一方面，还提供治疗癌症的方法。在一实施方案中，本发明的抗CD73抗体分子可与第二治疗剂(例如PD-1拮抗剂)组合使用。在一些实施方案中，所述第二治疗剂(例如PD-1拮抗剂)待与抗CD73抗体分子同时、并行、依序、连续、交替或分开施用。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是抗PD-1抗体或抗PDL-1抗体。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是选自由以下组成的组的抗PD-1抗体：PDR-001、派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)和匹利珠单抗(pidilizumab)。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是选自由以下组成的组的抗PDL-1抗体：阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)和度伐单抗(durvalumab)。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是选自由以下组成的组的抗PD-1抗体：PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4和PD1-5。

本发明的这些方面的其他实施方案包括其中可组合使用本发明的此类抗体分子与第三治疗剂。

涉及本发明的抗体分子的其他方面、实施方案、用途和方法自本发明的下列详述和所附的权利要求书可显而易见。

本发明提供允许更有效地治疗若干癌症类型(包括肺癌(例如非小细胞肺癌NSCLC)、多种胃肠道癌(例如结肠癌、胃癌、肝细胞癌)和肾癌(例如肾细胞癌，例如透明细胞癌))的新颖抗体分子。

附图简述

图1：树突状细胞/T细胞共培养。数据(如实施例7中进一步所述的)阐释，AMP在树突状细胞/T细胞共培养测定中抑制抗PD1应答，且抗CD73抗体处理导致逆转此AMP介导的抑制。

图2：抗CD73抗体和CD73的复合物形成。描绘了CD73和两种抗CD73抗体的复合物的寡聚状态的评定(如实施例9中所述的)。根据本发明的抗CD73抗体分子与可溶性CD73形成具有界定大小的抗原-抗体复合物(例如2:2寡聚物)。这些复合物小于由本领域已知的其他CD73抗体(例如“MEDI9447”)形成的复合物。

图3：抗CD73抗体-CD73晶体的晶体结构

(A)描绘了本发明的抗CD73抗体的Fab片段与CD73上的其构象表位的结合。以黑色描绘与本发明的抗CD73抗体的Fab片段接触和/或特异性结合的残基；将Fab片段的V

图4：人T细胞测定中的IFNγ释放

在多个αCD73抗体浓度下处理经刺激的原代人T细胞，随后添加AMP。测量IFNγ的增殖和释放的诱导。如实施例6中所概述的进行测定。

发明详述

定义

根据本文的进一步阐述，本发明的上述和其他方面以及实施方案将变得清楚。

除非另外指示或定义，否则所使用的所有术语均具有本领域技术人员所清楚的本领域常用含义。举例而言，可提及标准手册(例如Sambrook等人，“Molecular Cloning:ALaboratory Manual”(第2版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Lewin,“Genes IV”,Oxford University Press,New York,(1990)；和Roitt等人，“Immunology”(第2版),Gower Medical Publishing,London,New York(1989))以及本文所引用的一般背景技术。另外，除非另外指示，否则可实施且以本身已知的方式实施且未明确详细阐述的所有方法、步骤、技术和操纵，如技术人员所清楚的。例如，还可参考标准手册、上文所提及的一般背景技术和其中所引用的其他参考文献。

如本文中所使用，冠词“一(a和an)”是指一个或一个以上(例如至少一个)的该冠词的语法词。在用于本文中时，术语“包含(comprising)”和其变化形式(例如“包含(comprises和comprise)”)可分别经术语“含有(containing)”或“包括(including)”或“具有(having或has)”代替，且反之亦然。

“抗体分子”或“抗体”(在本文中同义使用)是可在脊椎动物的血液或其他体液中发现的γ球蛋白，且通过免疫系统用于鉴别和中和外来物体(例如细菌和病毒)。其通常由基本结构单元(各自具有两条大重链和两条小轻链)构成以形成(例如)具有一个单元的单体、具有两个单元的二聚体或具有五个单元的五聚体。抗体分子可通过非共价相互作用结合至称为抗原的其他分子或结构。在抗体分子仅以高亲和力结合至特定结构的意义上，此结合是特异性的。由抗体分子识别的独特抗原部分称为表位或抗原决定簇。结合至表位的抗体分子部分有时称为互补位，其是抗体结构内与抗原发生特异性相互作用的分子决定簇；和抗体的由CDR构成的所谓的可变结构域或可变区(Fv)。互补位可完全或部分包含给定抗体的重链、轻链或重链和轻链二者的CDR。可变结构域包含三个由框架区(FR)间隔的所谓的互补决定区(CDR)。

已知术语“互补决定区”和“CDR”在本领域是指抗体可变区内的氨基酸的非连续序列，其赋予抗原特异性和结合亲和力。一般而言，在每一重链可变区中存在三个(3)CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)且在每一轻链可变区中存在三个(3)CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。

可使用诸多已知方案中的任一者来测定给定CDR的氨基酸序列边界，包括由以下文献所阐述的方案：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”，第5版，Public Health Service，国立卫生研究院(National Institutes ofHealth),Bethesda,Md.(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography”，J.Mol.Biol.262,732-745。(“接触”编号方案)；Lefranc M P等人，“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains”，Dev Comp Immunol，2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”或“CCG”编号方案)；和Honegger A和Pltickthun A,“Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool”，JMol Biol,2001Jun.8；309(3):657-70,(AHo编号方案)。

给定CDR的边界可根据命名惯例变化。可(例如)根据Kabat编号系统来定义分配至CDR和FR的氨基酸位置，其中VH框架区(FR)和CDR的定位如下：残基1-30(FR1)、31-35(CDR1)、36-49(FR2)、50-65(CDR2)、66-94(FR3)、95-102(CDR3)和103-113(FR4)。同样，根据Kabat编号系统，VL FR和CDR的定位如下：残基1-23(FR1)、24-34(CDR1)、35-49(FR2)、50-56(CDR2)、57-88(FR3)、89-97(CDR3)和98-107(FR4)。

或者，已定义IMGT或CCG独特编号以比较可变结构域，不论抗原受体、链类型或物种如何(Lefranc,M.-P.,Pommié,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V.和Lefranc,G.,“IMGT unique numbering for immunoglobulin andT cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains”Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003))。在IMGT独特编号中，保守氨基酸总是具有相同位置，例如半胱氨酸23(1st-CYS)、色氨酸41(保守-TRP)、疏水性氨基酸89、半胱氨酸104(2nd-CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118(J-PHE或J-TRP)。IMGT独特编号提供框架区(FR1-IMGT：位置1至26，FR2-IMGT：39至55，FR3-IMGT：66至104和FR4-IMGT：118至128)和互补决定区(CDR1-IMGT：27至38，CDR2-IMGT：56至65和CDR3-IMGT：105至117)的标准化定界。

在本发明的上下文中，CDR的提及是基于CCG/IMGT惯例的定义，然而，本公开并不限于如由任一编号系统所定义的FR和CDR，但包含所有编号系统(包含上文所论述的)。

因此，除非另外指定，否则术语给定抗体或其区域(例如可变区)的“CDR”和“互补决定区”以及抗体或其区域的个别CDR(例如CDR-H1、CDR-H2)和框架区(FR)应为理解涵盖如由上述任一已知方案所定义的各自区域(例如互补决定区)。在一些情况下，指定鉴别一或多个特定CDR的方案，例如如由Kabat、Chothia、IMGT、AHO或本领域已知的其他方法所定义的CDR。在其他情况下，给定CDR的特定氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体分子具有选自(例如)IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区的重链恒定区；特别是，重链恒定区是选自(例如)IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的(例如人)重链恒定区。在另一实施方案中，抗体分子具有选自(例如)κ或λ的(例如人)轻链恒定区的轻链恒定区。可改变(例如突变)恒定区以修改抗体的性质(例如增加或减少以下中的一者或多者：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能和/或补体功能)。在一些实施方案中，抗体具有效应功能且可固定补体。在其他实施方案中，抗体并不招募效应细胞或固定补体。在某些实施方案中，抗体具有降低的或不具结合Fc受体的能力。举例而言，其可为同种型或亚型、片段或其他突变体，此并不支持与Fc受体的结合，例如其具有诱变或缺失的Fc受体结合区。

抗体恒定区在一些实施方案中发生改变。用于改变抗体恒定区的方法为本领域已知。功能改变、例如对效应配体(例如细胞上之FcR或补体的C1组分)的亲和力改变的抗体可通过使用不同残基代替抗体恒定部分中的至少一个氨基酸残基来产生(参见例如EP 388,151A1、美国专利第5,624,821号和美国专利第5,648,260号，此类所有专利的内容均以引用方式并入本文中)。如果应用于鼠类或其他物种免疫球蛋白，则可阐述将降低或消除这些功能的类似变化类型。在一实施方案中，抗体包含L234A和/或L235A突变(Kabat命名)，此类突变对应于本文所述的示例性抗体的实际编号中的位置L232A和L233A。在一实施方案中，抗体是人IgG1。

本发明的多肽可具有经修饰的N-末端序列(例如缺失一或多个N-末端氨基酸或交换(例如)第一N-末端氨基酸(例如谷氨酸至丙氨酸))以优化用于以下的分子：通过使用某些表达系统(例如特定载体或宿主细胞)表达，或以包涵体或可溶性形式表达，或分泌至培养基或周质空间中，或含于细胞内，或产生更均质产物。本发明的多肽可具有经修饰的C-末端序列(例如额外的丙氨酸和/或C-末端部分中或任一框架区内的其他定义位置处的其他氨基酸交换或缺失，如例如在WO2012/175741、WO2011/075861或WO2013/024059中所阐释)以(例如)进一步增强此类多肽的稳定性或降低其免疫原性。

在本文中可互换使用的术语“可变区”或“可变结构域”可意指抗体分子中基本上由4个“框架区”(其在本领域和下文中分别称为“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”和“框架区4”或“FR4”)组成的区域，此类框架区被三个“互补决定区”或“CDR”(其在本领域和下本文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”和“互补决定区3”或“CDR3”)中断。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可指示如下：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变结构域通过携载抗原结合位点来赋予抗体对抗原的特异性。

术语“可变重链(或VH)”和“可变轻链(或VL)”是指分别来自抗体分子的重链或轻链的可变结构域。因此，分别地，重链(HC)的CDR称为“HCDR”，且轻链(LC)的CDR称为“LCDR”。

本领域已进一步开发了抗体分子且使其成为医学和技术中的万能工具。因此，在本发明的上下文中，术语“抗体分子”或“抗体”不仅包括可在自然界中发现的包含(例如)两条轻链和两条重链的抗体，且另外涵盖所有包含至少一个对抗原具有结合特异性的互补位且与抗体分子的可变结构域具有结构类似性的分子。

因此，根据本发明的抗体分子包含单克隆抗体、人抗体或人源化抗体。

还涵盖嵌合抗体、抗体片段(尤其Fv、Fab、Fab’或F(ab’)

单克隆抗体(mAb)是氨基酸序列同一的单特异性抗体。它们可通过杂交瘤技术从杂交细胞系(称为杂交瘤)产生，该杂交细胞代表产生特异性抗体的B细胞与骨髓瘤(B细胞癌)细胞的融合体的克隆(Kohler G,Milstein C.Continuous cultures of fused cellssecreting antibody of predefined specificity.Nature 1975；256:495-7.)。或者，可通过在宿主细胞中重组表达产生单克隆抗体(Norderhaug L,Olafsen T,Michaelsen TE,Sandlie I.(1997年5月).“Versatile vectors for transient and stable expressionof recombinant antibody molecules in mammalian cells”,J Immunol Methods 204(1):77-87。“重组抗体”是通过重组工程化的宿主细胞产生的抗体。其任选地经分离或纯化。

为应用于人类中，通常期望降低最初衍生自其他物种(如小鼠)的抗体的免疫原性。此可通过构建嵌合抗体或通过称为“人源化”的过程来完成。在此背景中，“嵌合抗体”应理解为包含衍生自一种物种(例如小鼠)的序列部分(例如可变结构域)和衍生自不同物种(例如人类)的序列部分(例如恒定结构域)且此两种序列部分融合的抗体。“人源化抗体”是包含最初衍生自非人类物种的可变结构域的抗体，其中某些氨基酸已发生突变以使得该可变结构域的整体序列更接近类似于人可变结构域的序列。抗体的嵌合化和人源化的方法在本领域已众所周知(Billetta R,Lobuglio AF.“Chimeric antibodies”.Int RevImmunol.1993；10(2-3):165-76；Riechmann L,Clark M,Waldmann H,Winter G(1988).“Reshaping human antibodies for therapy”.Nature:332:323.)。

“人源化”抗体是指包含来自非人高可变区(HVR)的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有中的至少一个且通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如互补决定区(CDR))对应于非人抗体的HVR，且所有或基本上全部的框架区(FR)对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”(例如非人抗体)是指已经受人源化的抗体。

另外，已开发用于基于衍生自人类基因组的序列来产生抗体的技术，例如通过噬菌体展示或使用转基因动物(WO 90/05144；D.Marks,H.R.Hoogenboom,T.P.Bonnert,J.McCafferty,A.D.Griffiths和G.Winter(1991)“By-passing immunisation.Humanantibodies from V-gene libraries displayed on phage”.J.Mol.Biol.,222,581-597；Knappik等人，J.Mol.Biol.296:57-86,2000；S.Carmen和L.Jermutus,“Concepts inantibody phage display”.Briefings in Functional Genomics and Proteomics 20021(2):189-203；Lonberg N,Huszar D.“Human antibodies from transgenic mice”.IntRev Immunol.1995；13(1):65-93；Brüggemann M,Taussig MJ.“Production of humanantibody repertoires in transgenic mice”.Curr Opin Biotechnol.1997Aug；8(4):455-8.)。在本发明的上下文中，此类抗体是“人抗体”。

还涵盖保留抗原结合性质的分子片段，如Fab、Fab’或F(ab’)

已开发了诸多技术来将抗体分子的可变结构域或衍生自此类可变结构域的分子置于不同分子背景中。一般而言，这些抗体分子的大小小于天然抗体分子，且可包含单一氨基酸链或若干个氨基酸链。举例而言，单链可变片段(scFv)是抗体分子的重链和轻链的可变区经短接头(通常为丝氨酸(S)或甘氨酸(G))连接在一起的融合体(WO 88/01649；WO 91/17271；Huston等人，International Reviews of Immunology，第10卷，1993,195-217)。“单一结构域抗体”或“纳米抗体”在单一Ig样结构域中具有抗原结合位点(WO 94/04678；WO03/050531；Ward等人，Nature.1989Oct 12；341(6242):544-6；Revets等人，Expert OpinBiol Ther.5(1):111-24,2005)。对相同或不同抗原具有结合特异性的一或多个单一结构域抗体可连接至一起。双抗体是由两条包含两个可变结构域的氨基酸链组成的二价抗体分子(WO 94/13804；Holliger等人，Proc Natl Acad Sci U S A.1993Jul 15；90(14):6444-8)。抗体样分子的其他实例是免疫球蛋白超家族抗体(IgSF；Srinivasan和Roeske,CurrentProtein Pept.Sci.2005,6(2):185-96)。不同概念产生所谓的小模块免疫药物(SMIP)，其包含连接至单链铰链的Fv结构域和不含恒定结构域CH1的效应结构域(WO 02/056910)。

抗体分子可融合(呈融合蛋白形式)或以其他方式连接(通过共价或非共价键)至对抗体分子的性质具有期望影响的其他分子实体。举例而言，可期望改善抗体分子的药代动力学性质、在(例如)体液(例如血液)中的稳定性，尤其在单链抗体或单一结构域抗体的情况下。已由此开发了尤其用以延长此类抗体分子在循环中的半衰期的诸多技术，例如聚乙二醇化(WO 98/25971；WO 98/48837；WO 2004081026)，使抗体分子融合或以其他方式共价附接至对血清蛋白(如白蛋白)具有亲和力的另一抗体分子(WO 2004041865；WO2004003019)，或使抗体分子表达为具有所有或一部分血清蛋白(如白蛋白或转铁蛋白)的融合蛋白(WO 01/79258)。

可互换使用的术语“表位”和“抗原决定簇”是指大分子(例如多肽)中由抗原结合分子(例如本发明的抗体分子)和更特定而言由所述分子的抗原结合位点识别的部分。表位定义抗体分子的最小结合位点，且由此代表抗体分子的特异性靶标。表位可进一步定义为结构表位或功能表位。“结构表位”由与通常由结构揭示的抗体紧密接触的区域中的氨基酸或其他分子组成。“功能表位”定义为对结合作出能量贡献的那些分子部分，其中在其改变时结合亲和力将有所降低。因此，与互补位接触的残基和有助于亲和力的残基(不论其是否邻近)是定义表位时的重要考虑因素。X射线结晶学是一种以测定抗体与其抗原之间的相互作用的精确位点的方法。晶体结构使得能够准确测定来自表位和互补位中的侧链和主链原子的个别氨基酸之间的关键相互作用。彼此在4.5埃内的氨基酸通常视为接触残基。

可“结合”、“结合至”、“特异性结合”或“特异性结合至”某一表位、抗原或蛋白质(或其至少一个部分、片段或表位)、“对其具有亲和力”和/或“对其具有特异性”的抗体分子称为“抵抗”或“针对”所述表位、抗原或蛋白质，或是涉及此类表位、抗原或蛋白质的“结合”分子。

通常，术语“特异性”是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变结构域)可结合诸多不同类型的抗原或表位。可基于亲和力和/或亲合力来测定抗原结合蛋白的特异性。亲和力(由抗原与抗原结合蛋白的解离的平衡常数(K

