相关申请的交叉引用
本申请要求2018年5月3日提交的美国临时申请号62/666,504和2018年5月3日提交的美国临时申请号62/666,509的优先权，所述申请的公开内容以引用的方式并入本文。
政府权利
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的NS065667和NS095773下在政府支持下完成的。美国政府拥有本发明的某些权利。
对序列表的引用
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背景技术
微管相关蛋白tau(MAPT或tau)在神经元的形态学和生理学方面起着重要作用。Tau具有全长蛋白的六种不同同种型，并经历许多可能的翻译后修饰，包括乙酰化、糖基化和磷酸化。磷酸化对于调节tau在轴突稳定中的正常功能是重要的，并且可以在超过80个不同残基上发生。但是，tau的过度磷酸化似乎增加了tau聚集成主要由超磷酸化tau组成的细胞内不溶性成对螺旋丝(PHF)和神经原纤维缠结(NFT)的可能性。
大脑皮质中的细胞内神经原纤维缠结是阿尔茨海默氏病(AD)的明确病理特征，并且与细胞外淀粉样蛋白-β(Aβ)斑块出现很长时间之后临床症状的发作有关，所述斑块在症状发作前开始发展了二十年。在AD中，脑脊液(CSF)中可溶性p-tau和未磷酸化tau增加了两倍。已经提出这些变化反映了将tau和NFT被动释放到CSF中的神经元死亡(神经变性)的作用。但是，在具有显著NFT病理和神经变性的其他tau蛋白病(例如进行性核上性麻痹、额颞叶变性-tau)中，可溶性p-tau和总tau的CSF水平不会增加。这些观察结果表明，Aβ可能触发导致AD的独特tau蛋白病的过程，这一观点得到了细胞和动物模型的支持。在人类中存在淀粉样蛋白斑块时，可溶性tau的主动产生的增加进一步支持了这一概念。
尽管tau包含标志性AD病理并且可以聚集或可溶形式测量，但是在对这种关键神经元蛋白的翻译后修饰如何在人类中导致NFT和神经变性的发展的理解中仍然存在重要的空白。例如，tau与淀粉样蛋白β斑块的关系是未知的。同样，尚不知道在AD的临床前和临床阶段期间，tau会发生什么病理生理变化(如果有的话)。因此，尚不清楚tau可以在多大程度上(如果有的话)用于在与AD相关的症状发作之前对受试者进行分期并指导治疗决定。
因此，在本领域中仍需要定量tau磷酸化的改进方法。
发明内容
在一个方面，本公开涵盖一种将受试者诊断为由于阿尔茨海默氏病(AD)而转化为轻度认知损害(MCI)的风险增加的方法。所述方法包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并在所述分离的tau样品中测量在选自T181、T205和T217的一个或多个氨基酸残基处的tau磷酸化，并且任选地测量总tau；以及(b)当如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的，所测得的磷酸化水平显著偏离不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中的平均值时，将受试者诊断为由于AD而转化为MCI的风险增加。可替代地或另外地，使用在T181、T205和/或T217处的tau磷酸化的测量，任选地使用总tau的测量，可使用由所测量的磷酸化水平计算的比率或由所测量的磷酸化水平和总tau计算的比率。由测量的磷酸化水平计算的比率可以是p-T181与p-T205之间、p-T217与p-T205之间或p-T181与p-T217之间的比率。由测量的磷酸化水平和总tau计算的比率可以是p-T181与总tau之间、p-T205与总tau之间或p-T217与总tau之间的比率。也可以使用除比率之外的数学运算。
在另一方面，本公开涵盖一种在由阿尔茨海默氏病(AD)引起的轻度认知损害(MCI)发作之前对受试者进行分期的方法。所述方法包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并在所述分离的tau样品中测量在选自T181、T205和T217的一个或多个氨基酸残基处的tau磷酸化，并且任选地测量总tau；以及(b)当如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的，所测得的磷酸化水平显著偏离不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中的平均值时，将受试者诊断为距由AD引起的MCI发作一定年数。可替代地或另外地，使用在T181、T205和/或T217处的tau磷酸化的测量，任选地使用总tau的测量，可使用由所测量的磷酸化水平计算的比率或由所测量的磷酸化水平和总tau计算的比率。由测量的磷酸化水平计算的比率可以是p-T181与p-T205之间、p-T217与p-T205之间或p-T181与p-T217之间的比率。由测量的磷酸化水平和总tau计算的比率可以是p-T181与总tau之间、p-T205与总tau之间或p-T217与总tau之间的比率。也可以使用除比率之外的数学运算。
在另一方面，本公开涵盖在阿尔茨海默氏病(AD)症状发作之后对受试者进行分期的方法。所述方法包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并在所述分离的tau样品中测量在选自T181、T205和T217的一个或多个氨基酸残基处的tau磷酸化，并且任选地测量总tau；以及(b)当如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的，所测得的磷酸化水平显著偏离不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中的平均值时，将受试者诊断为在由AD引起的MCI发作之后的一定年数。可替代地或另外地，使用在T181、T205和/或T217处的tau磷酸化的测量，任选地使用总tau的测量，可使用由所测量的磷酸化水平计算的比率或由所测量的磷酸化水平和总tau计算的比率。由测量的磷酸化水平计算的比率可以是p-T181与p-T205之间、p-T217与p-T205之间或p-T181与p-T217之间的比率。由测量的磷酸化水平和总tau计算的比率可以是p-T181与总tau之间、p-T205与总tau之间或p-T217与总tau之间的比率。也可以使用除比率之外的数学运算。
在另一方面，本公开涵盖一种用于治疗有需要的受试者的方法。所述方法包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并在所述分离的tau样品中测量在选自T181、T205和T217的一个或多个氨基酸残基处的tau磷酸化，并且任选地测量总tau；以及(b)当如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的，所测得的磷酸化水平显著偏离不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中的平均值时，向受试者施用药物组合物。可替代地或另外地，使用在T181、T205和/或T217处的tau磷酸化的测量，任选地使用总tau的测量，可使用由所测量的磷酸化水平计算的比率或由所测量的磷酸化水平和总tau计算的比率。由测量的磷酸化水平计算的比率可以是p-T181与p-T205之间、p-T217与p-T205之间或p-T181与p-T217之间的比率。由测量的磷酸化水平和总tau计算的比率可以是p-T181与总tau之间、p-T205与总tau之间或p-T217与总tau之间的比率。也可以使用除比率之外的数学运算。
在另一方面，本公开涵盖一种用于将受试者纳入临床试验的方法。所述方法包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并在所述分离的tau样品中测量在选自T181、T205和T217的一个或多个氨基酸残基处的tau磷酸化，并且任选地测量总tau；以及(b)当如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的，所测得的磷酸化水平显著偏离不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中的平均值时，将所述受试者纳入临床试验。可替代地或另外地，使用在T181、T205和/或T217处的tau磷酸化的测量，任选地使用总tau的测量，可使用由所测量的磷酸化水平计算的比率或由所测量的磷酸化水平和总tau计算的比率。由测量的磷酸化水平计算的比率可以是p-T181与p-T205之间、p-T217与p-T205之间或p-T181与p-T217之间的比率。由测量的磷酸化水平和总tau计算的比率可以是p-T181与总tau之间、p-T205与总tau之间或p-T217与总tau之间的比率。也可以使用除比率之外的数学运算。
下文更详细地描述本发明的其他方面和迭代。
附图说明
本申请文件含有至少一张以彩色制作的照片。这个专利申请公布的具有彩色照片的副本将在函索并支付必要费用后由办事处提供。
图1是最长人tau同种型(2N4R)和tau抗体表位的示意图。鉴定此同种型的N末端、中间结构域、MTBR和C末端，并且其他tau同种型(例如2N3R、1NR4、1N3R、0N4R和0N3R)将以可预测的方式变化。
图2是示出平行反应监测实验原理的示意图。
图3示出来自对103-126(0N同种型)的单磷酸化tau序列进行的PRM筛选的数据。鉴定与未修饰的肽103-126紧密洗脱并含有预期在T111(a)、S113(b)或T123(c)处磷酸化的片段系列的独特LC-MS/MS模式。来自每个p-tau肽的假定y离子片段在序列上标加下划线。对三种假定的单磷酸化肽的潜在共洗脱进行去卷积。不具有磷酸酯的离子片段y15对残基T111上的磷酸化肽(y15(a))具有特异性，并且具有磷酸酯的y8片段对残基T123上的p-tau肽(y8(c))具有特异性。在以高于检测限的低丰度检测对应的提取的离子色谱图(XIC)，支持了两种对应的单磷酸化tau肽的鉴定。相反，pT111和pS113共享的具有磷酸酯的y15片段(y15(a+b))以及pS113和pT123共享的不具有磷酸酯的y8片段(y8(b+c))更丰富。这些信号差异支持在残基S113(b)处单磷酸化的tau肽作为所述模式的主要种类存在。
图4示出来自含有六个潜在磷酸化位点的单磷酸化tau序列68-126(1N同种型)的PRM筛选的数据。如图3(d-f)所述，含有残基103-126的肽共享三个磷酸化位点。确定了六种LC-MS模式。在两个LC-MS模式4和5中发现由pS68(a)或pT69(b)共享的携带磷酸酯的Y28片段。这表明存在两种磷酸化肽，但是在没有检测到离子片段y29的情况下不能严格分配对应的LC-MS模式来区分pS68和pT69。在LC-MS模式6和1中分别发现对应于pT71(c)和pT111(d)的特异性片段。在LC-MS模式2中发现pS113(e)和pT123(f)的特异性片段(具有磷酸酯的y15)。此模式包含具有和不具有磷酸酯的y10片段，这表明这两种磷酸化肽的共洗脱。由于不具有磷酸酯的y10与具有磷酸酯的y10相比具有主要信号，因此pT123的程度可能低于pS113。LC-MS模式3归因于来自模式4的磷酸化肽的次要构象异构体或LC假象，如对于非磷酸化肽所发现的。
图5示出来自单磷酸化tau序列45-67(1N和2N同种型)的PRM筛选的数据。在非磷酸化肽LC-MS模式的前面鉴定到来自构象异构体的强信号。因此，预测磷酸化肽的对应LC-MS模式也具有可被LC分离的构象异构体。实际上，PRM扫描解释导致检测到pT50(b)作为此序列上的主要磷酸化位点(模式2)。具有相似片段指纹的模式1归因于pT50的构象异构体。未检测到能够区分来自pT50(b)的信号的pS46(a)，这表明此磷酸化将不存在或较低，并与共享类似非特异性片段的其他磷酸化肽共洗脱。在LC-MS模式3中共洗脱不具有磷酸酯的y9、y15以及具有磷酸酯的y17，鉴定出残基T52(c)处的磷酸化。模式4/6和5/7分别配对为构象异构体。因此，不能分离两种磷酸化肽。在这些模式中发现的片段与S61(e)、T63(f)和S64(g)残基之一处的磷酸化一致。MS/MS强度不足以鉴定这些位点，但是在此序列上这3个位点中的至少2个可能被磷酸化。另外，在模式7的肩部发现不具有磷酸酯的次要y9片段，这可能归因于残基S56(d)上的次要磷酸化。
图6示出来自单磷酸化tau序列88-126(2N同种型)的PRM筛选的数据。在此序列中定位6个潜在磷酸化位点，并鉴定6个LC-MS模式。在模式1和2中发现的片段分别与残基T111(d)和S113(e)处磷酸化的肽一致。未发现来自在残基T123(f)处磷酸化的肽的特异性片段。模式4和6包含与残基T101(b)或T102(c)上的磷酸化相匹配的y29片段的低信号，但未检测到能够区分它们的特异性片段。模式3和5共享在模式4和6中发现但丰度较低的片段，将磷酸化的残基定位在残基G109的N末端。这可能表明存在可能在残基T95(a)上磷酸化的额外肽或来自模式4和6中发现的肽的丰富构象异构体。
图7示出包含4个潜在磷酸化位点的单磷酸化tau序列68-87的PRM扫描。检测到3种LC-MS模式。模式2和3与残基S68(a)或T69(b)处的磷酸化一致。模式1包含与存在两种共洗脱的在T71(c)和T76(d)处磷酸化的肽相容的两种片段。模式1中具有和不具有磷酸酯的y14XIC的比较表明pT71(c)比pT76(d)更丰富。
图8A、图8B、图8C、图8D、图8E、图8F、图8G、图8H、图8I、图8J、图8K和图8L示出在脑p-tau蛋白的中间结构域和C-末端中的磷酸化位点的检测。
图9A、图9B、图9C、图9D、图89E和图9F显示来自tau序列195-209(SEQ ID NO：38)和212-221(SEQ ID NO：64)的磷酸化肽概况在可溶性脑部分、正常CSF和AD CSF tau蛋白之间是可变的。如所示稀释脑可溶性tau提取物以大致上匹配对应的CSF tau水平。195-209上磷酸化的肽：在脑裂解物中，观察到对应于两个磷酸化肽pS199和pS202的共洗脱的一个信号。在CSF中，观察到两个其他信号。片段分析允许将左侧的信号分配给pT205。在AD CSF中，两个信号增加，允许鉴定特异性片段，将右侧的信号分配给pS208。212-221上磷酸化的肽：在脑裂解物中，鉴定对应于pT217和pS214的两个具有类似MS强度的信号。在CSF中，对应于pT217的信号最强，而pS214接近检测极限，这表明与脑提取物相比，它们的相对丰度发生了巨大变化。在AD CSF中，pT217由于特异性超磷酸化而显著增加。
图10A、图10B、图10C、图10D、图10E、图10F、图10G、图10H和图10I示出在CSF中鉴定的pT153、pT175和pT231磷酸化肽。示出pT175和pT231的AQUA内部标准物信号。pT153的片段化模式与未修饰的相似。
图11显示，在CSF中相对于S113磷酸化，T111上的磷酸化丰度高于脑。在脑和CSF中，检测到tau序列103-126上所有单磷酸化肽共有的MS/MS片段y18。与脑提取物相比，CSF中来自pS113(b)的y15片段的相对丰度显著更低。相反，来自pT111(a)的y15片段在CSF中是丰富的，并且在稀释到与AD-CSF tau水平匹配的脑可溶性提取物中检测不到。
图12显示tau磷酸化的相对丰度取决于生物提取物并且在整个蛋白质序列上变化。在正常脑裂解液、正常CSF和使用HJ8.5和Tau1通过免疫捕获提取的AD CSF中通过MS测量的tau磷酸化丰度的比较。圆形面积与位点磷酸化丰度成比例。红色和绿色分别表示与作为参考获得的脑可溶物概况(蓝色)相比的增加或减少。Tau在CSF中被c末端截短，这解释了没有检测到磷酸化位点的C末端簇。T205和S208上的磷酸化对于CSF是特异性的(脑可溶物上的红色X–顶部)。
图13显示在脑、正常CSF和AD CSF中tau磷酸化位点被不同地修饰。测量值是与对应非磷酸化位点(HJ8.5+Tau1IP-MS)相比磷酸化信号的相对丰度。从500倍至8000倍因子稀释以匹配CSF tau水平的裂解液获得脑结果。在脑组织中无法检测到T205和S208上的磷酸化。在500倍稀释的裂解液中无法检测到T111上的磷酸化，但在对应丰度为0.02％的10倍稀释的裂解液中检测到磷酸化。图例：**表示在p＝0.01水平上的显著性，并且*表示在p＝0.05水平上的显著性。
图14A、图14B、图14C和图14D示出抗体对通过IP-MS测量的磷酸化比率的影响。将脑裂解液池、非AD(n＝1)和AD CSF(n＝1)池与针对tau N末端投射结构域(Tau13或HJ8.5)或中间结构域(HJ8.7、Tau1或Tau5)的抗体并行免疫沉淀。在脑裂解液(图14A，左图)、非ADCSF(图14A，中图)和AD CSF(图14A，右图)中示出在主要CSF位点(log
图15显示CSF孵育不影响tau的磷酸化比率测量值。
图16A、图16B、图16C、图16D、图16E、图16F和图16G显示淀粉样蛋白斑块与tau超磷酸化高度相关，但是在磷酸化位点方面不同。图16A基于AβPiB-PET(SUVR截止值为1.25)将参与者分类为具有Aβ病理的总tau(蓝线，AUC＝0.62)和位点特异性磷酸化比率的接收器操作特征，p-T217(黄线)表明与Aβ病理(AUC＝0.97)几乎完全相关联，随后是p-T181(AUC＝0.89)和p-T205(AUC＝0.74)。示出通过突变携带者的AβPiB-PET四分位数(n＝45、47、28、30)获得的p-T217(图16B)、p-T181(图16C)、p-S202(图16D)、p-T205(图16E)和总tau(图16F)水平的归一化(z评分)磷酸化比率，突显了随着AβPiB-PET水平增加的磷酸化的位点特异性差异：p-T217和p-T181随着AβPiB-PET量的初始增加而最大增加，并随着AβPiB-PET的最高水平而缓慢，而p-T205和总tau表明持续增加。对于p-S202，最高AβPiB-PET四分位数的磷酸化相对于最低值显著降低；基于Wilcoxon两样品测试，***-p值<0.001，**-p值<0.01；中线表示中值，上下缺口＝中值+/-1.58*四分位间距/平方根(n观测值)，上下须＝大于/小于或等于上/下铰合部+1.58*IQR的最大观测值。图16G皮质和皮质下AβPiB-PET SUVR与无症状突变携带者(n＝139)的位点特异性磷酸化之间的双变量相关性。颜色表示正相关(黄色-红色)和负相关(蓝色)的相关性；所有相关性均表示幸免于假发现率(p<0.05)的统计学显著性值，并按照从上到下的相关性强度排列。
图17A、图17B、图17C、图17D、图17E和图17F显示不同磷酸化tau位点的纵向变化是疾病特异性的阶段，并且随着AD进展在相反方向上变化。在估计的症状发作的数年(EYO)内突变携带者(黑色＝无症状突变携带者(n＝152)，红色＝症状性突变携带者(77))和非携带者(蓝色，(n＝141))的(图17A)p-T217、(图17B)p-T181、(图17C)总tau、(图17D)p-T205和(图17E)p-S202的磷酸化比率的各个z-转化的纵向变化。垂直虚线是预期症状发作点，绿线表示突变携带者与非携带者相比每种p-tau同种型的变化速率变得更大时的模型估计时间。(图17F)每个磷酸化位点的模型估计的纵向变化速率，其中归一化为非携带者的速率，并与淀粉样蛋白PET(红色)和认知衰退(黄色)一起在EYO上作图；实心圆表示突变携带者与非携带者相比每个变量的变化速率首先变得不同的点。这突显了p-tau同种型在AD谱过程中的变化模式，以及淀粉样蛋白斑块生长与斑块在-21 EYO处开始增加的p-T217的增加和p-T217的在-21 EYO处开始的超磷酸化(黑色)以及这两个位点的磷酸化比率下降和认知下降(黄色线)之间的紧密关联性。相比之下，p-T205(紫色)在整个疾病进展过程中持续增加，并且总tau水平(灰色)在临近症状发作时间以增加的速率增加。
图18A和图18B显示磷酸化的tau位点与脑代谢减退和萎缩有不同的关系。图18A。无症状突变携带者(n＝152)的皮质和皮质下萎缩与位点特异性磷酸化比率之间的双变量相关性表明p-T205和p-T217的磷酸化增加，与p-T181的关联较小。总tau水平与多个皮质和皮质下区域中的更大萎缩相关联。图18B。在无症状突变携带者(n＝143)中通过FDG-PET测量的皮质和皮质下脑代谢与位点特异性磷酸化比率之间的双变量相关性表明，p-T205的磷酸化增加与大多数皮质和皮质下区域的减少相关联，但对于其他p-tau位点或tau并非如此。
图19A、图19B、图19C和图19D显示p-T217、p-T181和p-T205的磷酸化减少与痴呆和认知下降相关联。突变携带者的p-tau同种型和总tau(y轴)的个体估计的年变化速率与总体认知功能的年变化相关；线表示简单的线性回归，其中阴影区域表示95％置信区间。每个点表示测量之间的单个水平相关性。线性回归与不患有痴呆(黑色，n＝47)和患有痴呆(红色，n＝25)的那些拟合。p-T217(图19A，r＝0.43(p＝0.02))、p-T181(图19B，r＝0.72(p<.001))和p-T205(图19C，r＝0.41(p＝0.03))磷酸化率的下降与症状发作后的认知下降(红色)相关联。对于总tau，存在表明与认知成反比的趋势(图19D)，但是并不显著。
图20示出在DIAD突变携带者中tauPET临近症状发作时的增加。突变携带者(红色，n＝12)和非携带者(蓝色，n＝9)的平均皮质归一化单位值比率(SUVR，y轴)，相对于在tau-PET时间之前进行纵向CSF评估的那些参与者的在估计的症状发作的数年(EYO，x轴)。所述图表显示对于突变携带者，直到估计的症状发作点(EYO＝0)之前，tau-PET几乎没有升高。此图示出，通过AV-1451检测到的神经原纤维缠结(NFT)病理发生的时间比多个可溶性磷酸化tau位点的增加晚得多，这表明tau的这些可溶性标记物很可能是NFT病理的标记物，但是可能倾向于发展AD病理特征性的过度磷酸化的不溶性tau沉积物。