通常，抗原结合蛋白(例如本发明的抗体分子)以10E-5至10E-14摩尔/升(M)或更小和优选地10E-7至10E-14摩尔/升(M)或更小、更优选地10E-8至10E-14摩尔/升和甚至更优选地10E-11至10E-13的解离常数(K

可通过称为亲和力成熟的过程来增强抗体分子的结合亲和力(Marks等人，1992,Biotechnology 10:779-783；Barbas,等人，1994,Proc.Nat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813；Shier等人，1995,Gene 169:147-155)。亲和力成熟抗体由此还涵盖于本发明中。

举例而言，本发明的抗体的亲和力成熟可改变引入至框架和/或CDR区中的一个或多个氨基酸，这可改善对抗原的结合亲和力但并不改变抗体对其表位的特异性。因此，本发明的实施方案包含(例如)包含以下的特异性结合至CD73的抗体：与SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ IDNO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％氨基酸序列同一性的重链可变区和与SEQ IDNO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ IDNO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％氨基酸序列同一性的轻链可变区。举例而言，本发明的亲和力成熟抗体可包含如上文所公开的包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代(其中氨基酸取代可为保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代)的轻链可变区和/或如上文所公开的包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代(其中氨基酸取代可为保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代)的重链可变区。

举例而言，本发明还涵盖本发明的抗体序列中的突变，此类突变可包含取代、缺失(包含内部缺失)、添加(包含产生融合蛋白的添加)或氨基酸序列内和/或附近的氨基酸残基的保守取代，其不产生功能(“沉默”)变化，该变化会产生在功能上等效的抗CD73抗体)。此类变化可(例如)包含保守氨基酸取代，此类取代可基于所涉及残基在以下方面中的相似性来进行：极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性特性。举例而言，非极性(疏水性)氨基酸包含丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包含甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰氨和谷氨酰胺；带正电荷(碱性)氨基酸包含精氨酸、赖氨酸和组氨酸；且带负电荷(酸性)氨基酸包含天冬氨酸和谷氨酸。另外，甘氨酸和脯氨酸是可影响链定向的残基。非保守取代使得需要交换这些种类中的一种的成员与另一种类的成员。

在一实例中，本发明涉及具有增强的效应功能的抗CD73抗体以及其经改变/突变的衍生物，此类衍生物包含(但不限于)表现出改变的结合特性(例如改变的缔合常数k

本文所公开的组合物和方法涵盖具有所指定序列或与其基本上同一或类似的序列、例如与所指定序列至少85％、90％、95％同一或更高的序列的多肽和核酸。在氨基酸序列的背景下，术语“基本上同一”在本文中用于是指第一氨基酸含有足够或最少数量的i)与第二氨基酸序列中的所比对氨基酸残基同一的氨基酸残基，或ii)第二氨基酸序列中的所比对氨基酸残基的保守取代，使得第一和第二氨基酸序列可具有共有结构结构域和/或共有功能活性。举例而言，与参考序列(例如本文所提供的序列)具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的含有共有结构结构域的氨基酸序列。在核苷酸序列的背景下，术语“基本上一致”在本文中用于是指第一核酸序列含有足够或最少数量的与第二核酸序列中的所比对的核苷酸同一的核苷酸，使得第一和第二核苷酸序列编码具有共有功能活性的多肽或编码共有结构多肽结构域或共有功能多肽活性。举例而言，与参考序列具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。

在两个或更多个核酸或多肽序列的背景中，术语“同一”或“同一性百分比”是指，两个或更多个序列或子序列在比较和比对最大一致性时相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基。为测定同一性百分比，出于最佳对比目的来比对序列(举例而言，可将空位引入第一氨基酸或核酸序列中以用于与第二氨基酸或核酸序列进行最佳对比)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当在第一序列中的位置由与第二序列中的相应位置处相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则此类分子在该位置同一。两个序列之间的同一性％是此类序列所共有的同一位置数的函数(即，同一性％＝同一位置数/总位置(例如重叠位置)数×100)。在一些实施方案中，所比较的两个序列在视需要(例如不包括延伸出所比较序列外的额外序列)于序列内引入空位后长度相同。举例而言，在比较可变区序列时，不考虑前导序列和/或恒定结构域序列。在两个序列之间的序列对比中，“相应”CDR是指两个序列中相同位置的CDR(例如每一序列的CDR-H1)。

可使用数学算法来测定两个序列之间的同一性百分比或类似性百分比。用于对比两个序列的数学算法的优选非限制性实例是Karlin和Altschul的算法(1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268)，其根据Karlin和Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877加以修改。此算法已并入Altschul等人1990,J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST和XBLAST程序中。可使用NBLAST程序(评分＝100，字长＝12)来实施BLAST核苷酸检索以获得与编码感兴趣的蛋白质的核酸同源的核苷酸序列。可使用XBLAST程序(评分＝50，字长＝3)来实施BLAST蛋白质检索以获得与感兴趣的蛋白质同源的氨基酸序列。为获得空位比对以用于比较目的，可如Altschul等人，1997,NucleicAcids Res.25:3389-3402中所述利用空位BLAST。或者，可使用PSI-Blast来实施迭代检索以检测分子之间的远距离关系(同一文献)。在利用BLAST、空位BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的预设参数。用于比较序列的数学算法的另一优选非限制性实例是Myers和Miller的算法(CABIOS，1989)。此算法已并入ALIGN程序(2.0版)中，其是GCG序列比对软件包的一部分。在利用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可使用PAM120加权残差表、等于12的空位长度罚分和等于4的空位罚分。用于序列分析的其他算法为本领域已知且包括ADVANCE和ADAM，如Torellis和Robotti,1994,Comput.Appl.Biosci.10:3-5中所述；和FASTA，如Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-8中所述。在FASTA内，ktup是设定检索灵敏度和速度的控制选项。若ktup＝2，则通过检查比对残基对来发现所比较的两个序列中的类似区域；若ktup＝1，则检查单一比对的氨基酸。对于蛋白质序列而言，可将ktup设定为2或1，或对于DNA序列设定为1至6。若未指定ktup，则对于蛋白质而言默认值为2且对于DNA而言默认值为6。或者，可使用CLUSTAL W算法来实施蛋白质序列比对，如由Higgins等人，1996,MethodsEnzymol.266:383-402所述的。

根据标准三字母或单字母氨基酸密码来指示氨基酸残基，如本领域通常所知并认可的。在比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与第二序列相比在参考序列的某一位置处的指示数量的氨基酸残基的插入、缺失或取代。在取代的情况下，此类取代优选为保守氨基酸取代，这意指氨基酸残基由具有类似化学结构且对多肽之功能、活性或其他生物性质具有极小或基本上无影响的另一氨基酸残基代替。此类保守氨基酸取代已为本领域(例如)自WO1998/49185所熟知，其中保守氨基酸取代优选是以下组(i)-(v)中的一个氨基酸由同一组中的另一氨基酸残基取代的取代：(i)较小脂肪族、非极性或轻微极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(ii)极性、带负电荷的残基和其(不带电荷)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gin；(iii)极性、带正电荷的残基：His、Arg和Lys；(iv)较大脂肪族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；和(v)芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。特别优选的保守氨基酸取代如下：Ala取代为Gly或取代为Ser；Arg取代为Lys；Asn取代为Gln或取代为His；Asp取代为Glu；Cys取代为Ser；Gln取代为Asn；Glu取代为Asp；Gly取代为Ala或取代为Pro；His取代为Asn或取代为Gln；lle取代为Leu或取代为Val；Leu取代为lle或取代为Val；Lys取代为Arg、取代为Gln或取代为Glu；Met取代为Leu、取代为Tyr或取代为lle；Phe取代为Met、取代为Leu或取代为Tyr；Ser取代为Thr；Thr取代为Ser；Trp取代为Tyr；Tyr取代为Trp或取代为Phe；Val取代为Ile或取代为Leu。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”(若为单链)可在本文中互换使用。

术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”和“多核苷酸”可互换使用。

本文所用的术语“经分离”是指从其原始或天然环境(举例而言，若其为天然的，则为天然环境)取出的材料。举例而言，存在于活动物中的天然多核苷酸或多肽未经分离，但通过人类干预与天然系统中的一些或所有共存材料分离的相同多核苷酸或多肽是经分离的。此类多核苷酸可为载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽可为组合物的一部分，且仍经分离以使该载体或组合物不为在自然界中发现其的环境的一部分。

优选地，核酸是表达载体的一部分，其中所述核酸分子可操作地连接至至少一个调控序列，其中此类调控序列可为启动子、增强子或终止子序列，且最优选为异源性启动子、增强子或终止子序列。

术语“PD1”和“PD-1”可在本文中互换使用。术语“PDL1”和“PDL-1”同样可在本文中互换使用。如下文所公开的PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4和PD1-5分别是指特定抗PD-1抗体。

在以引号(“”)书写时，本文所用的“MEDI9447”和“BMS986179”分别是指根据如WO2016/075099(“MEDI9447”)和WO 2016/081748(“BMS986179”，在其中还称为mAb-CD73.4-Vh-hHC-IgG2-IgG1.1f)中所公开的信息生成的参考抗体。WO 2016/075099和WO 2016/081748的全部内容分别以引用方式并入本文中。

为避免疑问，“分化簇73”或“CD73”意指由基因“NT5E-细胞外5'-核苷酸酶[智人(人类)]”编码的人类蛋白质，其是以以下序列来提供：NCBI参考序列：NP_002517.1，可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_002517.1获得(长同工型，其对应于UniProt登录号P21589)；以及NCBI参考序列：NP_001191742.1，可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_001191742.1获得(短同工型)；和编码这些蛋白质的各自核酸序列。如本文中所用的，“CD73”可指这些蛋白质的单体和/或二聚体形式。在一些实施方案中，“CD73”是指如上文所述的人CD73的长同工型。对于如本文所提供的晶体学数据而言，氨基酸编号对应于Uniprot登录号P21589(包含信号肽)，其中成熟蛋白质不含对应于P21589的氨基酸残基1-26的信号肽，然而，本申请中的编号方案是指P21589的全长氨基酸序列。本文所用的鼠类CD73是指Uniprot登录号Q61503。

在活细胞和活生物体中，CD73通常以经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)膜连接锚定至细胞膜(在本文中还称为“GPI锚”)的二聚体蛋白形式存在，且具有细胞外-5’-核苷酸酶活性。

术语“可溶性CD73”和“sCD73”可在本文中互换使用，其意指不(例如)经由GPI锚附接至膜的CD73分子。

术语“结合细胞的CD73”意指(例如)经由GPI锚附接至细胞表面的CD73分子。

术语“非结合细胞的CD73”是指存在于细胞外空间中的CD73。其包含可溶性CD73和结合囊泡的CD73(即，附接至细胞外空间中的囊泡的表面的CD73分子)。术语“非结合细胞的CD73”不包括所有“结合细胞的CD73”。可通过测量细胞培养上清液中的CD73活性来测定“非结合细胞的CD73”的活性，如实施例8中所述的。

术语“IFNγ”、“IFNg”、“干扰素γ”、“干扰素-γ”、“IFN-γ”、“IFNG”、“IFNγ(IFNgamma)”、“IFN-y”或类似者可在本文中互换使用，且表示如本领域已知的干扰素家族的细胞因子(NCBI基因编号：3458)，其是由先天性免疫系统和适应性免疫系统的细胞(例如T细胞)所分泌。

本发明的抗CD73抗体

如上文所详述的，CD73在调控T细胞活性和由此的免疫系统活性中发挥重要作用。在多种不同癌症环境中已显示，拮抗性抗CD73抗体分子可逆转腺苷介导的T细胞活性抑制，由此活化免疫系统以攻击肿瘤并由此治疗癌症。

本发明提供改善的抗CD73抗体。自CD73的祖细胞鼠类抗体(称为A1、A2、A3和A4，参见表9)，生成人源化变体。本发明的优选的抗CD73抗体分子称为B1、B2、C1、C2、C3、C4、C5和C6(参见表9)，其是人源化单克隆抗体。本发明的抗CD73抗体还可(例如)称为“拮抗性CD73抗体(antagonistic CD73 antibody或antagonistic CD73 antibodies)”，其中术语“拮抗性”或其任一语法等效形式是指通过本发明的CD73抗体抑制CD73功能(例如可溶性和细胞表面结合)。

使用体外T细胞活化测定(进一步阐述于实施例6中)，本发明人检验本发明的代表性抗CD73抗体的功能特性。如可在实施例6以和表5和6中看到的，所测试的抗体能够诱导T细胞增殖至高于某些供体中的参考抗CD73抗体的水平。另外，与某些供体中的参考抗CD73抗体相比，所测试的抗体能够在T细胞中诱导较高IFNγ水平。如可理解的，本发明的抗CD73抗体较先前技术的参考抗CD73抗体更有效地诱导T细胞活化的此惊人能力表明，其可更有效地治疗癌症和/或改善临床结果。

发明者进一步探究了本发明的抗CD73抗体分子的多种其他功能特性。此评定包括测定通过抗CD73抗体抑制腺苷形成的能力。这是通过在细胞培养上清液中测量结合细胞的CD73的抑制以及非结合细胞的CD73的抑制来进行。与参考抗CD73抗体相比，本发明的抗CD73抗体显示出较高的抑制非结合细胞的CD73的活性。因此，与参考CD73抗体相比，这些抗体具有能够更完全地抑制CD73的能力。

与本领域已知的抗CD73抗体相反，本发明的抗CD73抗体尤其在抑制腺苷生成和T细胞活化方面具有改善的性质。这与已知的参考抗CD73抗体分子“MEDI9447”和“BMS986179”不同，如可从所附实施例中看到。如可理解的，本发明的抗CD73抗体分子的这种优良性表明，其与其他抗CD73抗体相比可具有较高的功效和/或更优的临床结果且由此可用于更有效的癌症疗法。

因此，本发明的第一方面由此提供抗CD73抗体分子，其包含：

(1)重链CDR，其包含SEQ ID NO:1(hcCDR1)、SEQ ID NO:2(hcCDR2)和SEQ ID NO:3(hcCDR3)的氨基酸序列；和轻链CDR，其包含SEQ ID NO:4(lcCDR1)、SEQ ID NO:5(lcCDR2)和SEQ ID NO:6(lcCDR3)的氨基酸序列；或

(2)重链CDR，其包含SEQ ID NO:7(hcCDR1)、SEQ ID NO:8(hcCDR2)和SEQ ID NO:9(hcCDR3)的氨基酸序列；和轻链CDR，其包含SEQ ID NO:10(lcCDR1)、SEQ ID NO:11(lcCDR2)和SEQ ID NO:12(lcCDR3)的氨基酸序列；或

(3)重链CDR，其包含SEQ ID NO:13(hcCDR1)、SEQ ID NO:14(hcCDR2)和SEQ IDNO:15(hcCDR3)的氨基酸序列；和轻链CDR，其包含SEQ ID NO:16(lcCDR1)、SEQ ID NO:17(lcCDR2)和SEQ ID NO:18(lcCDR3)的氨基酸序列；或

(4)重链CDR，其包含SEQ ID NO:19(hcCDR1)、SEQ ID NO:20(hcCDR2)和SEQ IDNO:21(hcCDR3)的氨基酸序列；和轻链CDR，其包含SEQ ID NO:22(lcCDR1)、SEQ ID NO:23(lcCDR2)和SEQ ID NO:24(lcCDR3)的氨基酸序列；或

(5)重链CDR，其包含SEQ ID NO:25(hcCDR1)、SEQ ID NO:26(hcCDR2)和SEQ IDNO:27(hcCDR3)的氨基酸序列；和轻链CDR，其包含SEQ ID NO:28(lcCDR1)、SEQ ID NO:29(lcCDR2)和SEQ ID NO:30(lcCDR3)的氨基酸序列；或

(6)重链CDR，其包含SEQ ID NO:31(hcCDR1)、SEQ ID NO:32(hcCDR2)和SEQ IDNO:33(hcCDR3)的氨基酸序列；和轻链CDR，其包含SEQ ID NO:34(lcCDR1)、SEQ ID NO:35(lcCDR2)和SEQ ID NO:36(lcCDR3)的氨基酸序列；或

(7)重链CDR，其包含SEQ ID NO:37(hcCDR1)、SEQ ID NO:38(hcCDR2)和SEQ IDNO:39(hcCDR3)的氨基酸序列；和轻链CDR，其包含SEQ ID NO:40(lcCDR1)、SEQ ID NO:41(lcCDR2)和SEQ ID NO:42(lcCDR3)的氨基酸序列；或

(8)重链CDR，其包含SEQ ID NO:43(hcCDR1)、SEQ ID NO:44(hcCDR2)和SEQ IDNO:45(hcCDR3)的氨基酸序列；和轻链CDR，其包含SEQ ID NO:46(lcCDR1)、SEQ ID NO:47(lcCDR2)和SEQ ID NO:48(lcCDR3)的氨基酸序列；或

(9)重链CDR，其包含SEQ ID NO:49(hcCDR1)、SEQ ID NO:50(hcCDR2)和SEQ IDNO:51(hcCDR3)的氨基酸序列；和轻链CDR，其包含SEQ ID NO:52(lcCDR1)、SEQ ID NO:53(lcCDR2)和SEQ ID NO:54(lcCDR3)的氨基酸序列；或