图21A、图21B、图21C、图21D和图21E显示在显性遗传的AD中，tau和tau磷酸化位点的纵向变化与神经原纤维tau(tau-PET)有不同的关系。在tau-PET扫描时间(x轴)之前的磷酸化和总tau的单个估计变化率(y轴)。垂直线是1.22的SUVR，并表示当NFT tau-PET(多个皮质和边缘区域的复合物)与非携带者相比被认为升高时的保守估计点。这些图表表明可溶性tau和p-T205的增加与聚集tau的较高水平相关联，而p-T217和p-T181的磷酸化比率随聚集tau水平增加而降低。这些发现表明，增加的不同位点的tau和磷酸化水平之间存在差异，并且可能表明，在某些情况下，可溶性p-tau被隔离，因为过度磷酸化聚集体的负荷随着tau病理的扩散而增加。它们还表明，随着聚集tau的增加，可溶性tau水平升高，这可能表示聚集tau病理负担更大的被动释放或主动释放。
图22是示出tau病理在阿尔茨海默氏病中通过不同阶段演变的图示。在具有确定性阿尔茨海默氏病突变的一组参与者中测量了四种不同的可溶性tau种类和不溶性tau，显示了在35年过程中(x轴)tau相关变化展开(y轴)，并且基于疾病的阶段和其他可测量生物标志物是不同的。A.从发展纤维状淀粉样蛋白病理开始，位置217(紫色)和181(蓝色)处的磷酸化开始增加。B.随着神经元功能障碍(基于代谢变化)的增加，位置205(绿色)处的磷酸化与可溶性tau(橙色)一起开始增加。C.最后，随着神经变性的发作(基于脑萎缩和认知下降)，tauPET缠结(红色)开始发展，而217和181的磷酸化开始减少。总之，这突显了在疾病过程中可溶性和聚集tau的动态和分散模式，以及与淀粉样蛋白病理的密切关系。
图23A、图23B和图23C示出了CSF中的磷酸化tau同种型的定量。来自CSF中tau磷酸化肽和对应未修饰肽的平行反应监测(PRM)分析的提取离子色谱图的总和。图23A，使用microLC系统监测T181。图23B，使用nanoLC系统监测S199、S202、T205(以成帧信号共洗脱)和T217。内源信号(蓝色实线)、15N标记的肽(红色虚线)、AQUA肽(绿色虚线)。图23C示出了根据用于肽片段化的Biemann命名法的特异性PRM转变，其允许鉴定三种携带pS199、pS202或pT205的共洗脱的单磷酸化肽。Cps＝每秒计数。
图24A、图24B、图24C、图24D和图24E显示在T217上的CSF tau磷酸化与淀粉样变性状态相关联。图24A：与不具有或仅具有轻度认知下降的淀粉样蛋白阴性对照相比，患有淀粉样变性(PiB-PET和CSF Aβ42/40比率阳性)的参与者中T217磷酸化显著增加。图24B：使用通过MS得到的T217、T181和通过ELISA得到的T181的磷酸化比率，来自淀粉样蛋白阴性参与者的淀粉样蛋白阳性诊断的ROC曲线。图24C：pT217/T217比率比较表明，淀粉样变性参与者中T217的特异性磷酸化。图24D-24E：具有通过MS测量的CSF Aβ42/40变化的T217磷酸化与通过PiB-PET测量的淀粉样蛋白斑沉积的比较。图24D：T217过度磷酸化的程度与CSF Aβ42相对于Aβ40的减少不相关。五个冲突病例(橙色三角形，对于PiB-PET和T217过度磷酸化呈阳性，但对于CSF Aβ呈阴性)全部都略高于被选择来定义淀粉样蛋白状态的0.12阈值，这表明它们可能由CSF淀粉样蛋白测定灵敏度不足引起。图24E：在淀粉样蛋白阳性参与者中，PiB-PET负荷(FBP总皮质平均值)与T217磷酸化状态相关。通过PiB区分淀粉样蛋白阳性与淀粉样蛋白阴性的截止值为0.18。
图25显示T217上的CSF tau磷酸化与认知状态无关，并且在临床前AD中被显著修饰。左图：T217磷酸化与通过临床痴呆评分总和(CDR-SB)测量的认知概况之间不存在相关性。右图：在不具有认知下降(CDR-SB＝0)的参与者中，T217在淀粉样蛋白阳性组中已经显著被过度磷酸化。
具体实施方式
在中枢神经系统中Tau蛋白聚集成神经原纤维缠结有助于某些神经退行性疾病的病因，包括阿尔茨海默氏病(AD)。尽管尚未完全了解tau去稳定的机制，但已发现tau蛋白在tau聚集体中过度磷酸化。申请人已经发现，对特定氨基酸残基处的tau磷酸化进行定量的某些方法可用于贯穿其临床前无症状阶段至症状阶段追踪AD过程。图22示出通过申请人的方法建立的在T181、T205和T217处可测量的tau磷酸化的动态模式与距由AD引起的MCI发作的数年以及某些病理生理学变化的发展有关。本公开涵盖对特定氨基酸残基处的tau磷酸化进行定量的所述方法预测由阿尔茨海默氏病引起的轻度认知损害的发作时间、指导治疗决策、选择临床试验的受试者以及评估某些治疗性干预措施的临床功效的用途。下文更详细地描述本发明的其他方面和迭代。
I.定义
为了使本发明更容易理解，首先定义了某些术语。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明的实施方案所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。与本文所述的那些方法和材料类似、改进或等同的许多方法和材料可用于实施本发明的实施方案而无需过多的实验，本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明的实施方案时，将根据以下阐述的定义使用以下术语。
如本文所用，术语“约”是指例如可通过典型的测量技术和设备发生的关于任何可定量变量(包括但不限于质量、体积、时间、距离和量)的数值的变化。此外，给定在现实世界中使用的固体和液体处理程序时，存在某些无意的误差和变化，这可能是由于用于制造组合物或实施方法等的成分的制造、来源或纯度的差异。术语“约”还涵盖这些变化，其可以高达±5％，但也可以为±4％、3％、2％、1％等。无论是否被术语“约”修饰，权利要求包括这些量的等效值。
如本文所用，抗体可以是本领域所理解的完整抗体，即由两条重链和两条轻链组成，或者可以是具有抗原结合区的任何抗体样分子，并且包括但不限于抗体片段诸如Fab'、Fab、F(ab')2、单结构域抗体、Fv和单链Fv。术语抗体还是指多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。用于制备并使用各种基于抗体的构建体和片段的技术是本领域熟知的。用于制备和表征抗体的方法也是本领域熟知的(参见例如Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988；其以引用的方式整体并入本文)。
如本文所用，术语“适体”是指在生物化学活性、分子识别或结合属性方面具有有用的生物活性的多核苷酸，通常是RNA或DNA。通常，适体具有分子活性，例如与特异性表位(区域)上的靶分子结合。通常认为，可以通过体外进化方法合成和/或鉴定在其与多肽的结合中具有特异性的适体。用于制备并表征适体的方法(包括通过体外进化方法)是本领域熟知的。参见例如US7,939,313，其以引用的方式整体并入本文。
术语“Aβ”是指衍生自称为淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的较大蛋白的羧基末端区域的肽。编码APP的基因位于21号染色体上。存在可能具有毒性作用的许多形式的Aβ：Aβ肽通常长37-43个氨基酸序列，尽管它们可具有截短和修饰，从而改变它们的整体大小。它们可以在细胞内或细胞外在可溶性和不溶性区室中以单体、寡聚和聚集形式发现，并且可以与其他蛋白质或分子复合。Aβ的不利或毒性作用可归因于任何或所有上述形式，以及未具体描述的其他形式。例如，两种此类Aβ同种型包括Aβ40和Aβ42；其中Aβ42同种型特别具有原纤维形成性或不溶性，并且与疾病状态相关联。术语“Aβ”通常是指多个Aβ种类，没有对单个Aβ种类进行区分。通过肽的大小来鉴定特定的Aβ种类，例如Aβ42、Aβ40、Aβ38等。
如本文所用，术语“Aβ42/Aβ40值”意指从受试者获得的样品中Aβ42的浓度与同一样品中Aβ40的浓度相比的比率。
“Aβ淀粉样变性”在临床上被定义为在脑中Aβ沉积的证据。临床上确定为患有Aβ淀粉样变性的受试者在本文中称为“淀粉样蛋白阳性”，而临床上确定为不患有Aβ淀粉样变性的受试者在本文中称为“淀粉样蛋白阴性”。Aβ淀粉样变性可能在当前技术可检测到之前就已经存在。尽管如此，本领域中存在公认的Aβ淀粉样变性的指标。在本公开之时，Aβ淀粉样变性通常通过淀粉样蛋白成像(例如，PiB PET、阿尔茨海默病诊断药物(fluorbetapir)或本领域已知的其他成像方法)或通过降低的脑脊液(CSF)Aβ42或降低的CSF Aβ42/40比率来鉴定。平均皮质结合电位(MCBP)评分>0.18的[
“Aβ淀粉样变性的临床体征”是指本领域已知的Aβ沉积的量度。Aβ淀粉样变性的临床体征可包括但不限于通过淀粉样蛋白成像(例如，PiBPET、阿尔茨海默病诊断药物或本领域已知的其他成像方法)或通过降低的脑脊液(CSF)Aβ42或Aβ42/40比率来鉴定的Aβ沉积。参见例如Klunk WE等人Ann Neurol55(3)2004以及Fagan AM等人Ann Neurol 59(3)2006，其各自均以引用的方式整体并入文中。Aβ淀粉样变性的临床体征还可包括Aβ代谢的测量，特别是单独的Aβ42代谢的测量或与其他Aβ变体(例如Aβ37、Aβ38、Aβ39、Aβ40和/或总Aβ)代谢的测量相比，如美国专利序列号14/366,831、14/523,148和14/747,453中所述，其各自均以引用的方式整体并入文中。额外方法描述于Albert等人Alzheimer’s&Dementia 2007第7卷,第170-179页；McKhann等人,Alzheimer’s&Dementia 2007第7卷,第263-269页；以及Sperling等人Alzheimer’s&Dementia 2007第7卷,第280-292页中，其各自均以引用的方式整体并入文中。重要的是，具有Aβ淀粉样变性临床体征的受试者可能具有或不具有与Aβ沉积相关联的症状。然而，具有Aβ淀粉样变性临床体征的受试者发展与Aβ淀粉样变性相关的疾病的风险增加。
“淀粉样蛋白成像的候选者”是指已经被临床医生鉴定为可以在临床上保证进行淀粉样蛋白成像的个体的受试者。作为非限制性实例，用于淀粉样蛋白成像的候选者可以是具有一种或多种Aβ淀粉样变性临床体征、一种或多种Aβ斑块相关症状、一种或多种CAA相关症状或其组合的受试者。临床医生可能会建议对此受试者进行淀粉样蛋白成像，以指导他或她的临床护理。作为另一个非限制性实例，用于淀粉样蛋白成像的候选者可以是与Aβ淀粉样变性相关的疾病的临床试验中的潜在参与者(对照受试者或测试受试者)。
“Aβ斑块相关症状”或“CAA相关症状”是指分别由淀粉样蛋白斑块或CAA的形成引起或与其相关的任何症状，所述淀粉样蛋白斑块或CAA由称为淀粉样蛋白原纤维的规则有序的原纤维状聚集体组成。示例性Aβ斑块相关症状可能包括但不限于神经元变性、认知功能受损、记忆受损、行为改变、情绪失调、癫痫发作、神经系统结构或功能受损以及阿尔茨海默氏病或CAA发展或恶化的风险增加。神经元变性可能包括神经元结构的变化(包括分子变化，例如毒性蛋白、蛋白聚集体等的细胞内积累，以及宏观水平的变化，例如轴突或树突的形状或长度的变化、髓鞘组成的变化、髓鞘的丧失等)、神经元功能的变化、神经元功能的丧失、神经元死亡或其任何组合。认知功能受损可能包括但不限于记忆、注意力、集中力、语言、抽象思维、创造力、执行功能、计划和组织方面的困难。行为改变可包括但不限于身体或言语攻击、冲动、抑制减少、冷漠、引发减少、人格改变、酗酒、吸烟或吸毒以及其他成瘾相关行为。情绪失调可包括但不限于抑郁、焦虑、躁狂、易怒和情绪失禁。癫痫发作可包括但不限于全身性强直-阵挛性癫痫发作、复杂部分性癫痫发作和非癫痫性心理性癫痫发作。神经系统结构或功能受损可包括但不限于脑积水、帕金森病、睡眠障碍、精神病、平衡和协调受损。这可包括运动受损，例如单瘫、偏瘫、四肢瘫痪、共济失调、颤搐和震颤。这也可包括感觉丧失或功能障碍，包括嗅觉、触觉、味觉、视觉和听觉。此外，这可包括自主神经系统受损，例如肠和膀胱功能障碍、性功能障碍、血压和体温失调。最后，这可包括可由下丘脑和垂体腺功能障碍引起的激素受损，例如生长激素、促甲状腺激素、促黄体激素、促卵泡激素、促性腺激素释放激素、催乳素以及许多其他激素和调节剂的缺乏和失调。
如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，优选地是人。哺乳动物包括但不限于人、灵长类动物、家畜、啮齿动物和宠物。受试者可能正在等待医疗护理或治疗，可能正在接受医疗护理或治疗，或者可能已经接受了医疗护理或治疗。
如本文所用，术语“健康对照组”、“正常组”或来自“健康”受试者的样品意指由医生基于定性或定量测试结果诊断为未患有Aβ淀粉样变性或与Aβ淀粉样变性相关的临床疾病(包括但不限于阿尔茨海默氏病)的受试者或受试者组。“正常”受试者的年龄通常与待评估个体大致相同，包括但不限于相同年龄的受试者和5至10岁范围内的受试者。
如本文所用，术语“血液样品”是指源自血液，优选外周(或循环)血液的生物样品。血液样品可以是全血、血浆或血清，尽管血浆通常是优选的。
如本文所用，术语“同种型”是指相同蛋白变体的几种不同形式中的任一种，其由于编码蛋白质的mRNA的选择性剪接、蛋白质的翻译后修饰、蛋白质的蛋白水解加工、遗传变异和体细胞重组而产生。术语“同种型”和“变体”可互换使用。
除非本文另有说明，否则术语“tau蛋白”或“tau”涵盖所有tau同种型，无论是全长的、截短的或翻译后修饰的。在许多动物(包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物、鱼、牛、青蛙、山羊和鸡)中，tau由基因MAPT编码。在人中，存在由MAPT的外显子2、3和10的选择性剪接而产生的六种tau同种型。这些同种型的长度范围为352至441个氨基酸。外显子2和3在N末端分别编码29个氨基酸的插入物(称为N)，并且全长人tau同种型可具有两个插入物(2N)、1个插入物(1N)或没有插入物。所有全长人tau同种型也都具有三个微管结合结构域(称为R)重复序列。在C末端包含外显子10导致包含由外显子10编码的第四微管结合结构域。因此，全长人tau同种型可包含四个微管结合结构域重复序列(包含外显子10)或三个微管结合结构域重复序列(不包含外显子10)。人tau可能会或不会进行翻译后修改。例如，在本领域中已知，tau可能被磷酸化、泛素化、糖基化和糖化。因此，术语“人tau”涵盖(2N,3R)、(2N,4R)、(1N,3R)、(1N,4R)、(0N,3R)和(0N,4R)同种型、其N末和/或C末端截短种类的同种型以及所有翻译后修饰的同种型。编码tau的基因的选择性剪接类似地在其他动物中发生。在基因未鉴定为MAPT的动物中，可以通过本领域熟知的方法鉴定同源物。
与脑中的tau沉积相关联的疾病可以被称为“tau蛋白病”。本领域已知的tau蛋白病包括但不限于进行性核上性麻痹、拳击员痴呆、慢性创伤性脑病、连锁于17号染色体伴帕金森氏病的额颞痴呆、Lytico-Bodig病、关岛帕金森-痴呆综合征、缠结性痴呆、神经节神经胶质瘤和神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅毒性脑病、结节性硬化症、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、脂褐质沉积症、皮克氏病、皮质基底节变性、嗜银粒性痴呆(AGD)、额颞叶变性、阿尔茨海默氏病和额颞叶痴呆。
“显著偏离平均值”是指高于或低于平均值至少1个标准偏差，优选地至少1.3个标准偏差，更优选地至少1.5个标准偏差或甚至更优选地至少2个标准偏差的值。
短语“Aβ和tau疗法”总体上是指预期用于或用于处于发展Aβ淀粉样变性或AD的风险下的受试者、被诊断为患有Aβ淀粉样变性的受试者、被诊断为患有tau蛋白病的受试者或被诊断为患有AD的受试者的的任何成像剂或治疗剂。
II.测量分离的tau样品中的总tau和tau磷酸化
本公开的方法包括提供从受试者获得的分离的tau样品并测量在一个或多个氨基酸残基处的tau磷酸化和任选地总tau。
(a)分离的tau样品
如本文所用，分离的tau样品是指包含tau的组合物，其中tau已从自受试者获得的血液或脑脊液(CSF)中纯化。受试者是哺乳动物，优选地是人。可以通过在利用或不利用留置的CSF导管的情况下进行腰椎穿刺来获得CSF。可以合并同时从受试者采集的多个血液或CSF样品。可以通过在利用或不利用静脉导管的情况下进行静脉穿刺或通过手指针刺(或其等效方法)来采集血液。一旦采集，就可以根据本领域已知的方法(例如，离心以去除全细胞和细胞碎片、使用设计为在分析测试之前稳定并保存样品的添加剂等)来处理血液或CSF样品。血液或CSF样品可以立即使用或可以冷冻并无限期保存。
在本公开的分离的tau样品中，tau已经从血液或CSF中部分或完全纯化。用于从血液或CSF中纯化tau的方法是本领域已知的，并且包括但不限于选择性沉淀、尺寸排阻色谱、离子交换色谱以及亲和纯化。合适的方法从血液或CSF中浓缩磷酸化tau和未磷酸化tau。
在示例性实施方案中，本公开的分离的tau样品包含已经通过亲和纯化从血液或CSF中纯化的tau。亲和纯化是指通过目标蛋白与固定化配体的特异性结合特性来纯化所述目标蛋白的方法。通常，固定化配体是附接至固体支持物(例如珠、树脂、组织培养板等)的配体。合适的配体特异性结合磷酸化和未磷酸化tau。在一个实例中，合适的配体可以结合tau的中间结构域内的表位。在另一个实例中，合适的配体可以结合tau的N-末端内的表位，优选地tau的氨基酸1至35内的表位。在另一个实例中，合适的配体可以结合tau的MTBR内的表位。在另一个实例中，合适的配体可以结合tau的C-末端内的表位。在其他实施方案中，tau可以使用两种或更多种固定化配体从血液或CSF中亲和纯化。在一个实例中，固定化配体结合tau的N-末端内的表位，并且另一种固定化配体结合tau的中间结构域内的表位。在另一个实例中，固定化配体结合tau的MTBR内的表位，并且另一种固定化配体结合tau的中间结构域内的表位。在另一个实例中，固定化配体结合tau的C末端内的表位，并且另一种固定化配体结合tau的中间结构域内的表位。在另一个实例中，固定化配体结合tau的C末端内的表位，并且另一种固定化配体结合tau的N末端内的表位。在另一个实例中，固定化配体结合tau的MTBR内的表位，而另一种固定化配体结合tau的N-末端内的表位。在另一个实例中，固定化配体结合tau的MTBR内的表位，而另一种固定化配体结合tau的C末端内的表位。在每个以上实施方案中，配体可以是抗体或适体。合适抗体的非限制性实例示出在图1中。
分离的tau样品可以立即使用，或者可以通过本领域已知的方法无限期地保存。
(b)在一个或多个氨基酸残基处的tau磷酸化
tau中特定氨基酸(即“位点”)的磷酸化产生磷酸化tau(p-tau)同种型。本公开的方法提供了测量tau的一个或多个特定氨基酸处的磷酸化的化学计量的手段。在一些实施方案中，本文的方法包括测量在选自T111、S113、T181、S199、S202、S208、T153、T175、T205、S214、T217和T231的一个或多个残基处的tau磷酸化。在一些实施方案中，本文的方法包括测量在选自T111、T181、T205、S208、S214、T217和T231的一个或多个残基处的tau磷酸化。在其他实施方案中，本文的方法包括测量在选自T181、S214和T217的一个或多个残基处的tau磷酸化。在其他实施方案中，本文的方法包括测量在选自T181、T205和T217的一个或多个残基处的tau磷酸化。在其他实施方案中，本文的方法包括测量在包含S199的一个或多个残基处的tau磷酸化。在其他实施方案中，本文的方法包括测量在包含S202的一个或多个残基处的tau磷酸化。在其他实施方案中，本文的方法包括测量在包含S199的一个或多个残基处的tau磷酸化。在其他实施方案中，本文的方法包括测量在包含T181的一个或多个残基处的tau磷酸化。在其他实施方案中，本文的方法包括测量在包含T205的一个或多个残基处的tau磷酸化。在其他实施方案中，本文的方法包括测量在包含T217的一个或多个残基处的tau磷酸化。在其他实施方案中，本文的方法包括测量在包含T153和T175的两个或多个残基处的tau磷酸化。在其他实施方案中，本文的方法包括测量在选自T181、T205和T217的两个或多个残基处的tau磷酸化。在其他实施方案中，本文的方法包括测量在包含T181、T205和T217的三个或多个残基处的tau磷酸化。
申请人开发了一种使用平行反应监测(PRM)的高灵敏度和特异性的质谱(MS)方法，以发现tau磷酸化位点并初步定量分离的tau蛋白中磷酸化位点的丰度。然而，本公开不限于定量评定tau的位点特异性磷酸化的任一种特定方法。合适的方法应区分仅在单个氨基酸的磷酸化状态上不同的tau同种型，区分在不同氨基酸处磷酸化的p-tau同种型，并独立于总tau的整体变化定量在特异性位点处发生的磷酸化变化。在以下实例中详细描述了三种方法，它们独立于总tau的整体变化对在特异性位点处发生的磷酸化化学计量变化进行定量：1)磷酸化肽异构体之间的相对比较，其可用于估计共享相同序列的每个磷酸化肽的相对丰度；2)使用来自tau蛋白的任何肽作为参考对磷酸化肽进行归一化；以及3)使用内部合成标记标准品对每个磷酸化肽和非磷酸化肽进行绝对定量，其中每个磷酸化肽的绝对定量值均使用从tau蛋白的任何肽获得的任何绝对定量值进行归一化。所有这三种方法都使用内部归一化来比较每个位点的相对磷酸化变化。也可以使用本领域已知的其他方法。
在一个示例性实施方案中，通过高分辨率质谱法测量tau的位点特异性磷酸化。合适类型的质谱仪是本领域已知的。这些包括但不限于四极、飞行时间、离子阱和轨道阱(Orbitrap)，以及将不同类型的质量分析仪组合为一种架构的混合质谱仪(例如，ThermoFisher Scientific的Orbitrap Fusion
(c)总tau