(10)重链CDR，其包含SEQ ID NO:55(hcCDR1)、SEQ ID NO:56(hcCDR2)和SEQ IDNO:57(hcCDR3)的氨基酸序列；和轻链CDR，其包含SEQ ID NO:58(lcCDR1)、SEQ ID NO:59(lcCDR2)和SEQ ID NO:60(lcCDR3)的氨基酸序列；或

(11)重链CDR，其包含SEQ ID NO:61(hcCDR1)、SEQ ID NO:62(hcCDR2)和SEQ IDNO:63(hcCDR3)的氨基酸序列；和轻链CDR，其包含SEQ ID NO:64(lcCDR1)、SEQ ID NO:65(lcCDR2)和SEQ ID NO:66(lcCDR3)的氨基酸序列；或

(12)重链CDR，其包含SEQ ID NO:67(hcCDR1)、SEQ ID NO:68(hcCDR2)和SEQ IDNO:69(hcCDR3)的氨基酸序列；和轻链CDR，其包含SEQ ID NO:70(lcCDR1)、SEQ ID NO:71(lcCDR2)和SEQ ID NO:72(lcCDR3)的氨基酸序列。

如上文所概述的，本发明的优选的抗CD73抗体分子称为B1、B2、C1、C2、C3、C4、C5和C6。本文提供序列表(表9)，其易于允许鉴别本发明的特定抗CD73抗体分子的个别氨基酸序列。

除如本文所陈述的CDR序列外，本发明的抗体分子还包括免疫球蛋白框架区(FR)序列。这些序列优选地在人类中并非免疫原性，且由此优选是人或人源化FR序列。本领域已知适合的人或人源化FR序列。特定优选的FR序列可从本文所示的实施方案获得，此类实施方案公开了完整抗体分子和由此CDR序列以及FR序列。

制备本发明的第一方面的抗体分子在本领域已众所周知，且本领域技术人员将能够易于制备具有本发明的第一方面的特性的抗体分子。此类方法的实例提供于下文中。

关于包含两条完整重链和两条完整轻链的抗体(如具有IgG1或IgG4类型的抗体)的产生，参见Norderhaug等人，J Immunol Methods 1997,204(1):77-87；Kipriyanow和LeGall,Molecular Biotechnology 26:39-60,2004；Shukla等人，2007,J.ChromatographyB,848(1):28-39。

还已知通过在宿主细胞(如大肠杆菌(E.coli)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)/法夫克马格特勒酵母(Komagataella phaffii)或哺乳动物细胞系(例如CHO或NS0))中重组表达编码scFv构建体的核酸以产生功能scFv分子来制造scFv抗体的过程(Rippmann等人，Applied and Environmental Microbiology1998,64(12):4862-4869；Yamawaki等人，J.Biosci.Bioeng.2007,104(5):403-407；Sonoda等人，ProteinExpr.Purif.2010,70(2):248-253)。

为避免疑问，本文针对本发明的第一方面列出的每一具体实施例还可考虑用于本发明的独立方面。

本发明的第一方面的优选的实施方案是其中所述抗体分子是人源化抗体分子者。

在一实施方案中，所述抗体是重组抗体。在一实施方案中，所述抗体是经分离的。在一实施方案中，所述抗体是经纯化的。

本发明的第一方面的另一优选的实施方案是其中所述抗体分子是单克隆抗体、Fab、F(ab’)

术语“人源化”、“Fab”、“F(ab’)

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有选自由以下组成的组的重链恒定区：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定区。优选地，重链恒定区是IgG1，更优选地是具有L234A和/或L235A突变的IgG1(Kabat编号；对应于实际编号中的位置L232A和L233A)。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有κ或λ轻链恒定区。

在一实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含如上文所公开的与SEQ ID NO:73、75、77或79中的任一者至少85％、90％、95％同一的氨基酸序列的重链可变结构域。

在一实施方案中，所述抗体分子具有包含SEQ ID NO:73、75、77或79中的任一者的氨基酸序列的重链可变结构域。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含与SEQ ID NO:81、83、85、87、89、91、93或95中的任一者至少85％、90％、95％同一的氨基酸序列的重链可变结构域。优选地，所述抗体分子具有包含SEQ ID NO:81、83、85、87、89、91、93或95中的任一者的氨基酸序列的重链可变结构域。更优选地，所述抗体是人源化的。

在一实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含与SEQ ID NO:74、76、78或80中的任一者至少85％同一的氨基酸序列的轻链可变结构域。

在一实施方案中，所述抗体分子具有包含SEQ ID NO:74、76、78或80中的任一者的氨基酸序列的轻链可变结构域。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含与SEQ ID NO:82、84、86、88、90、92、94或96中的任一者至少85％同一的氨基酸序列的轻链可变结构域。优选地，所述抗体分子具有包含SEQ ID NO:82、84、86、88、90、92、94或96的氨基酸序列的轻链可变结构域。更优选地，所述抗体是人源化的。

计算氨基酸序列同一性的方法在本领域已众所周知且在本文中进一步论述于说明书的定义部分中。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的重链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的重链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的重链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的重链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的重链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的重链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的轻链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的轻链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的轻链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的轻链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的轻链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的轻链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的重链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的重链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的重链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的重链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的重链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的重链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的重链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的重链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的轻链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的轻链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的轻链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的轻链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的轻链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的轻链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的轻链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的轻链。

在一实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的轻链可变区。

在一实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的轻链可变区。

在一实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的轻链可变区。

在一实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的轻链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的轻链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的轻链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的轻链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的轻链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的轻链可变区。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的轻链可变区。

在一实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的轻链。

在一实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的轻链。

在一实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的轻链。

在一实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的轻链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的轻链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的轻链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的轻链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的轻链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的轻链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的轻链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的轻链。

在一优选的实施方案中，抗CD73抗体分子具有包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的轻链。

对于所有上述实施方案而言，应理解，通过使用术语“包含”，其旨在还包括其中各个结构域或分子“由所指示的氨基酸序列组成”的实施方案。

在一个优选的实施方案中，抗CD73抗体分子能够以小于10nM、优选地小于1nM、更优选地小于100pM的解离常数(K

在一些实施方案中，抗CD73抗体分子能够以高亲和力结合至人CD73(长同工型)和食蟹猕猴(长尾猕猴(Macaca fascicularis))CD73。在一些实施方案中，高亲和力是指K

在一个优选的实施方案中，抗CD73抗体分子以低于结合至人CD73的亲和力(例如低于人CD73 10倍、50倍、100倍或110倍的亲和力)结合至小鼠CD73。小鼠CD73的序列可通过基因库登录号NP_035981.1(仅1种鉴别的形式)获得。食蟹猕猴CD73的序列可通过RefSeq登录号XP_005552488.1获得。

在一个实施方案中，抗CD73抗体分子能够降低人CD73的活性。在一些实施方案中，人CD73的活性是指将AMP水解成腺苷的酶功能。因此，降低人CD73的活性是指抑制此类酶功能。在一个实施方案中，抗CD73抗体在体外抑制人CD73的酶功能，如实施例中所述。在一些实施方案中，降低人CD73的活性是指降低CD73的细胞表面水平。在另一实施方案中，在基于细胞的测定中例如使用癌细胞系(例如Colo201)来测定抑制(通过阻断CD73酶功能或通过降低CD73细胞表面水平)。

在一些实施方案中，抗CD73抗体分子将腺苷的形成抑制至少70％、优选地大于80％，如在实施例5中所述的基于细胞的测定中所测定的。在特别优选的实施方案中，抗CD73抗体分子将细胞培养上清液中的腺苷的形成抑制至少60％、至少70％、优选大于75％，即其抑制非结合细胞的CD73的活性，如实施例8中所述的。在一实施方案中，抗CD73抗体分子将非结合细胞的CD73的腺苷的形成抑制至少70％。

在又一实施方案中，抗CD73抗体在体内抑制人CD73的酶功能。

用以在体外或在体内测定人CD73的酶活性抑制的测定法在本领域已习知，且还进一步详细阐述于所附实施例中。

在一些实施方案中，抗CD73抗体分子能够以小于5nM或4、3、2、1.5、1、0.5nM或更低的IC

在一实施方案中，抗CD73抗体能够逆转T细胞功能的AMP依赖性抑制。在一优选的实施方案中，T细胞功能是指T细胞增殖，已知其可由通过CD73自单磷酸腺苷(AMP)生成的腺苷抑制。本发明抗体能够通过抑制CD73产生腺苷来逆转上述抑制，优选逆转至与对照水平(使用不添加AMP的同种型对照处理的经刺激的T细胞)基本上相同的水平。在优选的实施方案中，本发明的抗体能够将T细胞的增殖恢复至对照水平的40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或甚至大于100％(例如110％、115％、120％或125％)。用以测定T细胞功能的AMP依赖性抑制的测定法描述于实施例6中。在一些实施方案中，T细胞是CD4+。在其他实施方案中，T细胞是CD8+。

在一些实施方案中，T细胞功能是指T细胞的干扰素γ释放。不期望受限于任何理论，据信，由CD73产生的腺苷抑制该此类T细胞的干扰素γ释放。因此，本发明的抗体能够恢复T细胞的干扰素γ释放，优选恢复至与对照水平(使用不添加AMP的同种型对照处理的经刺激的T细胞)基本上相同的水平。在优选的实施方案中，本发明的抗体能够将由AMP抑制的T细胞的干扰素γ释放诱导至最高2×(即两倍)、3×、5×、10×、20×、30×、40×、50×或大于50×的对照水平(使用添加AMP的同种型对照处理的经刺激的T细胞)。用以测定T细胞的干扰素γ释放的测定法描述于实施例6中。在一些实施方案中，T细胞是CD4+。在其他实施方案中，T细胞是CD8+。

在特别优选的实施方案中，T细胞功能是指如上文所述的T细胞增殖和干扰素γ释放，即，抗CD73抗体能够刺激T细胞增殖和T细胞的干扰素γ释放。

在另一实施方案中，抗CD73抗体分子与可溶性CD73形成具有界定大小的抗原-抗体复合物(例如2:2寡聚物)。这些复合物小于通过本领域已知的其他CD73抗体形成的复合物(例如参见图2)。抗原-抗体复合物的大小先前与Fcγ受体活化相关，且可由此在不期望的免疫原性中发挥作用(Krayukhina等人，Analytical ultracentrifugation withfluorescence detection system reveals differences in complex formationbetween recombinant human TNF and different biological TNF antagonists invarious environments(2017).mAbs)。

在一些实施方案中，本发明提供与本文所述的抗体A1、A2、A3、A4、B1、B2、C1、C2、C3、C4、C5或C6(如表9中所提和)结合至相同表位的抗CD73抗体。在一些实施方案中，抗CD73抗体与A1、A2、A3、A4、B1、B2、C1、C2、C3、C4、C5或C6(如表9中所提及)竞争结合至相同表位。在一些实施方案中，抗CD73抗体结合至与A1、A2、A3、A4、B1、B2、C1、C2、C3、C4、C5或C6(如表9中所提及)的表位重叠或基本上重叠的表位。优选地，所述抗CD73抗体是单克隆抗体。

在一实施方案中，如上文所公开的本发明的抗CD73抗体包含结合至CD73(Uniprot编号P21589)上的下列氨基酸中的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或全部的轻链可变区互补位：F137、P138、I139、A151、S152、S155、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、E203和K206，其中轻链可变区与CD73上的所述氨基酸残基的结合有助于通过本发明的抗CD73抗体来抑制CD73功能。

根据一优选的实施方案，如上文所公开的本发明的抗CD73抗体包含(例如)结合至如上文所公开的氨基酸残基(例如F137、P138、I139、A151、S152、S155、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、E203和K206)中的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或全部的轻链可变区互补位，这些氨基酸残基是CD73上的包含氨基酸残基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211(氨基酸编号对应于Uniprot登录号P21589(包括信号肽)，其中成熟蛋白质不含包含氨基酸残基1-26的信号肽，然而，本申请中的编号方案是指P21589的全长氨基酸序列)且由本发明的抗CD73抗体特异性结合的构象表位的一部分，其中本发明的抗CD73抗体的可变轻链包含根据SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96的一个氨基酸序列。根据本发明的术语“构象表位”(由如本文所公开的本发明的抗CD73抗体结合)是指非线性表位，其中由本发明的抗体识别和结合的表位是通过多肽或蛋白质的二级和/或三级结构形成的且是多肽或蛋白质的折叠的三维构象的独特之处。通常，构象表位由在线性序列中不连续但在蛋白质折叠的结构中聚集在一起的氨基酸组成。然而，构象表位还可由采用对于多肽的折叠的三维构象独特且不存在于该多肽或蛋白质的变性状态中的构象的氨基酸的线性序列组成。

根据一实施方案，如上文所公开的本发明的抗CD73抗体包含结合至下列氨基酸残基L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、T209、L210和N211中的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或全部的重链可变区互补位，这些氨基酸残基是CD73上的包含氨基酸残基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211(氨基酸编号对应于Uniprot登录号P21589)的构象表位的一部分，其中重链可变区与CD73上的所述氨基酸残基的结合有助于通过本发明的抗CD73抗体来抑制CD73功能。

根据一实施方案，如上文所公开的本发明的抗CD73抗体包含含有根据SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95的氨基酸序列中的一个且结合至CD73上的氨基酸残基L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、T209、L210和N211中的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或全部的重链可变区互补位，这些氨基酸残基是通过由本发明的抗CD73抗体特异性结合的人CD73(Uniprot登录号P21589)的氨基酸F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211形成的构象表位的一部分。

根据一优选的实施方案，如上文所公开的本发明的抗CD73抗体包含含有SEQ IDNO:102、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120中的一个的氨基酸序列且结合(例如)至如上文所公开的氨基酸残基(例如F137、P138、I139、A151、S152、S155、G156、L157、T158、L159、P160、Y161、K162、E203和K206)中的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或全部的轻链，这些氨基酸残基构成CD73上的由氨基酸F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211(氨基酸编号对应于Uniprot登录号P21589)形成的构象表位且是其一部分。如上文所公开的本发明的轻链与CD73上的包含氨基酸残基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211的构象表位的结合有助于本发明的抗CD73抗体与CD73的特异性结合，由此抑制其功能。

根据一优选的实施方案，如上文所公开的本发明的抗CD73抗体包含含有根据SEQID NO:101、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119中的一个的氨基酸序列且结合至CD73上的氨基酸L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、T209、L210和N211中的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或全部的重链，这些氨基酸构成通过人CD73的氨基酸F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211(Uniprot登录号P21589)形成的构象表位且是其一部分。如上文所公开的本发明的重链与CD73上的由氨基酸F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211形成的构象表位的结合有助于本发明的抗CD73抗体与CD73的特异性结合，由此抑制CD73功能。

根据一实施方案，如上文所公开的本发明的抗CD73与由人CD73(Uniprot登录号P21589)的氨基酸F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211形成的构象表位的结合诱导T细胞中的IFNγ释放(例如参见图4)。举例而言，如上文所公开的本发明的抗CD73抗体(其包含含有根据SEQ ID NO:55(HCDR1)、56(HCDR2)和SEQ ID NO:57(HCDR3)的氨基酸序列的重链CDR 1-3和含有根据SEQ ID NO:58(LCDR1)、SEQ ID NO.:59(LCDR2)和SEQ ID NO:60(LCDR3)的氨基酸序列的轻链CDR 1-3，或包含含有根据SEQ ID NO 91的氨基酸序列的V

根据一优选的实施方案，如上文所公开的本发明的抗CD73抗体包含根据SEQ IDNO:101的重链和根据SEQ ID NO:102的轻链，且通过结合至CD73上的包含氨基酸残基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211的构象表位的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有氨基酸残基来抑制CD73功能。

根据一优选的实施方案，如上文所公开的本发明的抗CD73抗体包含根据SEQ IDNO:109的重链和根据SEQ ID NO:110的轻链，且通过结合至CD73上的包含氨基酸残基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211的构象表位的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有氨基酸残基来抑制CD73功能。

根据一优选的实施方案，如上文所公开的本发明的抗CD73抗体包含根据SEQ IDNO:111的重链和根据SEQ ID NO:112的轻链，且通过结合至CD73上的包含氨基酸残基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211的构象表位的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有氨基酸残基来抑制CD73功能。

根据一优选的实施方案，如上文所公开的本发明的抗CD73抗体包含根据SEQ IDNO:113的重链和根据SEQ ID NO:114的轻链，且通过结合至CD73上的包含氨基酸残基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211的构象表位的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有氨基酸残基来抑制CD73功能。

根据一优选的实施方案，如上文所公开的本发明的抗CD73抗体包含根据SEQ IDNO:115的重链和根据SEQ ID NO:116的轻链，且通过结合至CD73上的包含氨基酸残基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211的构象表位的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有氨基酸残基来抑制CD73功能。

根据一优选的实施方案，如上文所公开的本发明的抗CD73抗体包含根据SEQ IDNO:117的重链和根据SEQ ID NO:118的轻链，且通过结合至CD73上的包含氨基酸残基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211的构象表位的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有氨基酸残基来抑制CD73功能。

根据一优选的实施方案，如上文所公开的本发明的抗CD73抗体包含根据SEQ IDNO:119的重链和根据SEQ ID NO:120的轻链，且通过结合至CD73上的包含氨基酸残基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211的构象表位的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或所有氨基酸残基来抑制CD73功能。

根据一优选的实施方案，本发明提供抗CD73抗体，其结合至由人CD73的氨基酸F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211形成的构象表位且交叉竞争结合至上文所公开的本发明的抗CD73抗体的构象表位(例如与包含根据SEQ ID NO:115的重链和根据SEQID NO:116的轻链的抗CD73抗体竞争结合)。可(例如)通过本领域已知的适合方法(例如描述于Anal Biochem.2009Mar 15；386(2):172-80中的方法)来评价抗体结合的交叉竞争。