如本文所用，“总tau”是指给定样品中的所有tau同种型。tau可以在细胞内和细胞外在可溶性和不溶性区室中以单体和聚集形式、以有序或无序结构发现，并且可以与其他蛋白质或分子复合。因此，生物样品的来源(例如脑组织、CSF、血液等)和生物样品的任何下游加工将影响给定样品中tau同种型的总数。
总tau可以通过监测未修饰tau肽的丰度来测量。对于每个磷酸化tau位点，可以优先使用与目标磷酸化肽共享共同氨基酸序列的tau肽来测量总tau水平，但是可以使用来自tau序列的任何肽。tau肽的测量可以通过质谱法进行，并且可以通过使用标记的内部标准物作为参考来提高测量的准确性。可替代地，总tau可以通过免疫测定或定量tau浓度的其他方法来测量。
III.在由AD引起的MCI发作之前诊断受试者以诊断受试者的AD阶段的方法
本公开的一个方面涵盖了将受试者诊断为具有由于阿尔茨海默氏病而转化为轻度认知损害的高风险的方法，以及任选地根据由AD引起的MCI发作的年数来对受试者进行分期或分类。由阿尔茨海默氏病(AD)引起的轻度认知受损(MCI)是指AD的症状性痴呆前期。这种认知受损程度对于年龄来说是不正常的，并且因此例如年龄相关性记忆受损和年龄相关性认知下降的构造不适用。由AD引起的MCI是临床诊断，并且诊断由AD引起的MCI的临床标准是本领域已知的。参见例如Albert等人Alzheimer’s&Dementia,2011,7(3):270-279。认知测试对于客观地评定受试者的认知受损程度是最佳的。患有MCI的受试者在认知测试时的评分通常比在文化上适当的规范数据上(即当可获得时针对一个或多个受损结构域的数据)年龄和教育匹配同龄人的平均值低1至1.5个标准偏差。MCI的指定通常受到临床痴呆等级(CDR)量表上的整体评级0.5的支持。CDR是用于对痴呆症状严重性进行定量的数字量表。其他合适的认知测试是本领域已知的。尽管存在评定认知受损严重性的合适测试，但是本领域需要鉴定由AD引起的MCI发作之前数年具有高置信度的受试者的测试。
在一个实施方案中，将受试者诊断为具有由于AD而转化为MCI的高风险的方法可以包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并在所述分离的tau样品中测量在选自T111、S113、T181、S199、S202、S208、T153、T175、T205、S214、T217和T231的一个或多个氨基酸残基处的tau磷酸化，并且任选地测量总tau；以及(b)当如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的，测量的磷酸化水平显著偏离不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体的平均值时，将受试者诊断为具有由于AD而转化为MCI的高风险。在另一个实施方案中，将受试者诊断为具有由于AD而转化为MCI的高风险的方法可以包括(a)提供从受试者获得的第一和第二分离的tau样品，并在每个分离的tau样品中测量在选自T111、S113、T181、S199、S202、S208、T153、T175、T205、S214、T217和T231的一个或多个氨基酸残基处的tau磷酸化，并且任选地测量总tau；(b)计算在每个测量的残基处的位点特异性磷酸化的变化以及任选地总tau的变化；以及(c)当如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的，计算的变化显著偏离不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体的平均值时，将受试者诊断为具有由于AD而转化为MCI的高风险。“显著偏离平均值”是指高于或低于平均值至少1个标准偏差，优选地至少1.3个标准偏差，更优选地至少1.5个标准偏差或甚至更优选地至少2个标准偏差的值(即，分别为1σ、1.3σ、1.5σ或1.5σ，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的正态分布所定义的标准偏差。除了使用阈值(例如，高于或低于平均值至少1个标准偏差)之外，在一些实施方案中，高于或低于平均值的变化程度可用于诊断受试者。可以从可能无症状或有症状的受试者获得分离的tau样品。“无症状受试者”是指未显示AD的任何体征或症状的受试者。然而，受试者可能表现出AD的体征或症状(例如，记忆丧失、错放东西、情绪或行为的变化等)，但并未表现出用于临床诊断轻度认知受损的足够认知或功能受损。在其他实施方案中，受试者可能携带已知引起显性遗传的阿尔茨海默氏病的基因突变之一。在替代性实施方案中，受试者可能不携带已知引起显性遗传的阿尔茨海默氏病的基因突变。没有特定家庭联系的阿尔茨海默氏病称为偶发性阿尔茨海默氏病。
本公开的另一方面涵盖诊断受试者的阿尔茨海默氏病阶段的方法。在各种实施方案中，“AD的阶段”可以被定义为自由AD引起的MCI发作以来经过的时间量(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月等)。尽管存在用于临床诊断AD的标准，但在临床环境中常见的是，对于给定受试者或对于MCI或AD的疑似诊断，症状发作的时间是未知的。因此，在本领域中需要客观地诊断受试者的AD阶段的测试。
在一个实施方案中，诊断受试者的AD阶段的方法可以包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并在所述分离的tau样品中测量在选自T111、S113、T181、S199、S202、S208、T153、T175、T205、S214、T217和T231的一个或多个氨基酸残基处的tau磷酸化，并且任选地测量总tau；以及(b)当如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的，测量的磷酸化水平显著偏离不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体的平均值时，诊断受试者的AD阶段。在另一个实施方案中，诊断在由AD引起的MCI发作之前的受试者的方法可以包括(a)提供从受试者获得的第一和第二分离的tau样品，并在每个分离的tau样品中测量在选自T111、S113、T181、S199、S202、S208、T153、T175、T205、S214、T217和T231的一个或多个氨基酸残基处的tau磷酸化，并且任选地测量总tau；(b)计算在每个测量的残基处的位点特异性磷酸化的变化以及任选地总tau的变化；以及(c)当如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的，计算的变化显著偏离不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体的平均值时，将受试者诊断为距由AD引起的MCI发作一定年数。“显著偏离平均值”是指高于或低于平均值至少1个标准偏差，优选地至少1.3个标准偏差或更优选地至少1.5个标准偏差或甚至更优选地至少2个标准偏差的值(即，分别为1σ、1.3σ、1.5σ或1.5σ，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的正态分布所定义的标准偏差)。除了使用阈值(例如，高于或低于平均值至少1个标准偏差)之外，在一些实施方案中，高于或低于平均值的变化程度可用于诊断受试者。可以从具有或不具有由AD引起的MCI、痴呆或AD的临床诊断的受试者获得分离的tau样品。在其他实施方案中，受试者可能携带已知引起显性遗传的阿尔茨海默氏病的基因突变之一。在替代性实施方案中，受试者可能不携带已知引起显性遗传的阿尔茨海默氏病的基因突变。
可替代地或除了使用位点特异性tau磷酸化的测量、任选地使用总tau的测量之外，在任何以上实施方案中，可以使用由所测量的磷酸化水平计算的比率或由所测量的磷酸化水平和总tau计算的比率。实例中详述了这两种方法。也可以使用除比率之外的数学运算。例如，实例在各种统计模型(例如线性回归、LME曲线、LOESS曲线等)中使用位点特异性tau磷酸化值，并结合其他已知的生物标志物(例如APOEε4状态、年龄、性别、认知测试评分、功能测试评分等)。可以优化测量的选择和数学运算的选择以使方法的特异性最大化。例如，可以通过ROC曲线下面积来评估诊断准确性，并且在一些实施方案中，将0.7或更大的ROCAUC值设置为阈值(例如0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95等)。
人脑淀粉样蛋白斑块通常通过淀粉样蛋白-正电子发射断层造影术(PET)来测量。例如，皮质Aβ斑块的
如Patterson等人,Annals of Neurology,2015中所描述的，通过CSF中的Aβ42/40测量所测量的不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体可以是指当通过质谱法进行测量时具有<0.12的Aβ42/40测量值的受试者群体。
在一个示例性实施方案中，将受试者诊断为具有由于AD而转化为MCI的高风险或受试者的AD阶段的方法可以包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并在所述分离的tau样品中测量在选自T181、T205和T217的一个或多个氨基酸残基处的tau磷酸化，并且任选地测量总tau；以及(b)当如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的，测量的磷酸化水平显著偏离不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体的平均值时，将受试者诊断为具有由于AD而转化为MCI的高风险，或距由AD引起的MCI发作一定年数，或对受试者的AD进行分期。图22示出在分离的tau样品中在T181、T205和T217处可测量的tau磷酸化关于距由AD引起的MCI发作一定年数的动态模式。显著偏离平均值的在T217处的磷酸化水平首次发生于距由AD引起的MCI发作约21年；显著偏离平均值的在T181处的磷酸化水平首次发生于距由AD引起的MCI发作约19年；显著偏离平均值的总tau的增加首次发生于距由AD引起的MCI发作约17年；并且显著偏离平均值的在T205处的磷酸化水平首次发生于距由AD引起的MCI发作约13年。症状发作(例如由AD引起的MCI)时，T217和T181处的磷酸化水平达到平稳并且然后降低。
如上文所述，可以利用T181、T205和/或T217处的磷酸化的测量来进行额外数学运算，包括但不限于所测得的磷酸化水平之间的比率和所测得的磷酸化水平与总tau之间的比率。由测量的磷酸化水平计算的比率可以是p-T181与p-T205之间、p-T217与p-T205之间或p-T181与p-T217之间的比率。由测量的磷酸化水平和总tau计算的比率可以是p-T181与总tau之间、p-T205与总tau之间或p-T217与总tau之间的比率。