根据一优选的实施方案，本发明的抗CD73抗体的重链可变区的氨基酸残基T28、T31、Y32、W33、Y52、L55、D57、L99、L100、D101、Y102和本发明的抗CD73抗体的轻链可变区的氨基酸残基R30、S31、Y32、W49、Y50、T51、S52、R53、S65、G66、S67、E92接触和/或特异性结合至CD73上的包含氨基酸残基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211的构象表位，其中本发明的抗CD73抗体包含根据SEQ ID NO:115和根据SEQ ID NO:116的氨基酸序列，且其中本发明的抗CD73抗体以小于5nM、4nM、3nM、2nM、1.5nM、1nM、0.5nM或更低的IC

举例而言，在一优选的实施方案中，通过结合至包含氨基酸残基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211的构象表位，如上文所公开的本发明的抗CD73抗体通过抑制CD73采用“开放”和“闭合”构象(其是CD73水解AMP的酶活性所需)来抑制CD73的酶活性。

根据一优选的实施方案，如上文所公开的本发明的抗CD73抗体通过结合至CD73上的包含氨基酸残基F137、P138、I139、A151、S152、G156、L157、Y158、L159、P160、Y161、K162、V163、P165、G167、D168、E169、V170、E203、K206、T209、L210、N211的构象表位来抑制CD73酶活性，由此降低CD73的细胞表面水平(参见实施例4)。

优选地，所述抗CD73抗体是人源化的。可使用本领域已知方法来生成此类抗体，例如通过使用用于免疫化的表位序列或重组表达并纯化的CD73蛋白。

可使用本领域已知方法来测定抗体的表位，例如通过抗体-抗原复合物的氢-氘交换质谱(HDX-MS)、NMR、定点诱变(例如丙氨酸扫描)或X射线结晶体学。

氢/氘交换质谱(HDX-MS)通过监测蛋白质骨架酰胺氢原子的氘交换的速率和程度来测定溶液中的蛋白质构象和构象动力学。HDX的交换程度取决于蛋白质溶剂可及性和氢键，且可通过MS精确测量HDX上蛋白质的质量增加。当此技术与酶消化配对时，可以肽水平解析结构特征，这使得能够将表面暴露的肽与内部折叠的肽区分开。在表位定位实验中，对抗原和抗原/mAb复合物平行地实施氘标记和后续淬灭实验，然后进行在线胃蛋白酶消化、肽分离和MS分析。

可使用本领域已知的任一方法来测定表位的结合竞争。举例而言，可使用标准ELISA测定或竞争性ELISA测定，其中将重组人CD73蛋白固定在板上，添加多种浓度的未经标记的第一抗体，洗涤板，添加经标记的第二抗体，洗涤，并测量结合标记的量。若增加浓度的未经标记的(第一)抗体(还称为“封闭抗体”)抑制经标记的(第二)抗体的结合，则第一抗体视为抑制第二抗体与板上的靶标的结合，或视为竞争第二抗体的结合。另外或或者，可使用表面等离子共振(SPR)分析来评价此类抗体竞争的能力。测试抗体抑制本文所述的抗CD73抗体(例如抗体A1、A2、A3、A4、B1、B2、C1、C2、C3、C4、C5或C6，表9)与CD73的结合的能力证实，测试抗体可与该抗体竞争结合至CD73。

上述(即根据本发明的第一方面)抗CD73抗体还在本文中统称为“本发明的抗体”、“本发明的CD73抗体”、“本发明的抗CD73抗体”、“本文所述的抗体”或类似者。

本发明的另一方面提供编码本发明的第一方面中任一者的抗CD73抗体分子的重链可变区和/或轻链可变区的经分离的核酸分子。

本发明的核酸分子包含(但不限于)编码本文所提供的抗CD73抗体氨基酸序列的DNA分子。同样，本发明还涉及在高严格度结合和洗涤条件下(如WO 2007/042309中所定义)杂交至编码序列表中所示的多肽序列的DNA分子的核酸分子。优选的分子(从mRNA角度)是与本文所述的一种DNA分子具有至少75％或80％(优选至少85％、更优选至少90％和最优选至少95％)的同源性或序列同一性的分子。举例而言，鉴于在真核细胞中表达抗体，序列表中所示的DNA序列已经设计成匹配真核细胞中的密码子使用。若期望在大肠杆菌中表达抗体，则可改变这些序列以匹配大肠杆菌密码子使用。可以以若干种不同方式来构建本发明的DNA分子的变体，如(例如)在WO 2007/042309中所述的。

在另一方面中，本发明提供含有核酸分子的表达载体，该核酸分子包含编码本发明的第一方面中的任一者的抗CD73抗体分子的重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。

优选地，核酸分子包含编码SEQ ID NO:81、83、85、87、89、91、93和95中任一者的重链可变区的核苷酸序列。优选地，核酸分子包含编码SEQ ID NO:82、84、86、88、90、92、94或96中任一者的轻链可变区的核苷酸序列。

优选地，表达载体另外包含编码重链的恒定结构域和/或轻链的恒定结构域的核酸分子，优选为DNA分子，此类恒定结构域分别连接至分别编码重链可变结构域和/或轻链可变结构域的核酸分子，优选为DNA分子。

在一特定优选的实施方案中，可使用两个表达载体，一个表达载体用于表达重链，另一表达载体用于表达轻链，然后该两个表达载体可均被转染至宿主细胞中用于重组蛋白表达。

优选地，表达载体是包含所述可操作地连接至至少一个调控序列的核酸分子的载体，其中此类调控序列可为启动子、增强子或终止子序列且最优选是异源性启动子、增强子或终止子序列。

可以以本身已知的方式(例如通过自动化DNA合成和/或重组DNA技术)基于关于本文所给出本发明抗体的氨基酸序列的信息来制备或获得本发明核酸。

在另一方面中，本发明涉及具有如上文所述的表达载体的宿主细胞，表达载体是(例如)编码本发明的抗CD73抗体分子的重链的表达载体和编码本发明的抗CD73抗体分子的轻链的表达载体。在一些实施方案中，宿主细胞包含编码本发明的抗CD73抗体分子的轻链和重链二者的载体，尤其在抗体是单链抗体、例如scFv时。

根据一特别优选的实施方案，所述宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞、尤其是人细胞(体外)。在另一实施方案中，此类宿主细胞是细菌细胞。其他有用的细胞是酵母细胞或其他真菌细胞。

可用作表达宿主的哺乳动物细胞在本领域已众所周知且尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO,CHO-DG44)细胞、NSO、SP2/0细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞、3T3细胞或任一此类细胞系的衍生物/后代。可使用其他哺乳动物细胞，包括但不限于人、小鼠、大鼠、猴和啮齿类动物细胞系，或其他真核细胞，包括但不限于酵母、昆虫和植物细胞，或原核细胞(例如细菌)。通过将宿主细胞培养足以允许在宿主细胞中表达抗体的时间段来产生本发明的抗体。然而，还可使用两栖动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和本领域中用于表达异源性蛋白质的任何其他细胞。

在另一方面中，本发明提供制备本发明的抗CD73抗体分子的方法，其包含以下步骤：

-在允许形成本发明的抗CD73抗体分子的条件下培养如上文所述的宿主细胞；和

-回收所述抗体分子。

在一实施方案中，制备方法另外包括进一步纯化所述抗体的步骤，如下文进一步所述的。

在一实施方案中，制备方法另外包括进一步修饰所述抗体的步骤，如本文进一步所述的。

在一实施方案中，制备方法另外包括将所述抗体分子配制成药物组合物的步骤，如本文进一步所述的。

可使用本领域中已知产生抗体的任一方法，例如如本文所述的。

在另一方面中，本发明提供供在药物中使用的如上文所述的抗CD73抗体。本发明抗体的具体医学用途进一步详细描述于下文中。

在另一方面中，提供一种药物组合物，其包含本发明的抗CD73抗体和药学上可接受的载剂。适合的载剂在本领域已习知且进一步描述于下文中。此组合物还可包含如下文更详细地所述的另一治疗剂，例如(但不限于)PD-1拮抗剂。

包括抗CD73抗体和其他治疗剂(例如PD-1拮抗剂)的药物组合物；试剂盒、方法和用途

PD-1在调控T细胞活性和由此免疫系统活性中发挥重要作用。

已在多种不同癌症环境中显示，拮抗性抗PD-1抗体分子可增加T细胞活性，由此活化免疫系统以攻击肿瘤且由此治疗癌症。

众所周知，阻断PD-1受体的单克隆抗体与针对多种癌症类型的持久临床应答有关且具有作为新颖癌症治疗剂的巨大潜力。还已显示，靶向CD73增强抗PD-1抗体的抗肿瘤活性。

基于此背景，发明者试图探究本发明的抗CD73抗体与PD-1抗体的组合。

使用树突状细胞/T细胞共培养测定(进一步概述于实施例7中)，发明人检验了本发明的代表性抗CD73抗体分子与抗PD-1分子的组合的功能特性。如可在实施例7和图1中看到的，抗PD1抗体的效应受AMP抑制，此明确显示，PD1应答依赖于AMP。本发明的抗CD73抗体分子与PD-1拮抗剂(例如抗PD-1抗体)的组合能够恢复AMP依赖性抑制且恢复IFNγ水平。

因此，本发明的另一方面提供一种药物组合物，其包含本发明的抗CD73抗体、PD-1拮抗剂和药学上可接受的载剂。适合的载剂在本领域已习知且进一步描述于下文中。

适合的PD-1拮抗剂描述于下文中。

在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是抗PDL-1抗体。在一些实施方案中，此抗PD-1抗体选自由以下组成的组：PDR-001、派姆单抗、纳武单抗和匹利珠单抗。优选地，抗PD-1抗体分子选自如本文所述的PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4和PD1-5。

在一些实施方案中，抗PDL-1抗体选自阿特珠单抗、阿维鲁单抗或度伐单抗。

除本发明的抗CD73抗体外，还可使用另一抗CD73抗体，例如MEDI9447、BMS986179、CPX-006、CPX-0016或如WO08007648、WO2016075099、WO2016081748、WO2016055609、WO2016131950、WO17064043、WO2017100670、WO17152085或WO2018013611中所述的抗体。

本发明的另一方面提供包含本发明的抗CD73抗体分子和PD-1拮抗剂的试剂盒。该试剂盒可进一步包含使用说明书。

适合的PD-1拮抗剂描述于下文中。

在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是抗PDL-1抗体。在一些实施方案中，此抗PD-1抗体选自由以下组成的组：PDR-001、派姆单抗、纳武单抗和匹利珠单抗。优选地，抗PD-1抗体分子选自如本文所述的PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4和PD1-5。

在一些实施方案中，抗PDL-1抗体是选自阿特珠单抗、阿维鲁单抗或度伐单抗。

除本发明的抗CD73抗体外，还可使用另一抗CD73抗体，例如MEDI9447、BMS986179、CPX-006、CPX-0016或如WO08007648、WO2016075099、WO2016081748、WO2016055609、WO2016131950、WO17064043、WO2017100670、WO17152085或WO2018013611中所述的抗体。

本领域技术人员基于上文将清楚，还在此公开了用于使用本发明的上述抗体分子(例如本发明的抗CD73抗体和PD-1拮抗剂)治疗疾病(如下文更详细地指定)的药物组合物以及使用本发明的此类药物组合物或抗体分子治疗疾病(如下文更详细地指定)的方法。

为避免疑问，与如本文所述的药物组合物、试剂盒、治疗方法、医学用途、施用方法和剂量相关的所有实施方案均涵盖本文所述的任一抗CD73抗体(单独或与其他治疗剂、例如PD-1拮抗剂组合)。可使用如本文所述的任一PD-1拮抗剂(包括PD-1和PDL-1的抑制剂)，例如派姆单抗、纳武单抗、匹利珠单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、如本文所述的PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4或PD1-5。

在本发明的抗CD73抗体分子和本发明的抗PD-1抗体分子待经由相同施用途径同时施用时，其可作为不同药物配制剂或组合物或作为组合的药物配制剂或组合物的一部分来施用。同样，在本发明的抗CD73抗体分子和本发明的抗PD-1抗体分子待作为组合的治疗方案的一部分来使用时，可与在使用一种抗体自身时相同量且根据相同方案来施用每一抗体，且该组合使用可或可不产生协同效应。然而，在抗体组合使用产生协同效应时，还可能减少一种或两种抗体的量而仍达成期望治疗作用。这可(例如)用于避免、限制或降低在以常用量使用时与使用一种或两种抗体有关的任何不期望的副作用而仍获得期望药理学或治疗效应。

除抗CD73抗体和PD-1拮抗剂外，上述组合物和试剂盒还可包含如下文更详细地描述的另一治疗剂。

药物组合物、施用方法、剂量

本发明进一步涉及用于治疗疾病(如下文更详细地指定)的药物组合物，其中此类组合物包含至少一种如本文所提供的抗CD73抗体。本发明进一步涵盖使用至少一种如之前所陈述的抗CD73抗体或药物组合物治疗疾病(如下文更详细地指定)的方法，且进一步涵盖通过使用本发明的此类抗CD73抗体分子或药物组合物来治疗此类疾病的药剂的制备。

此类组合物涵盖本文所述的任一抗CD73抗体(单独或与其他治疗剂组合)，其他治疗剂是(例如)PD-1拮抗剂，例如派姆单抗、纳武单抗、匹利珠单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4或PD1-5。

根据待使用的具体药物配制剂或组合物，可以任一适合方式将抗CD73抗体和/或包含其的组合物施用至有此需要的患者。因此，抗CD73抗体和/或包含其的组合物可(例如)以以有效量或剂量使用以下方式施用：静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、肌内(i.m.)、腹膜内(i.p.)、经皮、口服、舌下(例如以置于舌下方且经由黏膜吸附至舌下方的毛细管网络中的舌下片剂、喷雾或滴剂形式)、经鼻(内)(例如以鼻喷雾和/或气溶胶的形式)、局部、借助栓剂、通过吸入或任一其他适合方式。

根据适于治疗和/或缓解待治疗或缓解的疾病、病症或病状的治疗方案来施用抗CD73抗体和/或包含其的组合物。临床医师通常能够根据诸如以下等因素来确定适合的治疗方案：待治疗或缓解的疾病、病症或病状、疾病严重程度、其症状严重程度、待使用的本发明的特定抗体分子、待使用的特定施用途径和药物配制剂或组合物、患者的年龄、性别、体重、饮食、总体状况和临床医师熟知的类似因素。通常，治疗方案将包含以治疗有效量或剂量施用本发明的一种或多种抗体分子或一种或多种包含其的组合物。

通常，为治疗和/或缓解本文所提及的疾病、病症和病状且根据待治疗的特定疾病、病症或病状、待使用的本发明的特定抗体分子的功效、特定施用途径和所用的特定药物配制剂或组合物，通常以介于0.05mg/千克体重和剂量与50.0mg/千克体重和剂量之间、优选介于5.0mg/kg/剂量与20.0mg/kg/剂量之间和更优选介于10mg/kg/剂量与15mg/kg/剂量之间的量连续(例如藉由输注)或更优选作为单一剂量(例如每周两次、每周一次或每月一次的剂量；参见下文)来施用本发明的抗体分子，但可尤其根据之前所提及的参数而显著改变。因此，在一些情况下，使用低于上文给出的最低剂量可能已足矣，而在其他情况下可能不得不超出上限。在大量施用时，可适当地将其分成许多较小剂量在一天中不同时间施用。

根据本发明的特定抗体分子和其特定药代动力学和其他性质，其可每天、每第二、第三、第四、第五或第六天、每周、每月和以类似方式来施用。施用方案可包括长期每周治疗。“长期”意指持续至少两周和优选持续数月或数年。

根据所涉及的特定疾病，可使用任一适合的体外测定、基于细胞的测定、体内测定和/或本身已知的动物模型或其任一组合来测试本发明的抗体分子和包含其的组合物的功效。适合的测定法和动物模型为本领域技术人员所清楚的，且(例如)包括下文实施例中所使用的测定法和动物模型。

配制剂

对于药物应用而言，本发明的抗体分子可配制为包含以下的药物制剂：(i)至少一种本发明的抗CD73抗体，和(ii)至少一种药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和/或稳定剂，和(iii)任选地一种或多种其他药理学活性多肽和/或化合物(例如PD-1拮抗剂)。“药学上可接受”意指，各个材料在施用至个体时不显示任何生物或另外不期望的效应且不以有害方式与含有其的药物组合物中的任一其他组分(例如药物活性成分)相互作用。具体实例可参见标准手册，例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，MackPublishing Company,USA(1990)。举例而言，可以以本身已知用于常规抗体和抗体片段以及其他药物活性蛋白的任一方式来配制和施用本发明的抗体。因此，根据另一实施方案，本发明涉及一种药物组合物或制剂，其含有至少一种本发明的CD73抗体和至少一种药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和/或稳定剂和任选地一种或多种如本文进一步所述的其他药理学活性物质(例如PD-1拮抗剂)。

用于肠胃外的施用(例如静脉内、肌内、皮下注射或静脉内输注)的药物制剂可(例如)为无菌溶液、悬浮液、分散液、乳液或粉剂，此类形式包含活性成分且适于(任选地在另一溶解或稀释步骤之后)输注或注射。用于此类制剂的适合载剂或稀释剂(例如)包括但不限于无菌水和药学上可接受的水性缓冲液和溶液，例如生理学磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液和汉克氏溶液(Hank's solution)；水油；甘油；乙醇；二醇，例如丙二醇；以及矿物油、动物油和植物油，例如花生油、大豆油；以及其适合的混合物。

本发明的抗体分子的溶液还可含有防腐剂以防止微生物生长，该防腐剂是(例如)抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯(p-hydroxybenzoates)、尼泊金(paraben)、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞、乙二胺四乙酸(其碱金属盐)等。在许多情况下，优选应包括等渗剂，例如糖、缓冲液或氯化钠。任选地，可使用乳化剂和/或分散剂。可(例如)通过形成脂质体、通过维持所需粒径(在分散液的情况下)或通过使用表面活性剂来维持适当流动性。还可添加延迟吸收的其他试剂，例如单硬脂酸铝和明胶。可将溶液填充至注射小瓶、安瓿、输注瓶等。

在所有情况下，最终剂型必须无菌、可流动且在制备和储存条件下稳定。无菌可注射溶液通过以下方式进行制备：将所需量的活性化合物并入视需要具有上文所列举的其他成分的适当溶剂中，随后过滤灭菌。在使用无菌粉剂制备无菌可注射溶液的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这产生存在于先前经无菌过滤的溶液中的活性成分加上任一额外期望成分的粉剂。

通常，水溶液或悬浮液是优选的。通常，用于治疗性蛋白(例如本发明的抗体)的适合的配制剂是缓冲蛋白质溶液，例如包括以下的溶液：适合的浓度(例如0.001mg/ml至400mg/ml、优选0.005mg/ml至200mg/ml、更优选0.01mg/ml至200mg/ml、更优选1.0-100mg/ml，例如1.0mg/ml、50mg/ml或100mg/ml)的蛋白质和诸如以下的水性缓冲液：

-磷酸盐缓冲盐水，pH7.4，

-其他磷酸盐缓冲液，pH6.2至8.2，

-乙酸盐缓冲液，pH3.2至7.5，优选为pH4.8至5.5

-组氨酸缓冲液，pH5.0至7.0，

-琥珀酸盐缓冲液，pH3.2至6.6，和

-柠檬酸盐缓冲液，pH2.1至6.2，

和任选地，用于提供溶液等渗性的盐(例如NaCl)和/或糖(例如蔗糖和海藻糖)和/或其他多元醇(例如甘露醇和甘油)和/或表面活性剂。

优选的缓冲蛋白质溶液是包括约50mg/ml本发明抗体(单独或与PD-1拮抗剂组合，溶于25mM乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中)的溶液，该溶液任选地包含0.67mM甲硫氨酸且通过添加240mM海藻糖来调节等渗性。其他表面活性剂(例如0.04％Tween-20、Tween-80或聚山梨醇酯80)也可包含于此类溶液中。用于皮下施加的配制剂可包括显著较高浓度的本发明抗体，例如最高100mg/ml或甚至高于100mg/ml。然而，本领域技术人员将清楚，上文所给出的成分和其量仅代表一种优选选择。本领域技术人员将直接清楚其替代形式和变化，或可容易地自上述公开内容开始来设想。

根据本发明的另一方面，本发明的抗体分子可与可用于施用抗体的装置(例如注射器、注射笔、微型泵或其他装置)组合使用。

治疗用途/治疗方法

本发明的另一方面提供治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的抗CD73抗体分子。在一优选的实施方案中，该方法进一步包括向此类患者施用PD-1拮抗剂(例如抗PD-1抗体或抗PDL-1抗体)。优选地，所述抗PD-1抗体选自由以下组成的组：派姆单抗、纳武单抗、匹利珠单抗、如本文所述的PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4和PD1-5。优选地，所述抗PDL-1抗体选自由以下组成的组：阿特珠单抗、阿维鲁单抗和度伐单抗。

在一些实施方案中，癌症是肾癌、胃肠道癌或肺癌。在一些实施方案中，所述胃肠道癌是结肠癌、胃癌或肝细胞癌。在一些实施方案中，所述肾癌是肾脏癌、优选为透明细胞癌。在本发明的一优选的实施方案中，癌症是肺癌、优选为非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，所述结肠癌是CRC。

在一些实施方案中，将本发明的抗CD73抗体分子任选地连同如上文所述的PD-1拮抗剂与一或多种其他治疗剂和/或程序组合施用，此类药剂和程序进一步详细描述于下文中。非限制性实例是选自以下的治疗剂或程序：化学疗法、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、手术程序、放射程序、疫苗或细胞免疫疗法。

在一些实施方案中，另一治疗剂是A2AR拮抗剂、CD39拮抗剂、LAG-3拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、EGFR拮抗剂或HER2拮抗剂。

本发明的另一方面提供用于治疗癌症的方法中的本发明的抗CD73抗体分子。在一优选的实施方案中，该方面进一步包括PD-1拮抗剂(例如抗PD-1抗体或抗PDL-1抗体)的额外用途。优选地，所述抗PD-1抗体选自由以下组成的组：派姆单抗、纳武单抗、匹利珠单抗、如本文所述的PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4和PD1-5。优选地，所述抗PDL-1抗体选自由以下组成的组：阿特珠单抗、阿维鲁单抗和度伐单抗。

在一些实施方案中，癌症是肾癌、胃肠道癌或肺癌。在一些实施方案中，所述胃肠道癌是结肠癌、胃癌或肝细胞癌。在一些实施方案中，所述肾癌是肾脏癌、优选为透明细胞癌。在本发明的一优选实施方案中，癌症是肺癌、优选为非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施例中，所述结肠癌是CRC。

在一些实施方案中，将本发明的抗CD73抗体分子任选地连同如上文所述的PD-1拮抗剂与一或多种其他治疗剂和/或程序组合施用，此类药剂和程序进一步详细描述于下文中。非限制性实例选自以下的治疗剂或程序：化学疗法、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、手术程序、放射程序、疫苗或细胞免疫疗法。

如本领域已知，“靶向抗癌疗法”是指全身性施用具有特异性作用于充分界定的靶标或生物路径的特定机制的药物，此类充分界定的靶标或生物路径在活化或不活化时可消退或破坏恶性过程且同时最小化对健康组织的副作用(Li等人，Target Oncol.2012；7(1):69-85)。“基于免疫的疗法”或“免疫疗法”是通过诱导、增强或抑制免疫应答来治疗疾病。在癌症背景中，基于免疫的疗法通常是指(例如)使用如下文所述的免疫治疗剂来诱导和/或增强免疫应答的疗法。

在一些实施方案中，另一治疗剂是A2AR拮抗剂、CD39拮抗剂、LAG-3拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、EGFR拮抗剂或HER2拮抗剂。

本发明和所有其实施方案的含义内的PD-1拮抗剂是抑制PD-1与其受体的相互作用的化合物。PD-1拮抗剂在本领域已众所周知，例如由Li等人，Int.J.Mol.Sci.2016,17,1151(以引用方式并入本文中)所综述的。PD-1拮抗剂可为PD-1的抑制剂或PDL-1的抑制剂，例如抗PD-1抗体或抗PDL-1抗体。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是抗PDL-1抗体。可根据本发明使用任何PD-1拮抗剂、尤其抗体(例如由Li等人公开的拮抗剂)以及下文所公开的其他抗体。优选地，本发明和所有其实施方案的PD-1拮抗剂选自由下列抗体组成的组：

-派姆单抗(抗PD-1抗体)；

-纳武单抗(抗PD-1抗体)；

-匹利珠单抗(抗PD-1抗体)；

-PDR-001(抗PD-1抗体)；

-阿特珠单抗(抗PDL-1抗体)；

-阿维鲁单抗(抗PDL-1抗体)；

-度伐单抗(抗PDL-1抗体)

-如本文所述的PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4和PD1-5(抗PD1抗体)。

派姆单抗(先前也称为兰布鲁珠单抗(lambrolizumab)；商品名为Keytruda；亦称为MK-3475；公开于(例如)Hamid,O.等人(2013)New England Journal of Medicine 369(2):134-44中)是结合至PD-1的人源化IgG4单克隆抗体；其在C228P处含有经设计以防止Fc介导的细胞毒性的突变。派姆单抗(例如)公开于US 8,354,509和WO2009/114335中。其由FDA批准用于治疗患有不可切除性或转移性黑色素瘤的患者和患有转移性NSCLC的患者。

纳武单抗(CAS登记号：946414-94-4；BMS-936558或MDX1106b)是全人IgG4单克隆抗体，其特异性阻断PD-1且无可检测到的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。纳武单抗(例如)公开于US 8,008,449和WO2006/121168中。其已由FDA批准用于治疗患有不可切除性或转移性黑色素瘤、转移性NSCLC和晚期肾细胞癌的患者。

匹利珠单抗(CT-011；Cure Tech)是结合至PD-1的人源化IgG1k单克隆抗体。匹利珠单抗(例如)公开于WO 2009/101611中。

PDR-001或PDR001是高亲和力、阻断配体的人源化抗PD-1 IgG4抗体，其阻断PDL-1和PD-L2与PD-1的结合。PDR-001公开于WO2015/112900和WO2017/019896中。

根据本发明的此方面和任何其他方面，抗体PD1-1至PD1-5是如EP16170174.3中所公开的抗体分子，且通过如下表9中所示的序列来进一步定义。

因此，PD1-1具有包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的轻链；

PD1-2具有包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的轻链；

PD1-3具有包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链；

PD1-4具有包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的轻链；且

PD1-5具有包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的轻链。

本发明的另一方面是本发明的抗CD73抗体分子的用途，其用以制备用于治疗癌症的药物组合物。在一优选的实施方案中，该方面进一步包含PD-1拮抗剂(例如抗PD-1抗体或抗PDL-1抗体)的额外用途。优选地，所述抗PD-1抗体选自由以下组成的组：派姆单抗、纳武单抗、匹利珠单抗、如本文所述的PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4和PD1-5。优选地，所述抗PDL-1抗体选自由以下组成的组：阿特珠单抗、阿维鲁单抗和度伐单抗。

在一实施方案中，抗CD73抗体分子待与PD-1拮抗剂同时、并行、依序、连续、交替或分开施用。

本发明的医学用途方面可包含本发明的任一特定抗CD73抗体分子和/或如本文所述的PD-1拮抗剂。

由于其生物学性质，本发明的抗体适于治疗特征在于过度或异常细胞增殖的疾病(例如癌症)。

不论侵袭的组织病理学类型或阶段如何，本文所用的术语“癌症”意指包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化细胞、组织或器官。癌性病症的实例包含但不限于实体肿瘤、血液癌症、软组织肿瘤和转移性病变。

可使用本文所公开的抗体分子抑制生长的示例性癌症包括通常对免疫疗法具有应答的癌症。

举例而言，可使用根据本发明的抗体来治疗下列癌症、肿瘤和其他增殖性疾病且并不限于此：

实体肿瘤的实例包括恶性肿瘤，例如各种器官系统的肉瘤和癌(包括腺癌和鳞状细胞癌)，例如侵袭肝、淋巴、生殖泌尿道(例如肾、尿道上皮细胞)、咽的肉瘤和癌。腺癌包括恶性肿瘤，例如大部分结肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌。鳞状细胞癌包括(例如)肺、食管、皮肤、HNSCC、口腔、肛门和子宫颈中的恶性肿瘤。

可治疗的其他适应症包括肾癌(例如肾脏癌，例如透明细胞癌)、胃肠道癌、胃癌、CRC、结肠癌、肛门区癌、胰脏癌、卵巢癌、黑色素瘤(例如转移性恶性黑色素瘤，例如皮肤或眼内恶性黑色素瘤)、乳腺癌、HNSCC、HCC、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非NSCLC、神经胶质瘤、子宫内膜癌、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌或去势抗性前列腺癌(CRPC))、甲状腺癌、成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤(多形性成胶质细胞瘤)、子宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、生殖细胞肿瘤、儿科肉瘤、鼻窦天然杀伤淋巴瘤、骨癌、子宫癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期实体肿瘤、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮样癌症、T细胞淋巴瘤、环境诱导性癌症(包含通过石棉诱导的癌症)、病毒相关癌症(例如人类乳头瘤病毒(HPV)相关肿瘤)；和源自两种主要血细胞谱系、即髓样细胞系(其产生粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞)或淋巴样细胞系(其产生B细胞、T细胞、NK细胞和血浆细胞)的血液学恶性肿瘤，例如所有类型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，例如急性、慢性、淋巴细胞性和/或骨髓性白血病，例如急性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性淋巴样白血病和慢性骨髓性白血病(CML)、未分化AML(MO)、成髓细胞白血病(Ml)、成髓细胞白血病(M2；伴有细胞成熟)、早幼粒细胞性白血病(M3或M3变体[M3V])、髓单核细胞性白血病(伴有嗜酸性粒细胞增多症的M4或M4变体[M4E])、单核细胞白血病(M5)、红白血病(M6)、成巨核细胞性白血病(M7)、分离的粒细胞性肉瘤和绿色瘤；淋巴瘤，例如霍奇金氏淋巴瘤(HL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、B细胞淋巴瘤、前体淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、急性髓样淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤、间变性(例如Kil+)大细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤/白血病、外套细胞淋巴瘤、血管成免疫细胞T细胞淋巴瘤、血管中心淋巴瘤、肠T细胞淋巴瘤、原发性纵膈B细胞淋巴瘤、T-成淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、前体T-成淋巴细胞性淋巴瘤、移植后淋巴组织增殖性病症、真实组织细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性积液淋巴瘤、成淋巴细胞性淋巴瘤(LBL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、滤泡性淋巴瘤、弥漫性组织细胞性淋巴瘤(DHL)、成免疫细胞大细胞淋巴瘤、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTLC)(也称为蕈样真菌病或塞扎里综合征(Sezary syndrome))、间变性大细胞淋巴瘤和伴有瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)的淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)；骨髓瘤，例如IgG骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌骨髓瘤、郁积型骨髓瘤(也称为无痛骨髓瘤)、孤立性浆细胞瘤和多发性骨髓瘤、多毛细胞淋巴瘤；髓样谱系的造血性肿瘤、间质来源的肿瘤(包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤)；精原细胞瘤、畸形恶癌、中枢和外周神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、神经鞘瘤；间质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；和其他肿瘤，包括着色性干皮病、角质棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡性癌和畸形恶癌；淋巴样谱系的造血性肿瘤，例如T细胞和B细胞肿瘤，包括但不限于T细胞病症，例如T前淋巴细胞性白血病(TPLL)，包括小细胞和脑状细胞类型；优选为T细胞类型的大颗粒性淋巴细胞白血病(LGL)；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；外周/胸腺后T细胞淋巴瘤(多型和成免疫细胞亚型)；血管中心(鼻)T细胞淋巴瘤；直肠癌；以及所述癌症的任何组合。本文所述的方法还可用于治疗转移性癌症、对先前治疗有抗性或难治性的癌症(例如利用(例如)阻断CTLA-4或PD-1或PDL-1抗体的先前免疫疗法的难治性癌症)和复发性癌症。

在一些实施方案中，癌症是肾癌、胃肠道癌或肺癌。在一些实施方案中，所述胃肠道癌是结肠癌、胃癌或肝细胞癌。在一些实施方案中，所述肾癌是肾脏癌、优选为透明细胞癌。在本发明的一优选的实施方案中，癌症是肺癌、优选为非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，所述结肠癌是CRC。

上文所提及的特征在于身体中的特定位置/来源的所有癌症、肿瘤、赘瘤意指包括原发性肿瘤和自其衍生的转移性肿瘤二者。

可能的是，若患者患有特征在于具有高CD73表达(在癌细胞自身上或在肿瘤内的基质细胞或免疫细胞上)的癌症；和/或若癌症由免疫细胞(例如肿瘤浸润性淋巴细胞)浸润，则该患者更可能对使用本发明的抗体分子(如本文所述的)的治疗具有应答。尽管预期可需要一定CD73表达，但使用本发明的抗体分子的治疗未必限于具有高CD73表达的癌症。因此，在本发明的实施方案中，待治疗的患者患有特征在于具有高CD73表达的癌症，和/或癌症由免疫细胞浸润。在一些实施方案中，患者患有特征在于在肿瘤内的癌细胞、基质细胞或免疫细胞上具有高PDL-1和/或CD73表达的癌症，且使用如本文所述的抗CD73抗体和PD-1拮抗剂进行治疗。

可通过本领域已知的方法(例如流式细胞术或免疫组织化学)来测定(例如)在癌细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(例如CD8+T细胞或CD4+T细胞)、肿瘤血管系统、肿瘤基质上的此类表达。

在一优选的实施方案中，基于增加的CD73表达来选择待治疗的患者。

另外，可能的是，若患者患有特征在于具有高突变负荷的癌症，则该患者更可能对使用本发明的抗体分子(如本文所述的)的治疗具有应答。可评价高突变负荷如何的实例包括测定癌症是否特征在于具有微卫星不稳定性或较差DNA错配修复效率。据信，此类癌症更具免疫原性且由此更可能对使用免疫调节性治疗方案(例如本发明的抗体分子)的治疗具有应答。因此，在本发明的一实施方案中，待治疗的患者患有特征在于具有高突变负荷的癌症。

本发明的抗体分子可用于一线、二线或任何其他线治疗背景中的治疗方案中。

在一实施方案中，待治疗的患者先前已使用另一治疗剂进行治疗。在一些实施方案中，此类治疗剂可为如本文所述的PD-1拮抗剂，例如派姆单抗、纳武单抗、匹利珠单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗或如本文所述的PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4和PD1-5。