在一个实例中，本公开的方法包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并测量在(i)T217和T205处、(ii)T181和T205处或(iii)T181、T205和T217处的tau磷酸化；以及(b)当T217和/或T181处的tau磷酸化为约1.5σ或更高并且T205处的tau磷酸化为约1.5σ或更低时，将受试者诊断为距由AD引起的MCI发作约10至约25年或约10至约20年，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的在T217和T205处、T181和T205处或T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准偏差。在各种实施方案中，在T217处的tau磷酸化和/或在T181处的tau磷酸化可以为约1.3σ、约1.35σ、约1.4σ、约1.45σ、约1.5σ、约1.6σ、约1.7σ、约1.8σ、约1.9σ、约2σ或高于2σ。在其他实施方案中，在T217处的tau磷酸化和/或在T181处的tau磷酸化可以为约1.85σ、约1.9σ、约1.95σ、约2σ、约2.1σ、约2.2σ、约2.3σ、约2.4σ、约2.5σ或高于2.5σ。在每个以上实施方案中，在T205处的tau磷酸化可以为约1.3σ、约1.35σ、约1.4σ、约1.45σ、约1.5σ、约1.51σ、约1.55σ、约1.6σ、约1.7σ、约1.8σ、约1.9σ、约2.0σ或低于2.0σ。可替代地，在T205处的tau磷酸化可以为约2.0σ、约2.05σ、约2.1σ、约2.2σ、约2.3σ、约2.4σ、约2.5σ或低于2.5σ。在另一个实例中，在T217处的tau磷酸化和/或在T181处的tau磷酸化为约2σ或更高，并且在T205处的tau磷酸化可以为约2σ或更低。除了使用阈值(例如，高于或低于平均值至少1个标准偏差)之外，在一些实施方案中，高于或低于平均值的变化程度可用于诊断受试者。在其他实施方案中，可以在各种数学运算中使用在T205处以及在T181和/或T217处测量的tau磷酸化水平，以与各自相比提高预测能力。例如，可以由所测量的磷酸化水平计算比率。也可以使用除比率之外的数学运算。
在另一个实例中，本公开的方法包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并测量总tau以及在(i)T217和T205处、(ii)T181和T205处或(iii)T181、T205和T217处的tau磷酸化；以及(b)当T217处的tau磷酸化与总tau的比率和/或T181处的tau磷酸化与总tau的比率为约1.5σ或更高并且T205处的tau磷酸化与总tau的比率为约1.5σ或更低时，将受试者诊断为距由AD引起的MCI发作约10至约25年或约10至约20年，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的总tau与T217和T205处、T181和T205处或T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准偏差。在各种实施方案中，在T217处的tau磷酸化与总tau的比率和/或在T181处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约1.3σ、约1.35σ、约1.4σ、约1.45σ、约1.5σ、约1.6σ、约1.7σ、约1.8σ、约1.9σ、约2σ或高于2σ。在其他实施方案中，在T217处的tau磷酸化与总tau的比率和/或在T181处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约1.85σ、约1.9σ、约1.95σ、约2σ、约2.1σ、约2.2σ、约2.3σ、约2.4σ、约2.5σ或高于2.5σ。在每个以上实施方案中，在T205处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约1.3σ、约1.35σ、约1.4σ、约1.45σ、约1.50σ、约1.55σ、约1.6σ、约1.7σ、约1.8σ、约1.9σ、约2.0σ或低于2σ。可替代地，在T205处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约2.0σ、约2.05σ、约2.1σ、约2.2σ、约2.3σ、约2.4σ、约2.5σ或低于2.5σ。在另一个实例中，在T217处的tau磷酸化与总tau的比率和/或在T181处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约2σ或更高，并且在T205处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约2σ或更低。除了使用阈值(例如，高于或低于平均值至少1个标准偏差)之外，在一些实施方案中，高于或低于平均值的变化程度可用于诊断受试者。
在另一个实例中，本公开的方法包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并测量在(i)T181和T205处、(ii)T217和T205处或(iii)T181、T217和T205处的tau磷酸化；以及(b)当(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化为约1.5σ或更高时，将受试者诊断为距由AD引起的MCI发作约15年或更短或约10年或更短，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的T217和T205处、T181和T205处或T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准偏差。在各种实施方案中，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化可以为约1.3σ、约1.35σ、约1.4σ、约1.45σ、约1.5σ、约1.6σ、约1.7σ、约1.8σ、约1.9σ、约2σ或高于2σ。在其他实施方案中，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化可以为约1.85σ、约1.9σ、约1.95σ、约2σ、约2.1σ、约2.2σ、约2.3σ、约2.4σ、约2.5σ或高于2.5σ。在另一实例中，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化可以为约2σ或更高。除了使用阈值(例如，高于或低于平均值至少1个标准偏差)之外，在一些实施方案中，高于或低于平均值的变化程度可用于诊断受试者。在其他实施方案中，可以在各种数学运算中使用(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处测量的tau磷酸化，以与各自相比提高预测能力。例如，可以由所测量的磷酸化水平计算比率。也可以使用除比率之外的数学运算。
在另一个实例中，本公开的方法包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并测量总tau以及在(i)T181和T205处、(ii)T217和T205处或(iii)T181、T217和T205处的tau磷酸化；以及(b)当(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化与总tau的比率为约1.5σ或更高时，将受试者诊断为距由AD引起的MCI发作约15年或更短或约10年或更短，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的总tau以及在T217和T205处、T181和T205处或T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准偏差。在各种实施方案中，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约1.3σ、约1.35σ、约1.4σ、约1.45σ、约1.5σ、约1.6σ、约1.7σ、约1.8σ、约1.9σ、约2σ或高于2σ。在其他实施方案中，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约1.85σ、约1.9σ、约1.95σ、约2σ、约2.1σ、约2.2σ、约2.3σ、约2.4σ、约2.5σ或高于2.5σ。在另一实例中，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约2σ或更高。除了使用阈值(例如，高于或低于平均值至少1个标准偏差)之外，在一些实施方案中，高于或低于平均值的变化程度可用于诊断受试者。
在另一个实例中，本公开的方法包括(a)提供从受试者获得的第一和第二分离的tau样品，其中“第一”和“第二”是指收集样品的顺序，并且测量在(i)T181和T205处、(ii)T217和T205处或(iii)T181、T217和T205处的tau磷酸化；(b)计算每个测量的残基的位点特异性磷酸化的变化，以及任选地总tau的变化；以及(c)当T181和/或T217处的磷酸化水平降低或保持相同并且T205处的磷酸化水平和任选地总tau增加时，诊断受试者的AD阶段。可以间隔数天、数周或数月收集第一和第二分离的tau样品。通常，对于两个样品，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化也将为约1.5σ或更高，其中σ是通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的T217和T205处、T181和T205处或T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准偏差。在其他实施方案中，可以在各种数学运算中使用(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处测量的tau磷酸化，以与各自相比提高预测能力。例如，可以由所测量的磷酸化水平计算比率。也可以使用除比率之外的数学运算。
在另一个实施例中，本公开的方法包括(a)提供从受试者获得的第一和第二分离的tau样品，其中“第一”和“第二”是指收集样品的顺序，并且测量总tau以及在(i)T181和T205处、(ii)T217和T205处或(iii)T181、T217和T205处的tau磷酸化；(b)计算每个测量的残基的位点特异性磷酸化的变化，以及总tau的变化；以及(c)当T181和/或T217处的磷酸化水平降低或保持相同、T205处的磷酸化水平降低或保持相同并且总tau增加时，诊断受试者的AD阶段。可以间隔数天、数周或数月收集第一和第二分离的tau样品。通常，对于两个样品，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化也将为约1.5σ或更高，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的T217和T205处、T181和T205处或T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准偏差。在其他实施方案中，可以在各种数学运算中使用(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处测量的tau磷酸化，以与各自相比提高预测能力。例如，可以由所测量的磷酸化水平计算比率。也可以使用除比率之外的数学运算。
在部分II中描述了用于测量tau磷酸化和总tau的方法，并且以引用的方式将其并入此部分中。例如，使用实施例5-9详述的方案，如通过PET成像测量，如在从CSF纯化的分离的tau样品中测量的，在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中，以ptau/tau比率的百分比表示的在T181、T205和T217处的tau磷酸化分别为21.7±2.3、0.34±0.13和1.2±0.66(参见表3，突变非携带者列)。因此，对于p-T181/T181、p-T205/T205和p-T217/T217，高于突变非携带者群体中发现的平均值两倍标准偏差(即2σ)分别为43.4、0.68和2.4。然而，技术人员将理解，绝对值可以根据用于绝对定量的方案和内部标准物的来源/规格而变化。
在一个优选的实施方案中，分离的tau样品包含已通过亲和纯化从血液或CSF中纯化的tau，并且tau磷酸化通过质谱法测量。在另一个优选的实施方案中，分离的tau样品包含已使用特异性结合tau中间结构域内的表位的配体并且任选地使用特异性结合tau的N末端内的表位的第二配体通过亲和纯化从血液或CSF中纯化的tau，并且tau磷酸化通过高分辨率质谱法测量。在另一个优选的实施方案中，分离的tau样品包含已使用特异性结合tau中间结构域内的表位的配体并且任选地使用特异性结合tau的MTBR或C末端内的表位的第二配体通过亲和纯化从血液或CSF中纯化的tau，并且tau磷酸化通过高分辨率质谱法测量。在一个示例性实施方案中，使用实施例中概述的质谱方案。
IV.治疗方法
本公开的另一方面是一种用于治疗有需要的受试者的方法。如本文所用，术语“治疗”是指由受过训练并获得许可的专业人员向有需要的受试者提供医疗护理。所述医疗护理可以是诊断测试、治疗性治疗和/或预防性或防治性措施。治疗性和预防性治疗的目标是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或疾病/病症。治疗性或预防性治疗的有益或期望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延缓或减慢、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分缓解或是全部缓解)，无论是可检测或是不可检测。“治疗”还可以意指与未接受治疗的预期存活相比延长存活。需要治疗的患者包括已经患有疾病、病状或病症的患者以及易于患有疾病、病状或病症的患者或需要预防疾病、病状或病症的患者。在一些实施方案中，接受治疗的受试者是无症状的。如本文所用，“无症状受试者”是指未示出AD的任何体征或症状的受试者。在其他实施方案中，受试者可能表现出AD的体征或症状(例如，记忆丧失、错放东西、情绪或行为的变化等)，但未表现出用于临床诊断由阿尔茨海默氏病引起的轻度认知受损的足够认知或功能受损。在部分IV中定义了短语“由阿尔茨海默氏病引起的轻度认知受损”。有症状或无症状的受试者可能患有Aβ淀粉样变性；但是，对Aβ淀粉样变性的现有知识不是治疗所必需的。在其他实施方案中，可以将受试者诊断为患有AD。在任何上述实施方案中，受试者可能携带已知引起显性遗传的阿尔茨海默氏病的基因突变之一。在替代性实施方案中，受试者可能不携带已知引起显性遗传的阿尔茨海默氏病的基因突变。
在一个实施方案中，用于治疗如上文所述的受试者的方法可以包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并在所述分离的tau样品中测量在选自T111、S113、T181、S199、S202、S208、T153、T175、T205、S214、T217和T231的一个或多个氨基酸残基处的tau磷酸化，并且任选地测量总tau；以及(b)当如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的，测量的磷酸化水平显著偏离不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体的平均值时，向受试者施用药物组合物。在另一个实施方案中，用于治疗如上文所述的受试者的方法可以包括(a)提供从受试者获得的第一和第二分离的tau样品，并在每个分离的tau样品中测量在选自T111、S113、T181、S199、S202、S208、T153、T175、T205、S214、T217和T231的一个或多个氨基酸残基处的tau磷酸化，并且任选地测量总tau；(b)计算在每个测量的残基处的位点特异性磷酸化的变化以及任选地总tau的变化；以及(c)当如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的，计算的变化显著偏离不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体的平均值时，向受试者施用药物组合物。“显著偏离平均值”是指高于或低于平均值至少1个标准偏差，优选地至少1.3个标准偏差，更优选地至少1.5个标准偏差或甚至更优选地至少2个标准偏差的值(即，分别为1σ、1.3σ、1.5σ或1.5σ，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的正态分布所定义的标准偏差。除了使用阈值(例如，高于或低于平均值至少1个标准偏差)之外，在一些实施方案中，高于或低于平均值的变化程度可用作治疗受试者的标准。
可替代地或除了使用位点特异性tau磷酸化的测量、任选地使用总tau的测量之外，在任何以上实施方案中，可以使用由所测量的磷酸化水平计算的比率或由所测量的磷酸化水平和总tau计算的比率。由测量的磷酸化水平计算的比率可以是p-T181与p-T205之间、p-T217与p-T205之间或p-T181与p-T217之间的比率。由测量的磷酸化水平和总tau计算的比率可以是p-T181与总tau之间、p-T205与总tau之间或p-T217与总tau之间的比率。也可以使用除比率之外的数学运算。例如，实例在各种统计模型(例如线性回归、LME曲线、LOESS曲线等)中使用位点特异性tau磷酸化值，并结合其他已知的生物标志物(例如APOEε4状态、年龄、性别、认知测试评分、功能测试评分等)。
预期用于或用于处于发展Aβ淀粉样变性或AD的风险下的受试者、诊断为患有Aβ淀粉样变性的受试者、诊断为患有tau病的受试者或诊断为患有AD的受试者的许多成像剂和治疗剂靶向特定的病理生理学变化。例如，Aβ靶向疗法通常被设计为减少Aβ产生、拮抗Aβ聚集或增加脑Aβ清除；tau靶向疗法通常被设计为改变tau磷酸化模式、拮抗tau聚集或增加NFT清除；多种疗法被设计为减轻CNS炎症或脑胰岛素抗性等。这些各种药剂的功效可以通过向如通过本文所公开的方法测量的在T111、S113、T181、S199、S202、S208、T153、T175、T205、S214、T217和T231处具有一定tau磷酸化水平的受试者施用所述药剂来提高。
在一个示例性实施方案中，预期用于或用于处于发展Aβ淀粉样变性或AD的风险下的受试者、诊断为患有Aβ淀粉样变性的受试者、诊断为患有tau蛋白病的受试者或诊断为患有AD的受试者的成像剂和治疗剂(在本文中统称为“Aβ和tau疗法”)的功效可通过向如通过本文公开以及例如图22中所示的方法测量的在T181、T205和/或T217处具有一定tau磷酸化水平的受试者施用Aβ或tau疗法来提高。例如，当T217处的tau磷酸化为约1.5σ或更高并且T181和T205处的tau磷酸化为约1.5σ或更低时，优选的治疗剂可包括被设计为预防受试者变成淀粉样蛋白阳性的那些治疗剂(例如，被设计为减少Aβ产生、拮抗Aβ聚集等的淀粉样蛋白靶向疗法)。作为另一个实例，当T217和/或T181处的tau磷酸化为约1.5σ或更高并且T205处的tau磷酸化为约1.5σ或更低时，优选的治疗剂可以包括被设计为预防淀粉样蛋白沉积增加或减少受试者现有斑块负荷的那些治疗剂。作为另一个实例，当T217、T181和T205处的tau磷酸化为约1.5σ或更高时，优选的治疗剂可包括被设计为预防淀粉样蛋白沉积增加、减少受试者现有斑块负荷、预防tau聚集或靶向NFT的那些治疗剂。作为另一个实例，当T217、T181和T205处的tau磷酸化为约1.5σ或更高并且T217或T181处的tau磷酸化稳定或减少，并且总tau和/或T205处的tau磷酸化增加时，优选的治疗剂可以包括被设计为预防淀粉样蛋白沉积增加、减少受试者现有斑块负荷、预防tau聚集或靶向NFT的那些治疗剂，以及对患有AD的受试者具有特异性的那些治疗剂。本文公开的详情可类似地用于施用针对其他靶标(例如，CNS炎症、ApoE等)设计的治疗剂，包括但不限于以下段落中鉴定的那些治疗剂。
在一个实例中，本公开提供了一种用于治疗由于AD而转化为MCI的风险增加的受试者的方法，所述方法包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并测量在(i)T217和T205处、(ii)T181和T205处或(iii)T181、T205和T217处的tau磷酸化；以及(b)当T217和/或T181处的tau磷酸化为约1.5σ或更高并且T205处的tau磷酸化为约1.5σ或更低时，向受试者施用药物组合物，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的T217和T205处、T181和T205处或T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准偏差。在各种实施方案中，在T217处的tau磷酸化和/或在T181处的tau磷酸化可以为约1.3σ、约1.35σ、约1.4σ、约1.45σ、约1.5σ、约1.6σ、约1.7σ、约1.8σ、约1.9σ、约2σ或高于2σ。在其他实施方案中，在T217处的tau磷酸化和/或在T181处的tau磷酸化可以为约1.85σ、约1.9σ、约1.95σ、约2σ、约2.1σ、约2.2σ、约2.3σ、约2.4σ、约2.5σ或高于2.5σ。在每个以上实施方案中，在T205处的tau磷酸化可以为约1.3σ、约1.35σ、约1.4σ、约1.45σ、约1.5σ、约1.51σ、约1.55σ、约1.6σ、约1.7σ、约1.8σ、约1.9σ、约2.0σ或低于2.0σ。可替代地，在T205处的tau磷酸化可以为约2.0σ、约2.05σ、约2.1σ、约2.2σ、约2.3σ、约2.4σ、约2.5σ或低于2.5σ。在另一个实例中，在T217处的tau磷酸化和/或在T181处的tau磷酸化为约2σ或更高，并且在T205处的tau磷酸化可以为约2σ或更低。除了使用阈值(例如，高于或低于平均值至少1个标准偏差)之外，在一些实施方案中，高于或低于平均值的变化程度可用作治疗受试者的标准。在其他实施方案中，可以在各种数学运算中使用在T205处以及在T181和/或T217处测量的tau磷酸化水平，以与各自相比提高预测能力。例如，可以由所测量的磷酸化水平计算比率。也可以使用除比率之外的数学运算。