在一实施方案中，待治疗的患者是对所述治疗剂的治疗应答较差者。举例而言，患者可患有已知对所述治疗剂的治疗无应答性、最小应答性或非充分应答性的癌症。在一实施方案中，对所述治疗剂的治疗应答较差者是其癌症组织或癌症邻近组织特征在于炎症水平不充分或较低(例如与参考相比)的个体。在一实施方案中，对所述治疗剂的治疗应答较差者是已接受所述治疗剂的治疗且其癌症已进展的个体。在一实施方案中，作为应答较差者或患有应答较差的癌症的个体是对使所述治疗剂的治疗具有较差疾病预后的个体。可(例如)通过癌症进展的高或较高风险(例如与具有良好疾病预后的个体相比)，基于一种或多种预测因子来鉴别对所述治疗剂的治疗具有较差应答的个体。在一实施方案中，预测因子包含在肿瘤微环境中(在肿瘤或肿瘤邻近组织中)存在升高数量的表达CD73的T细胞和/或升高水平的表达CD73的细胞或腺苷水平。在一实施方案中，预测因子包含一种或多种基因中的突变的存在或不存在。在一实施方案中，突变定义由T细胞识别的新表位。在一实施方案中，预测因子包含一种或多种基因或蛋白质在肿瘤细胞中的表达水平(例如PDL-1、在肿瘤细胞上降低或升高的PDL-1水平)。在一实施方案中，预测因子包含循环或肿瘤环境中一种或多种基因或蛋白质(例如PD-1)在效应T细胞中的表达水平。在一实施方案中，预测因子包含如上文所述的高突变负荷。

在一些实施方案中，所述治疗剂是如本文所述的PD-1拮抗剂，例如派姆单抗、纳武单抗、匹利珠单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗或如本文所述的PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4和PD1-5。

本发明的抗体分子可用于预防、短期或长期治疗上文所提及的疾病，其任选地与放射疗法、化学疗法和/或手术组合。因此，在另一实施方案中，待治疗的患者先前已使用放射疗法或化学疗法(如下文进一步所述的)进行治疗。在一实施方案中，待治疗的患者是对放射疗法或化学疗法的治疗应答较差者，如上文所述的。

当然，上文还包括本发明的抗体分子在通过向有此需要的患者施用治疗有效剂量来治疗上述疾病的多种方法中的用途；以及这些抗体分子用以制备用于治疗此类疾病的药剂的用途；以及包括本发明的此类抗体分子的药物组合物；以及包括本发明的此类抗体的药剂的制备和/或制造；等等。

与其他活性物质或治疗的组合

本发明的抗CD73抗体分子或本发明的抗CD73抗体和PD-1拮抗剂的组合可单独使用，或与一种或多种尤其选自化学治疗剂(如DNA损害剂)或抑制癌细胞中的血管生成、信号转导途径或有丝分裂检查点的治疗活性化合物的其他治疗剂或程序组合。

在一些实施方案中，此类组合中所使用的抗CD73抗体可为上文在本发明的第一方面中所述的任一抗体。优选的抗CD73抗体是B1、B2、C1、C2、C3、C4、C5和C6(表9)。

在一些实施方案中，还预期，可使用本领域已知的其他抗CD73抗体来代替第一方面的抗体或与其一起使用。除本发明的第一方面的抗CD73抗体外，还可使用另一抗CD73抗体，例如MEDI9447、BMS986179、CPX-006、CPX-0016或如WO2008007648、WO2016075099、WO2016081748、WO2016055609、WO2016131950、WO17064043、WO2017100670、WO17152085或WO2018013611中所述的抗体。

另外的治疗剂可与抗体分子同时施用(任选地作为同一药物制剂的组分)，或在其之前或之后施用。

在某些实施方案中，该另外的治疗剂可为(但不限于)一种或多种选自以下物质的抑制剂的群的抑制剂：EGFR、VEGFR、HER2-neu、Her3、AuroraA、AuroraB、PLK和PI3激酶、FGFR、PDGFR、Raf、Ras、KSP、IAP(SMAC模拟物)、Bcl-2、Mcl-1、HDAC(组织蛋白去乙酰酶)、GSK3β、PDK1、PTK2、IGF-R或IR。

另外的治疗剂的其他实例是CDK、Akt、src/bcr abl、cKit、cMet/HGF、c-Myc、Flt3、HSP90的抑制剂、hedgehog拮抗剂、JAK/STAT、Mek、mTor、NFκB、蛋白酶体、Rho的抑制剂或泛素化途径抑制剂或Notch信号传导途径的另一抑制剂或c-FLIP(细胞FLICE-抑制蛋白)调节剂。

Aurora抑制剂的实例是(但不限于)PHA-739358、AZD-1152、AT 9283、CYC-116、R-763、VX-680、VX-667、MLN-8045、PF-3814735。

PLK抑制剂的一实例是GSK-461364。

raf抑制剂的实例是BAY-73-4506(也是VEGFR抑制剂)、PLX 4032、RAF-265(另外也是VEGFR抑制剂)、索拉菲尼(sorafenib)(另外也是VEGFR抑制剂)和XL 281。

KSP抑制剂的实例是伊斯平斯(ispinesib)、ARRY-520、AZD-4877、CK-1122697、GSK246053A、GSK-923295、MK-0731和SB-743921。

SMAC模拟物(IAP拮抗剂)的实例是(但不限于)LCL-161、Debio 1143和ASTX-660。

src和/或bcr-abl抑制剂的实例是达沙替尼(dasatinib)、AZD-0530、伯舒替尼(bosutinib)、XL 228(也是IGF-1R抑制剂)、尼罗替尼(nilotinib)(也是PDGFR和cKit抑制剂)、伊马替尼(imatinib)(也是cKit抑制剂)和NS-187。

PDK1抑制剂的实例是BX-517。

Rho抑制剂的实例是BA-210。

PI3激酶抑制剂的实例是PX-866、BEZ-235(也是mTor抑制剂)、XL 418(也是Akt抑制剂)、XL-147和XL 765(也是mTor抑制剂)。

cMet或HGF抑制剂的实例是XL-184(也是VEGFR、cKit、Flt3的抑制剂)、PF-2341066、MK-2461、XL-880(也是VEGFR抑制剂)、MGCD-265(也是VEGFR、Ron、Tie2的抑制剂)、SU-11274、PHA-665752、AMG-102和AV-299。

c-Myc抑制剂的实例是CX-3543。

Flt3抑制剂的实例是AC-220(也是cKit和PDGFR的抑制剂)、KW 2449、来他替尼(lestaurtinib)(也是VEGFR、PDGFR、PKC的抑制剂)、TG-101348(也是JAK2抑制剂)、XL-999(也是cKit、FGFR、PDGFR和VEGFR的抑制剂)、舒尼替尼(sunitinib)(也是PDGFR、VEGFR和cKit的抑制剂)和坦度替尼(tandutinib)(也是PDGFR和cKit的抑制剂)。

HSP90抑制剂的实例是坦螺旋霉素(tanespimycin)、阿螺旋霉素(alvespimycin)、IPI-504和CNF 2024。

JAK/STAT抑制剂的实例是CYT-997(亦与微管蛋白相互作用)、TG 101348(亦是Flt3抑制剂)和XL-019。

Mek抑制剂的实例是ARRY-142886、PD-325901、AZD-8330和XL 518。

mTor抑制剂的实例是替西罗莫司(temsirolimus)、AP-23573(其也用作VEGF抑制剂)、依维莫司(everolimus)(另外是VEGF抑制剂)、XL-765(也是PI3激酶抑制剂)和BEZ-235(也是PI3激酶抑制剂)。

Akt抑制剂的实例是哌立福辛(perifosine)、GSK-690693、RX-0201和曲西瑞宾(triciribine)。

cKit抑制剂的实例是AB-1010、OSI-930(也用作VEGFR抑制剂)、AC-220(亦是Flt3和PDGFR的抑制剂)、坦度替尼(也是Flt3和PDGFR的抑制剂)、阿昔替尼(axitinib)(也是VEGFR和PDGFR的抑制剂)、XL-999(也是Flt3、PDGFR、VEGFR、FGFR的抑制剂)、舒尼替尼(也是Flt3、PDGFR、VEGFR的抑制剂)和XL-820(也用作VEGFR-和PDGFR抑制剂)、伊马替尼(也是bcr-abl抑制剂)、尼罗替尼(也是bcr-abl和PDGFR的抑制剂)。

hedgehog拮抗剂的实例是IPI-609和CUR-61414。

CDK抑制剂的实例是斯利西克(seliciclib)、AT-7519、P-276、ZK-CDK(也抑制VEGFR2和PDGFR)、PD-332991、R-547、SNS-032、PHA-690509和AG 024322。

蛋白酶体抑制剂的实例是硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)和NPI-0052(也是NFκB抑制剂)。

NFκB途径抑制剂的实例是NPI-0052。

泛素化路途径制剂的实例是HBX-41108。

在优选的实施方案中，另外的治疗剂是抗血管生成剂。

抗血管生成剂的实例是FGFR、PDGFR和VEGFR或各自配体的抑制剂(例如VEGF抑制剂，如哌加他布(pegaptanib)，或抗VEGF抗体贝伐单抗(bevacizumab))，和沙立度胺(thalidomides)，此类药剂选自(但不限于)尼达尼布(nintedanib)、贝伐单抗、莫替沙尼(motesanib)、CDP-791、SU-14813、替拉替尼(telatinib)、KRN-951、ZK-CDK(也是CDK抑制剂)、ABT-869、BMS-690514、RAF-265、IMC-KDR、IMC-18F1、IMiDs(免疫调节药物)、沙立度胺衍生物CC-4047、来那度胺(lenalidomide)、ENMD 0995、IMC-D11、Ki 23057、布立尼布(brivanib)、西地尼布(cediranib)、XL-999(也是cKit和Flt3的抑制剂)、1B3、CP 868596、IMC 3G3、R-1530(也是Flt3抑制剂)、舒尼替尼(也是cKit和Flt3的抑制剂)、阿昔替尼(也是cKit抑制剂)、来他替尼(也是Flt3和PKC的抑制剂)、瓦他拉尼(vatalanib)、坦度替尼(也是Flt3和cKit的抑制剂)、帕唑帕尼(pazopanib)、GW 786034、PF-337210、IMC-1121B、AVE-0005、AG-13736、E-7080、CHIR 258、甲苯磺酸索拉菲尼(也是Raf抑制剂)、RAF-265(也是Raf抑制剂)、凡德他尼(vandetanib)、CP-547632、OSI-930、AEE-788(也是EGFR和Her2的抑制剂)、BAY-57-9352(也是Raf抑制剂)、BAY-73-4506(也是Raf抑制剂)、XL 880(也是cMet抑制剂)、XL-647(也是EGFR和EphB4的抑制剂)、XL 820(也是cKit抑制剂)和尼罗替尼(也是cKit和brc-abl的抑制剂)。

另外的治疗剂也可选自EGFR抑制剂，其可为小分子EGFR抑制剂或抗EGFR抗体。抗EGFR抗体的实例是(但不限于)西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)；小分子EGFR抑制剂的实例是(但不限于)吉非替尼(gefitinib)、阿法替尼(afatinib)、奥希替尼(osimertinib)和奥姆替尼(olmutinib)。EGFR调节剂的另一实例是EGF融合毒素。

可与本发明的抗体分子组合使用的EGFR和Her2抑制剂是拉帕替尼(lapatinib)、吉非替尼、埃罗替尼(erlotinib)、阿法替尼、西妥昔单抗、曲妥珠单抗(trastuzumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、凡德他尼(也是VEGFR抑制剂)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、XL-647、HKI-272、BMS-599626、ARRY-334543、AV 412、mAB-806、BMS-690514、JNJ-26483327、AEE-788(也是VEGFR抑制剂)、ARRY-333786、IMC-11F8、Zemab。

可有利地与本发明的抗体分子组合在疗法中的其他药剂是托西莫单抗(tositumumab)和替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(两种经放射性标记的抗CD20抗体)、阿伦单抗(alemtuzumab)(抗CD52抗体)、地诺单抗(denosumab)(破骨细胞分化因子配体抑制剂)、加利昔单抗(galiximab)(CD80拮抗剂)、奥法木单抗(ofatumumab)(CD20抑制剂)、扎木单抗(zanolimumab)(CD4拮抗剂)、SGN40(CD40配体受体调节剂)、利妥昔单抗(rituximab)(CD20抑制剂)、依帕珠单抗(epratuzumab)(CD22抗体)或马帕木单抗(mapatumumab)(TRAIL-1受体激动剂)。

可与本发明的抗体分子组合使用的其他化学治疗药物选自(但不限于)激素、激素类似物和抗激素(例如它莫西芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、氟维司群(fulvestrant)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、乙酸环丙孕酮(cyproterone acetate)、非那雄胺(finasteride)、乙酸布舍瑞林(buserelin acetate)、氟氢可的松(fludrocortisone)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、奥曲肽(octreotide)、阿佐昔芬(arzoxifene)、帕瑞肽(pasireotide)、伐普肽(vapreotide))、芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)、利阿唑(liarozole)、依西美坦(exemestane)、阿他美坦(atamestane)、福美坦(formestane))、LHRH激动剂和拮抗剂(例如乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、柳培林(leuprolide)、阿巴瑞克(abarelix)、西曲瑞克(cetrorelix)、地洛瑞林(deslorelin)、组胺瑞林(histrelin)、曲普瑞林(triptorelin))、抗代谢物(例如抗叶酸剂，如甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、嘧啶类似物(如5氟尿嘧啶、卡培他滨(capecitabine)、地西他滨(decitabine)、奈拉滨(nelarabine)和吉西他滨(gemcitabine))、嘌呤和腺苷类似物(例如巯嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨(cladribine)和喷司他汀(pentostatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟达拉滨(fludarabine)))；抗肿瘤抗生素(例如蒽环类药物，如多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)和伊达比星(idarubicin)、丝裂霉素(mitomycin)-C、博来霉素(bleomycin)、更生霉素(dactinomycin)、普卡霉素(plicamycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、匹杉琼(pixantrone)、链脲菌素(streptozocin))；铂衍生物(例如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin)、洛铂(lobaplatin)、沙铂(satraplatin))；烷基化剂(例如雌莫司汀(estramustine)、氮芥(meclorethamine)、美法仑(melphalan)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、白消安(busulphan)、达卡巴嗪(dacarbazine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、羟基脲(hydroxyurea)、替莫唑胺(temozolomide)、亚硝基脲(例如卡莫司汀(carmustine)和洛莫司汀(lomustine))、噻替派(thiotepa))；抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱，如长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春氟宁(vinflunine)和长春新碱(vincristine)；和紫杉烷(taxane)，如紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)和其配制剂、拉洛他赛(larotaxel)；西莫他赛(simotaxel)；和埃博霉素(epothilone)，如伊沙匹隆(ixabepilone)、帕土匹龙(patupilone)、ZK-EPO)；拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)，如依托泊苷(etoposide)和凡毕复(etopophos)、替尼泊苷(teniposide)、安吖啶(amsacrine)、拓扑替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan))；和各种化学治疗剂，例如阿米福汀(amifostine)、阿那格雷(anagrelide)、干扰素α、丙卡巴肼(procarbazine)、米托坦(mitotane)和卟菲尔钠(porfimer)、贝沙罗汀(bexarotene)、塞来昔布(celecoxib)。

特别优选的是生成ATP的化学治疗剂(例如多柔比星)，其中已证实组合多柔比星与CD73阻断的正面效应(Loi,Proc Natl Acad Sci U S A.2013；110(27):11091-6)。

在某些实施方案中，另外的治疗剂可为另一免疫治疗剂，例如以下各项的调节剂：TIM-1、TIM3、TIM-4、PDL-1(例如阿特珠单抗、阿维鲁单抗或度伐单抗)、PD-L2、LAG3、CTLA-4、半乳糖凝集素9、半乳糖凝集素-1、CD69、CD113、GPR56、CD48、GARP、CAECAM-1、BTLA、TIGIT、CD160、LAIR1、2B4、CEACAM、CD39、TGFβ、IL-10、Fas配体、ICOS、IDO、Toll样受体、B7家族(B7-1、B7-2、B7-H1(PDL-1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)和B7-H6)。

在一些实施方案中，另外的免疫治疗剂是结合至同族TNF受体家族成员的分子的TNF家族成员，所述同族TNF受体家族成员：CD40和CD40L、OX-40、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-lBBL、CD137、GITR、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TLlA、TRAMP/DR3、EDAR、EDAl、XEDAR、EDA2、TNFRl、淋巴毒素α/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTβR、淋巴毒素α1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY、NGFR。

在一些实施方案中，另外的免疫治疗剂选自(i)抑制T细胞活化的细胞因子(例如IL-6、IL-10、TGF-B、VEGF；“免疫抑制性细胞因子”)的拮抗剂和/或(ii)刺激T细胞活化的细胞因子和/或用于刺激免疫应答(例如用于治疗增殖性疾病，例如癌症)的细胞因子(例如IL2)的激动剂。

在一些实施方案中，另外的免疫治疗剂是刺激T细胞活化的蛋白质(例如CD28、GITRL、OX40L、CD27和CD28H)的激动剂。

本文所述的抗CD73抗体也可用于设计使表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向至肿瘤细胞的双特异性抗体(参见例如美国专利第5,922,845号和第5,837,243号，其以引用方式并入本文中)。双特异性抗体可用于靶向两种单独抗原。举例而言，已使用抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如Her-2/neu)双特异性抗体使巨噬细胞靶向至肿瘤位点。此靶向可更有效地活化肿瘤特异性应答。或者，可通过使用结合至肿瘤抗原和树突状细胞特异性细胞表面标记物的双特异性抗体将抗原直接递送至DC。

在其他实施方案中，免疫治疗剂可为癌症疫苗。

可与CD73抗体组合的其他分子包括NK细胞上抑制性受体的拮抗剂或NK细胞上活化受体的激动剂(例如KIR拮抗剂，例如lirilumab)。

在一些实施方案中，另外的治疗剂可为抑制或消耗巨噬细胞或单核细胞的药剂，包括但不限于CSF-1R拮抗剂。

在其他实施方案中，另外的治疗剂可为消耗或阻断Treg细胞的药剂，例如特异性结合至CD25的药剂。

在一些实施方案中，另外的治疗剂可为A2A或A2B受体的抑制剂。实例是(但不限于)ATL-444、伊曲茶碱(Istradefylline)(KW-6002)、MSX-3、瑞德南特(Preladenant)(SCH-420,814)、SCH-58261、SCH-412348、SCH-442416、ST-1535、咖啡因(Caffeine)、VER-6623、VER-6947、VER-7835、韦帕南特(Vipadenant)(BIIB-014)、PD116,948、ZM 241385、KW 6002、CGS 15943、ST1535、SYN-115、PSB1115、PSB 603、MRS 1754、CPI-444、PBF-509、AZD-4635或ZM-241385。

在优选的实施方案中，另一治疗剂是A2AR拮抗剂、CD39拮抗剂、LAG-3拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、EGFR拮抗剂或HER2拮抗剂。

在两种或更多种物质或成分待用作组合治疗方案的一部分时，其可经由相同施用途径或经由不同施用途径在基本上相同时间(即同时、并行)或在不同时间(例如依序、相继、交替、连续或根据交替方案的任一其他方式)施用。

当物质或成分待经由相同施用途径同时施用时，其可作为不同药物配制剂或组合物或作为组合药物配制剂或组合物的一部分来施用。同样，在两种或更多种活性物质或成分待用作组合治疗方案的一部分时，可与在使用化合物或成分自身时的相同量和根据相同方案来施用每一物质或成分，且此类组合使用可或可不产生协同效应。然而，当两种或更多种活性物质或成分的组合使用产生协同效应时，也有可能减少一种、多种或所有待施用的物质或成分的量，而仍达成期望的治疗作用。这可(例如)用于避免、限制或降低在以常用量使用时与使用一或多种物质或成分有关的任何不期望的副作用而仍获得期望的药理学或治疗效应。

当然，上文包括用于与上述组合配偶体组合使用的本发明抗体的制剂和制备方法。还包括用于与本发明的抗体组合使用的上文所提及的组合配偶体的制剂和制备方法。

本发明的抗体分子可单独使用或与其他治疗方案(例如手术和/或放射疗法)组合使用。

试剂盒以及制造和纯化方法

本发明还涵盖试剂盒，其至少包含如本文所述的抗CD73抗体和一种或多种选自由用于治疗如上文所述的疾病和病症的其他药物组成的组的其他组分。

在一实施方案中，该试剂盒包含含有有效量的呈单位剂型的本发明的抗CD73抗体分子的组合物。在另一实施方案中，该试剂盒包含含有有效量的呈单位剂型的本发明的抗CD73抗体分子的组合物；和含有有效量的呈单位剂型的PD-1拮抗剂(例如抗PD-1抗体，最优选为如本文所述的PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4和PD1-5)的组合物。

在一些实施方案中，该试剂盒包含含有此类组合物的无菌容器；此类容器可为盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装或本领域已知的其他适合的容器形式。此类容器可由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适于容纳药剂的其他材料制得。

若期望，则抗CD73抗体分子(单独或与另一治疗剂，例如PD-1拮抗剂组合)与关于向患有癌症的个体施用一种或多种抗体的说明书一起提供。说明书通常将包括关于使用组合物治疗或预防癌症的信息。在其他实施方案中，说明书包括以下各项中的至少一项：治疗剂的描述；用于治疗或预防癌症或其症状的剂量方案和施用；注意事项；警告；适应症；禁忌症；超剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文献。说明书可直接印刷在容器(存在时)上或以标记施加至容器，或在容器中或与其一起供应的单独纸张、小册子、卡片或活页夹形式。

在一些实施方案中，该试剂盒包含如本文所述的抗CD73抗体分子连同PD-1拮抗剂(如本文进一步所述的)和任选地如上文所述的另一治疗剂。

本发明进一步提供制造本发明的抗体分子的方法，此类方法通常包括以下步骤：

-在允许形成本发明的抗体的条件下培养包含含有编码本发明的抗体分子的核酸的表达载体的宿主细胞；和

-从培养物回收由宿主细胞表达的抗体分子；和

-任选地进一步纯化和/或修饰和/或配制本发明的抗体分子。

本发明的核酸可为(例如)包含编码序列以及调控序列和任选的天然或人工内含子的DNA分子，或可为cDNA分子。其可具有其原始密码子或可具有特别适于在预期宿主细胞或宿主生物体中表达的经优化的密码子使用。根据本发明的一实施方案，本发明的核酸为如上文所定义的基本上分离的形式。

本发明的核酸通常并入表达载体(即可在被转染至适合的宿主细胞或其他表达系统中时表达多肽的载体)中。

为制造本发明的抗体，本领域技术人员可自本领域熟知的诸多表达系统(例如由Kipriyanow和Le Gall,2004综述的表达系统)中进行选择。

表达载体包括质粒、逆转录病毒、黏粒、EBV衍生的附加体等。表达载体和表达控制序列经选择与宿主细胞兼容。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入分开的载体中。在某些实施方案中，将两个DNA序列插入同一表达载体中。

便利的载体是编码功能完整的人CH(重链恒定区)或CL(轻链恒定区)免疫球蛋白序列的载体，其中工程化改造适当限制位点以便可容易地插入和表达任一VH(重链可变区)或VL(轻链可变区)序列，如上文所述的。对于抗体重链而言，其可为(但不限于)任一IgG同种型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)或其他免疫球蛋白(包括等位基因变体)。

重组表达载体还可编码有利于从宿主细胞分泌抗体链的信号肽。可将编码抗体链的DNA克隆至载体中，从而信号肽框内连接至成熟抗体链DNA的氨基末端。信号肽可为免疫球蛋白信号肽或来自非免疫球蛋白蛋白质的异源肽。或者，编码抗体链的DNA序列可已含有信号肽序列。

除抗体链DNA序列外，重组表达载体通常携载调控序列、任选地异源调控序列，其包括启动子、增强子、终止和多聚腺苷酸化信号和其他控制抗体链在宿主细胞中的表达的表达控制元件。启动子序列的实例(针对哺乳动物细胞中的表达进行示例)是衍生自CMV(例如CMV猿肾病毒40(SV40)启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))、多瘤病毒的启动子和/或增强子和强哺乳动物启动子(例如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子)。多聚腺苷酸化信号的实例是BGH聚A、SV40晚期或早期聚A；或者，可使用免疫球蛋白基因的3′UTR等。

重组表达载体也可携载调控宿主细胞中的载体复制的序列(例如复制起点)和可选的标记基因。可根据本领域熟知的转染方法(包含脂质体介导的转染、多聚阳离子介导的转染、原生质体融合、微注射、磷酸钙沉淀、电穿孔或通过病毒载体的转移)将编码本发明抗体的重链或其抗原结合部分和/或轻链或其抗原结合部分的核酸分子和包含此类DNA分子的载体引入宿主细胞(例如细菌细胞或高等真核细胞(例如哺乳动物细胞))中。

优选地，编码重链和轻链的DNA分子存在于共转染至宿主细胞(优选为哺乳动物细胞)中的两个表达载体上。

可用作表达宿主的哺乳动物细胞系在本领域已众所周知且尤其包含中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0、SP2/0细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类癌细胞(例如Hep G2和A549细胞)、3T3细胞或任一此类细胞系的衍生物/后代。可使用其他哺乳动物细胞(包含(但不限于)人类、小鼠、大鼠、猴和啮齿类动物细胞系)或其他真核细胞(包含(但不限于)酵母、昆虫和植物细胞)或原核细胞(例如细菌)。

通过将宿主细胞培养足以允许在宿主细胞中表达抗体分子的时间段来产生本发明的抗体分子。抗体分子优选是从培养基以经分泌的多肽形式回收或其可从宿主细胞溶解物回收(若例如在无分泌信号下表达)。需要使用用于重组蛋白和宿主细胞蛋白的标准蛋白质纯化方法以获得抗体的基本上均质制剂的方式来纯化抗体分子。举例而言，可用于获得本发明的抗体分子的最新技术的纯化方法包含(作为第一步骤)从培养基或溶解物去除细胞和/或微粒细胞碎片。然后(例如)通过免疫亲和力或离子交换柱上级分分离、乙醇沉淀、反相HPLC、Sephadex层析、二氧化硅或阳离子交换树脂上的色谱从污染物可溶性蛋白、多肽和核酸纯化抗体。作为获得抗体分子制剂的过程中的最终步骤，可干燥(例如冻干的)经纯化的抗体分子，如下文针对治疗应用所描述的。

通过下列实施例进一步阐释本发明，且无需限于本发明的此类实施方案。实施例或其部分(包括化合物、剂量和施用途径以及治疗组合)各自本身或与上述详述描述组合形成本发明的一部分。

实施例

实施例1：针对CD73的抗体的生成和优化

使用具有C-末端6xHis标签的人CD73(UniProt登录号P21589)的完整细胞外结构域和小鼠CD73(UniProt登录号Q61503；具有C-末端人Fc标签(SEQ ID NO:131)的完整细胞外结构域对CD73敲除小鼠实施免疫。鉴别采样且通过使用单一B细胞抗体生成平台进行回收。针对与人、食蟹猕猴、小鼠和大鼠CD73的结合对其进行筛选，且在功能测定中测试CD73抑制，如实施例2至6中所阐述。使用根据这些测定法具有最佳性质组的抗体分子作为其他优化变体的基础。

使用噬菌体筛选方法将来自此类抗CD73小鼠抗体的CDR序列优化至来自重链和轻链密切匹配种系的人框架(如由Singh等人，MAbs.2015Jul-Aug；7(4):778-791所述的)。通过ELISA评估变体的结合活性。选择对人CD73具有高亲和力且具有高人类残基比率和低预测的免疫原性(低Epivax评分)的变体。

实施例2：靶结合和细胞选择性

对于亲合力形式而言，在Bio-Rad ProteOn XPR36仪器上实施实验。经由蛋白质A/G捕获抗体且使非共价二聚体抗原流经捕获表面上方。在PBS-T-EDTA中制备此实验的运行缓冲液和所有稀释液。将GLM传感器芯片归一化并根据制造商的推荐进行预条件化。使用EDC/s-NHS的等量混合物以30μL/min的流速在水平方向上活化传感器芯片300s并使用重组蛋白A/G(50μg/ml，在10mM乙酸盐(pH 4.5)中)以30μL/min的流速在水平方向上固定300s，从而在表面上产生约5000RU蛋白质A/G。使用1M乙醇胺-HCl以30μL/min的流速在水平方向上将传感器芯片钝化300s。使用0.85％磷酸(18s)以100μL/min的流速将传感器芯片水平再生2次并垂直再生2次。

将约300RU抗体以30μL/min的流速垂直捕获在蛋白质A/G表面上60s。通过以100μL/min的流速水平注射PBS-T-EDTA 60s来稳定捕获表面。将分析物(人CD73-His)以30μL/min的流速水平注射在所捕获抗体上600s且解离1200s。人CD73-His的浓度为0nM、3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM和50nM。通过以100μL/min的流速水平注射0.85％磷酸18s一次且垂直注射一次来再生表面。

从原始数据减去中间点(与传感器表面的相互作用)和空白(PBS-T-EDTA或0nM分析物)。使用Bio-Rad ProteOn Manager软件，将传感图整体拟合至1:1朗格缪尔(Langmuir)结合以提供缔合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡解离常数(KD)值。

表1:通过SPR获得的抗CD73抗体与CD73的结合亲合力

使用内源性表达CD73的细胞系以及CD73阴性细胞系在基于FACS的测定法中测定细胞选择性。在CD73阳性细胞中，易于检测到结合，而在CD73阴性细胞中，在高达1000nM浓度时未观察到可检测的结合。

还通过SPR测定抗CD73与小鼠CD73的结合且与对人CD73(P21589，“长同种型”)的结合进行比较。

所测试的抗体以高于对小鼠CD73的亲和力结合至人CD73(与人CD73的结合高于与小鼠CD73的结合：C1：96倍；C2：138倍；C3：117倍；C4：120倍；C5：163倍，C6：58倍)。

实施例3：CD73酶功能的抑制

使用基于荧光素酶的测定来测量CD73酶功能。CD73底物AMP是荧光素酶反应的产物且针对荧光素酶表现出抑制活性。封闭板，随后添加重组人CD73蛋白。然后添加不同浓度的CD73抗体。混合板并在37℃下孵育10min。添加底物AMP，混合板并在37℃下孵育30min。将CellTiterGlo试剂(CellTiterGlo发光细胞活力测定试剂盒，Promega，目录号G7571)溶于试剂缓冲液中并添加至每个孔中。混合板并在室温下在暗处孵育10min。使用EnVision2104 Multilabel读数仪测量发光信号。

如表2中所示，本文所述的CD73抗体表现出抑制CD73酶功能的低纳摩尔级IC

表2：通过抗CD73抗体抑制CD73酶功能。

实施例4：CD73蛋白表面水平的降低。

通过流式细胞术测定CD73蛋白表面水平的降低。将Colo201细胞系与CD73抗体一起孵育1h和24h，且使用第二抗体测量细胞表面上的CD73结合抗体的水平。

通过添加TripLE溶液(Gibco，编号12604-013)来分离Colo201细胞并接种于96孔板中。在24小时之后，添加CD73抗体。在1小时和24小时之后通过流式细胞术使用经标记的第二抗体来分析样品。使用FlowJo X软件10.0.7r2版实施样品分析。将门控群体的平均荧光强度(FI)归一化至其在时间点0下的相应平均FI(与CD73抗体一起孵育1h)。然后归一化数据，其中将与不诱导CD73表面水平降低的CD73抗体(如在US20090203538中公开为“067-213抗体”)一起孵育的细胞的荧光值设定于100％(最大CD73水平)。

本文所述的CD73抗体表现出诱导CD73表面水平降低的中等活性。所示数据来自至少两个独立实验。

表3：通过抗CD73抗体来降低CD73表面水平。

实施例5：细胞系中的腺苷形成的抑制

使用基于细胞的测定法来测定通过CD73抑制所实现的腺苷水平降低。向Colo-201细胞中添加AMP使得通过表达在细胞上的CD73将AMP转化成腺苷。AMP的转化受如本文所提供的本发明的抗CD73抗体抑制。将Colo-201细胞在CD73抗体存在下于37℃下培养24小时。然后添加含有红9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤的封闭溶液以封闭腺苷脱胺酶，添加含有5-碘杀结核菌素的封闭溶液以封闭腺苷激酶，添加含有β-甘油磷酸盐的封闭溶液以封闭碱性磷酸酶，且添加含有双嘧达莫(dipyridamole)的封闭溶液以封闭ENT1-4(Ramakers 2008)。在孵育20分钟之后，添加300μM AMP 30分钟且通过添加15mM HCl溶液来终止反应。在96孔板形式中，将从每个mAb浓度孵育获取的细胞上清液的50μl等分试样添加至含有0.5mM经同位素标记的

与+/-AMP添加的同种型处理的细胞相比，本文所述的CD73抗体将Colo201细胞中的腺苷水平减小>75％。

与参考抗CD73抗体“MEDI9447”和“BMS986179”(如上文所定义)相比，本文所述的抗CD73抗体在减小Colo201细胞中的腺苷水平方面表现出优良活性，如表4中所显示的。

表4：Colo201细胞中的腺苷形成的抑制。

实施例6：T细胞增殖和IFNγ释放的诱导。

使用原代人T细胞测定来探究CD73抑制对T细胞的作用。将来自STEMCELLTechnologies的人外周血单核细胞(PBMC)解冻且通过阴性选择(T细胞富集试剂盒，EasySep阴性选择；Stem Technologies 19051号)富集T细胞。供体是内部标记的供体A-F。使用Cell Trace Violet(CellTraceTM Violet Proliferation试剂盒，Molecular Probes，C34557号)根据制造商方案来标记T细胞。在4℃下在经抗CD3(Ultra-LEAFTM纯化抗CD3抗体，克隆HIT3a,Biolegend,300332号)预包被的96孔圆底板中过夜实施测定。平铺经CTV标记的T细胞并与抗CD28(Ultra-LEAFTM纯化抗CD28抗体，克隆CD28.2；Biolegend,302934号)和抗huCD73或抗TNP HuIgG1KO对照在不同浓度下一起孵育。在37℃和5％CO

本文所述的CD73抗体恢复T细胞增殖和细胞因子释放。

与“MEDI9447”和“BMS986179”相比，本文所述的抗体在诱导某些供体中的原代人T细胞中的T细胞增殖和IFNγ释放方面表现出优良活性(表5和6)。因此，与两种竞争剂分子相比，所生成的CD73抗体能够将某些供体中的由AMP抑制的T细胞功能恢复至较高程度。

表5：CD8 T细胞增殖，以对照(+/-AMP的同种型处理的细胞，其中将不添加AMP的经刺激的同种型处理的细胞设定于100％且将添加AMP的经刺激的同种型处理的细胞设定于0％)的[％]形式提供；n.d.：未测定

表6：IFNγ释放[较对照的倍数变化]。对照是添加AMP的经刺激的同种型处理的细胞。

上表5和6证实，与“MEDI9447”和“BMS986179”相比，所测试的抗CD73抗体在诱导某些供体中的T细胞增殖和IFNγ释放方面表现出优良活性。数据是来自在1nM的CD73抗体浓度下的头对头比较；每个供体使用4个生物学重复。

实施例7：树突状细胞/T细胞共培养

另外，确立树突状细胞/T细胞共培养系统。通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心从健康供体的肝素化血液分离人外周血单核细胞(PBMC)并冷冻储存在-150℃下。将PBMC解冻且通过阴性选择(磁珠)富集单核细胞。将单核细胞与3ng/ml人IL-4和50ng/ml人GM-CSF在37℃和5％CO

可在此系统中探究抑制PD1、CD73或二者的作用。发现添加AMP会抑制抗PD1应答，且使用本文所提供抗体的抗CD73处理可逆转此AMP介导的抑制(参见图1)。所示数据是来自在1μg/ml的CD73抗体浓度下的头对头比较；每个供体和抗体使用5个生物学重复。

实施例8：结合细胞与非结合细胞的CD73的抑制

将Colo-201细胞与CD73抗体在37℃下一起孵育24小时，然后添加封闭溶液(参见“细胞系中的腺苷形成的抑制”)20分钟。通过离心来沉淀细胞且将上清液转移至新低结合板中。洗涤细胞且将300μM AMP添加至细胞以及上清液中。在30分钟的孵育时间之后，通过添加15mM HCl溶液来终止反应。获取上清液并与乙腈/封闭溶液混合物混合以终止可能的酶反应。通过液相色谱-质谱分析样品的腺苷水平。此使得可探究结合细胞的CD73的抑制与细胞培养上清液中的CD73(非结合细胞的CD73)的抑制。将针对不添加AMP的同种型处理所获得的腺苷水平设定为100％抑制；将针对添加AMP的同种型处理所获得的腺苷水平设定为0％抑制。如表7和8中所显示，根据本发明的CD73抗体(尤其C1、C2、C3、C4、C5和C6)将结合细胞的CD73以及存在于细胞培养上清液中的CD73(非结合细胞的CD73)抑制70-80％。“MEDI9447”对结合细胞的CD73显示大约20％的较低抑制活性。“MEDI9447”和“BMS 986179”在抑制存在于细胞培养上清液中的CD73方面均表现出较低活性。因此，与两种竞争剂分子相比，根据本发明的CD73抗体更完全地抑制CD73。

表7：结合细胞的CD73的抑制

表7显示，本发明的抗体在抑制结合细胞的CD73方面优于现有技术的对比抗体“MEDI 9447”。所示数据是来自除抗体C2(n＝1)外的至少两个独立实验。

表8：非结合细胞的CD73的抑制

表8显示，本发明的抗体在抑制细胞培养上清液中的CD73方面优于现有技术的对比抗体“MEDI 9447”和/或“BMS 986179”。所示数据是来自除抗体C2(n＝1)外的至少两个独立实验。

实施例9：抗CD73抗体和CD73的复合物形成

使用CD73和两种不同抗体的样品通过沉降速度分析型超速离心(“SV-AUC”)实验以单一组分形式和以具有1:1CD73:抗体摩尔比率的混合物形式来探究CD73和两种抗CD73抗体的复合物的寡聚状态。对于280nm下的最佳信号噪声比而言，在2.4μM的浓度下检查混合物。还在2.4μM的浓度下检查CD-73蛋白和本发明的抗体的各个等分样品以促进g(s)对比。在混合和离心之前，将CD73蛋白和本发明的抗体透析至PBS缓冲液中。

通过制作g(s)分布曲线(通过转变原始数据)来定性分析SV-AUC实验，且通过各种曲线拟合算法来更定量地分析。对于少分散不可逆系统或浓度大于或等于2个数量级的上文所有相互作用K

CD73 HuCD73_加His标签，二聚体分子量(道尔顿)：118,032，部分比容：0.73744，A280/mg/ml/cm 0.954，储存缓冲液：1×PBS，0.2M蔗糖，0.01％CHAPS，5％甘油，1mM TCEP，pH-7.2。

抗CD73抗体C04，计算分子量为148,232Da，包含3000Da糖基化。抗CD73抗体“MEDI9447”，计算分子量为150,669Da，包含所估计的3000Da糖基化。

使用Beckman XL-I分析型超速离心器(Beckman Coulter,Brea,California)收集SV-AUC实验的数据。在每一实验当天，视需要将储存于适当储存温度下的样品解冻，且在室温下通过移液管轻微混合，并稀释至产生信号检测器的线性范围内的吸光度信号的浓度。将样品加载至具有蓝宝石或石英窗口的经木炭填充的epon单元的样品分区中。向样品分区中加载400μL经稀释样品。在单元的参考分区中使用406μL匹配缓冲液。使用分析型4孔钛An-60 Ti转子(Beckman Coulter)实施实验。将校准平衡物置于孔4中。在3000RPM下实施初始扫描以验证单元完整性并实施径向仪器校准。同样，在每一单元上以3000RPM实施波长扫描以验证吸光度。使样品在20℃下达到温度平衡并保持至少2h，然后开始在高速度(40,000RPM)下离心。通过280nm下的吸光度扫描来收集每一单元的数据扫描(报告浓度作为径向位置的函数)，径向步长为0.003cm，连续扫描，每一信道1次闪光。

扫描是选自第一次扫描至样品粒化后的约第10次扫描。在样品已经粒化后的过度扫描不含有任何信息且使基线贡献过重。输入缓冲液性质和通过蛋白质序列计算的部分比容估计值作为用于曲线拟合的参数。使用软件包SEDFIT 15.01b版(Schuck BiophysJ.2000Mar；78(3):1606-19)分析产生连续c(s)分布的数据。

使用程序SEDANAL(www.sedanal.org；Biophysical Chemistry 108(2004)231-243)实施表观沉降系数分布函数、g(s)曲线和全边界曲线拟合。检查所有c(r)数据文件且视需要将元数据(例如弯液面位置、拟合范围、单元基数和光学校正)书写成信道数据文件(SEDANAL的*.abr文件)。g(s)绘图是表观沉降分布函数绘图且代表表观沉降系数的x轴(或速度轴)和g(s)函数的y轴上的原始数据的转变(c(r)数据的导数形式)。这是无模型转变且峰位置代表边界速度，而边界宽度代表单一种类的扩散或多种类的扩散和生长中分离(若存在多种类的话)。使用少量c(r)对来生成每一g(s)绘图。g(s)绘图的确切形状取决于时间跨度和自开始循环用于生成绘图的数据所经过的时间。在x轴上，甚至单一理想种类的g(s)也将变得较窄且较高并与自沉降开始扫描的经过时间成正比。可使用g(s)绘图的时间跨度匹配组的覆盖图来证实或推翻经稀释系列的相同样品的可逆自缔合。

SEDANAL还对通过dc/dt(浓度变化除以时间变化)操作转变的原始数据实施直接曲线拟合。使用由用户指定的模型，SEDANAL对数据信道亚组的dc/dt曲线进行非线性最小平方曲线拟合以获得数据的最佳模型拟合参数。SV-AUC是可将诸多模型的拟合优度分级以帮助分析员选择最佳数据拟合模型的少数生物物理学方法之一。

结果

运行CD73的样品且通过SEDANAL和SEDFIT拟合曲线。

运行C04的样品且通过SEDANAL和SEDFIT拟合曲线

运行样品“MEDI9447”且通过SEDANAL和SEDFIT拟合曲线

通过c(s)和SEDANAL曲线拟合混合物并不返回可靠结果且结论为存在过多种类以致不能解卷积。为进行定性对比，制作g(s)覆盖图(参见图2)。

斯维德贝格(Svedberg)和分子量之间的关联：

实施例10：晶体学

CD73蛋白：

CD73蛋白构建体基于Knapp,K.等人(2012)Structure 20:2161-2173(

FAB：

通过肠激酶切割来获得本发明的抗CD73抗体的Fab片段。

使蛋白质复合化(Fab片段和CD73)，通过凝胶过滤纯化并在10mM Tris、150mMNaCl(pH＝8)中浓缩至21mg/ml。在20℃下通过混合0.2μl的含有12％PEG8000、0.1M MOPS(pH 7.6)和0.1M乙酸镁的溶液与0.2μL蛋白质溶液来获得晶体。在3天之后，生长出片型晶体。将晶体转移至补充有25％PEG400的储存溶液中并急冻于液氮中。在瑞士光源(SwissLight Source)下收集衍射数据且通过分子置换来解析结构。模型构建和改进可产生图3中所绘示的CD73:抗CD73 Fab复合物的晶体结构。

实施例11：用于i.v.施用的药物配制剂

可选择本发明的上述抗体分子中的任一者来制造用于静脉内施加且具有如下组成的药物配制剂：

药物物质：50mg/ml

组氨酸缓冲液：10mM,pH 6.0

蔗糖：220mM

聚山梨醇酯20：0.02％

将上述组合物在注射用水(WFI)中配制成具有上述组成的溶液，灭菌并在2℃至8℃下储存于10ml小瓶中。上述组合物可任选地提供为在使用之前在WFI中重构的冻干配制剂形式。

实施例12：在人类中的药物用途

通过静脉内输注(0.05mg至50.0mg/千克体重和剂量的剂量)每两周至四周将上文实施例9中所概述的溶液施加至有此需要的患者(例如患有癌症的人类)。

根据实施例，制备本发明的诸多不同抗CD73抗体。在下表中，提供此类抗体的序列。A1、A2、A3和A4分别是鼠类抗体。B1、B2、C1、C2、C3、C4、C5和C6分别是人源化抗体。根据如本文所述的IMGT定义来提供CDR序列。

另外，提供本发明的抗PD1抗体(分别称为PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4和PD1-5)的序列。

表9：本发明的抗CD73和抗PD1抗体的CDR、VH、VL、轻链和重链的氨基酸序列和SEQID NO。

序列表

<110> 勃林格殷格翰国际有限公司

<120> 拮抗性CD73抗体

<130> 12-0426-WO1

<160> 131

<170> BiSSAP 1.2

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A1 - HCDR1

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr Tyr Met Ser

1 5 10

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A1 - HCDR2

<400> 2

Thr Ile Asn Gly Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A1 - HCDR3

<400> 3

Gly Gly Pro Tyr Ser Asn Tyr Val Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A1 - LCDR1

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Thr Ser Ser Tyr Thr Tyr Met His

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A1 - LCDR2

<400> 5

Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A1 - LCDR3

<400> 6

Gln His Ser Trp Glu Asn Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A2 - HCDR1

<400> 7

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser Tyr Ile Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A2 - HCDR2

<400> 8

Trp Ile Tyr Ala Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Thr

1 5 10 15

Asp

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A2 - HCDR3

<400> 9

His Val Asn Trp Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A2 - LCDR1

<400> 10

Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Val

1 5 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A2 - LCDR2

<400> 11

Trp Ala Ser Ser Arg His Thr

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A2 - LCDR3

<400> 12

Gln Gln Tyr Arg Ser Tyr Pro Trp Thr

1 5

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A3 - HCDR1

<400> 13

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met His

1 5 10

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A3 - HCDR2

<400> 14

Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A3 - HCDR3

<400> 15

Leu Leu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A3 - LCDR1

<400> 16

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A3 - LCDR2

<400> 17

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A3 - LCDR3

<400> 18

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A4 - HCDR1

<400> 19

Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr Val Met Ser

1 5 10

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A4 - HCDR2

<400> 20

Thr Ile Ser Ser Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A4 - HCDR3

<400> 21

Arg Glu Thr Ala Arg Ala Thr Gly Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 22

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A4 - LCDR1

<400> 22

Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Thr

1 5 10

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A4 - LCDR2

<400> 23

Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A4 - LCDR3

<400> 24

Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp Thr

1 5

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B1 - HCDR1

<400> 25

Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr Val Met Ser

1 5 10

<210> 26

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B1 - HCDR2

<400> 26

Thr Ile Ser Ser Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B1 - HCDR3

<400> 27

Arg Glu Thr Ala Arg Ala Thr Gly Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B1 - LCDR1

<400> 28

Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Thr

1 5 10

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B1 - LCDR2

<400> 29

Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B1 - LCDR3

<400> 30

Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp Thr

1 5

<210> 31

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B2 - HCDR1

<400> 31

Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr Val Met Ser

1 5 10

<210> 32

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B2 - HCDR2

<400> 32

Thr Ile Ser Ser Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 33

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B2 - HCDR3

<400> 33

Arg Glu Thr Ala Arg Ala Thr Gly Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 34

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B2 - LCDR1

<400> 34

Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Asp Val Thr

1 5 10

<210> 35

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B2 - LCDR2

<400> 35

Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B2 - LCDR3

<400> 36

Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp Thr

1 5

<210> 37

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C1 - HCDR1

<400> 37

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met His

1 5 10

<210> 38

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C1 - HCDR2

<400> 38

Ala Ile Tyr Pro Gly Phe Ser Asp Thr Thr Tyr Ser Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 39

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C1 - HCDR3

<400> 39

Leu Leu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 40

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C1 - LCDR1

<400> 40

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 41

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C1 - LCDR2

<400> 41

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 42

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C1 - LCDR3

<400> 42

Gln Gln Gly Glu Thr Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 43

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C2 - HCDR1

<400> 43

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met His

1 5 10

<210> 44

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C2 - HCDR2

<400> 44

Ala Ile Tyr Pro Gly Leu Ser Asp Thr Thr Tyr Ser Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 45

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C2 - HCDR3

<400> 45

Leu Leu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 46

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C2 - LCDR1

<400> 46

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 47

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C2 - LCDR2

<400> 47

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 48

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C2 - LCDR3

<400> 48

Gln Gln Gly Glu Thr Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 49

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C3 - HCDR1

<400> 49

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met His

1 5 10

<210> 50

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C3 - HCDR2

<400> 50

Ala Ile Tyr Pro Gly Leu Ser Asp Thr Thr Tyr Ser Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 51

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C3 - HCDR3

<400> 51

Leu Leu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 52

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C3 - LCDR1

<400> 52

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 53

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C3 - LCDR2

<400> 53

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 54

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C3 - LCDR3

<400> 54

Gln Gln Gly Glu Thr Leu Pro Trp Thr

1 5

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met His

1 5 10

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C4 - HCDR2

<400> 56

Ala Ile Tyr Pro Gly Leu Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C4 - HCDR3

<400> 57

Leu Leu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C4 - LCDR1

<400> 58

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 59

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C5 - HCDR2

<400> 62

Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

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Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C5 - HCDR3

<400> 63

Leu Leu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C5 - LCDR1

<400> 64

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Ser Tyr Leu Asn

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C5 - LCDR2

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Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C6 - HCDR2

<400> 68

Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

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Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C6 - HCDR3

<400> 69

Leu Leu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C6 - LCDR2

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Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C6 - LCDR3

<400> 72

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 73

Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Leu Gly Gly

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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Asn Gly Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Pro Tyr Ser Asn Tyr Val Trp Phe Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A1 - VL

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Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Thr Ser

20 25 30

Ser Tyr Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp

85 90 95

Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Gln Gly Gln Met Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr

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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Ile Ser Trp Leu Lys Gln Arg Pro Arg Gln Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Trp Ile Tyr Ala Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Thr Asp Lys Ala Gln Val Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Val Asn Trp Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A2 - VL

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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala

20 25 30

Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Ser Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Leu Thr Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Arg Ser Tyr Pro Trp

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 77

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Asp

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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Lys Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A3 - VL

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Glu Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp His Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Trp Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A4 - VH

<400> 79

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Ala Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Met Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A4 - VL

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Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp

20 25 30

Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Asn Thr Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B1 - VH

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

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<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B1 - VL

<400> 82

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp

20 25 30

Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B2 - VH

<400> 83

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Ser Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Arg Glu Thr Ala Arg Ala Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 84

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B2 - VL

<400> 84

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Asp

20 25 30

Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 85

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C1 - VH

<400> 85

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Phe Ser Asp Thr Thr Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Lys Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Leu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

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<210> 86

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C1 - VL

<400> 86

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Trp Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Glu Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 87

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C2 - VH

<400> 87

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Leu Ser Asp Thr Thr Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Lys Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 88

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C2 - VL

<400> 88

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Trp Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Glu Thr Leu Pro Trp

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 89

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C3 - VH

<400> 89

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Leu Ser Asp Thr Thr Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Lys Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Leu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 90

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C3 - VL

<400> 90

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Trp Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Glu Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 91

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C4 - VH

<400> 91

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Leu Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Lys Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Leu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 92

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C4 - VL

<400> 92

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Trp Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Glu Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 93

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C5 - VH

<400> 93

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Lys Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Leu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 94

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C5 - VL

<400> 94

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Trp Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Glu Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 95

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C6 - VH

<400> 95

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Lys Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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35 40 45

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50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

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Gly Lys

450

<210> 104

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A4 - LC

<400> 104

Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly

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210

<210> 105

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B1 - HC

<400> 105

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

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Gly Lys

450

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<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B1 - LC

<400> 106

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp

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210

<210> 107

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B2 - HC

<400> 107

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ala Lys Arg Glu Thr Ala Arg Ala Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

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165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

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<211> 218

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