在另一个实例中，本公开提供了一种用于治疗由于AD而转化为MCI的风险增加的受试者的方法，所述方法包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并测量总tau和在(i)T217和T205处、(ii)T181和T205处或(iii)T181、T205和T217处的tau磷酸化；以及(b)当T217处的tau磷酸化与总tau的比率和/或T181处的tau磷酸化与总tau的比率为约1.5σ或更高并且T205处的tau磷酸化与总tau的比率为约1.5σ或更低时，向受试者施用药物组合物，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的总tau以及T217和T205处、T181和T205处或T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准偏差。在各种实施方案中，在T217处的tau磷酸化与总tau的比率和/或在T181处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约1.3σ、约1.35σ、约1.4σ、约1.45σ、约1.5σ、约1.6σ、约1.7σ、约1.8σ、约1.9σ、约2σ或高于2σ。在其他实施方案中，在T217处的tau磷酸化与总tau的比率和/或在T181处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约1.85σ、约1.9σ、约1.95σ、约2σ、约2.1σ、约2.2σ、约2.3σ、约2.4σ、约2.5σ或高于2.5σ。在每个以上实施方案中，在T205处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约1.3σ、约1.35σ、约1.4σ、约1.45σ、约1.50σ、约1.55σ、约1.6σ、约1.7σ、约1.8σ、约1.9σ、约2.0σ或低于2σ。可替代地，在T205处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约2.0σ、约2.05σ、约2.1σ、约2.2σ、约2.3σ、约2.4σ、约2.5σ或低于2.5σ。在另一个实例中，在T217处的tau磷酸化与总tau的比率和/或在T181处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约2σ或更高，并且在T205处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约2σ或更低。除了使用阈值(例如，高于或低于平均值至少1个标准偏差)之外，在一些实施方案中，高于或低于平均值的变化程度可用作治疗受试者的标准。
在另一个实例中，本公开提供了一种用于治疗由于AD而转化为MCI的风险增加的受试者的方法，所述方法包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并测量在(i)T181和T205处、(ii)T217和T205处或(iii)T181、T217和T205处的tau磷酸化；以及(b)当(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化为约1.5σ或更高时，向受试者施用药物组合物，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的T217和T205处、T181和T205处或T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准偏差。在各种实施方案中，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化可以为约1.3σ、约1.35σ、约1.4σ、约1.45σ、约1.5σ、约1.6σ、约1.7σ、约1.8σ、约1.9σ、约2σ或高于2σ。在其他实施方案中，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化可以为约1.85σ、约1.9σ、约1.95σ、约2σ、约2.1σ、约2.2σ、约2.3σ、约2.4σ、约2.5σ或高于2.5σ。在另一实例中，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化可以为约2.0σ或更高。除了使用阈值(例如，高于或低于平均值至少1个标准偏差)之外，在一些实施方案中，高于或低于平均值的变化程度可用作治疗受试者的标准。在其他实施方案中，可以在各种数学运算中使用(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处测量的tau磷酸化，以与各自相比提高预测能力。例如，可以由所测量的磷酸化水平计算比率。也可以使用除比率之外的数学运算。
在另一个实例中，本公开提供了一种用于治疗由于AD而转化为MCI的风险增加的受试者的方法，所述方法包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并测量总tau以及在(i)T181和T205处、(ii)T217和T205处或(iii)T181、T217和T205处的tau磷酸化；以及(b)当(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化与总tau的比率为约1.5σ或更高时，向受试者施用药物组合物，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的总tau以及T217和T205处、T181和T205处或T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准偏差。在各种实施方案中，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约1.3σ、约1.35σ、约1.4σ、约1.45σ、约1.5σ、约1.6σ、约1.7σ、约1.8σ、约1.9σ、约2σ或高于2σ。在其他实施方案中，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约1.85σ、约1.9σ、约1.95σ、约2σ、约2.1σ、约2.2σ、约2.3σ、约2.4σ、约2.5σ或高于2.5σ。在另一实例中，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约2σ或更高。除了使用阈值(例如，高于或低于平均值至少1个标准偏差)之外，在一些实施方案中，高于或低于平均值的变化程度可用作治疗受试者的标准。
在另一个实例中，本公开提供了一种用于治疗患有AD症状的受试者的方法，所述方法包括(a)提供从受试者获得的第一和第二分离的tau样品，其中“第一”和“第二”是指收集样品的顺序，并且测量在(i)T181和T205处、(ii)T217和T205处或(iii)T181、T217和T205处的tau磷酸化；(b)计算每个测量的残基的位点特异性磷酸化的变化，以及任选地总tau的变化；以及(c)当T181和/或T217处的磷酸化水平降低或保持相同并且T205处的磷酸化水平和任选地总tau增加时，向受试者施用药物组合物。可以间隔数天、数周或数月收集第一和第二分离的tau样品。通常，对于两个样品，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化也将为约1.5σ或更高，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的T217和T205处、T181和T205处或T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准偏差。在其他实施方案中，可以在各种数学运算中使用(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处测量的tau磷酸化，以与各自相比提高预测能力。例如，可以由所测量的磷酸化水平计算比率。也可以使用除比率之外的数学运算。
在另一个实例中，本公开提供了一种用于治疗患有AD症状的受试者的方法，所述方法包括(a)提供从受试者获得的第一和第二分离的tau样品，其中“第一”和“第二”是指收集样品的顺序，并且测量总tau以及在(i)T181和T205处、(ii)T217和T205处或(iii)T181、T217和T205处的tau磷酸化；(b)计算每个测量的残基的位点特异性磷酸化的变化，以及总tau的变化；以及(c)当T181和/或T217处的磷酸化水平降低或保持相同、T205处的磷酸化水平降低或保持相同并且总tau增加时，向受试者施用药物组合物。可以间隔数天、数周或数月收集第一和第二分离的tau样品。通常，对于两个样品，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化也将为约1.5σ或更高，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的T217和T205处、T181和T205处或T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准偏差。在其他实施方案中，可以在各种数学运算中使用(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处测量的tau磷酸化，以与各自相比提高预测能力。例如，可以由所测量的磷酸化水平计算比率。也可以使用除比率之外的数学运算。
在每个以上实施方案中，药物组合物可包含成像剂。成像剂的非限制性实例包括功能性成像剂(例如氟脱氧葡萄糖等)和分子成像剂(例如匹兹堡化合物B、氟比他班(florbetaben)、氟贝他吡(florbetapir)、氟替莫尔(flutemetamol)、放射性核素标记的抗体等)。
可替代地，药物组合物可包含活性药物成分。活性药物成分的非限制性实例包括胆碱酯酶抑制剂、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、抗抑郁剂(例如选择性血清素再摄取抑制剂、非典型抗抑郁剂、氨基酮、选择性血清素和去甲肾上腺素再摄取抑制剂、三环抗抑郁剂等)、γ-分泌酶抑制剂、β-分泌酶抑制剂、抗Aβ抗体(包括其抗原结合片段、变体或衍生物)、抗tau抗体(包括其抗原结合片段、变体或衍生物)、干细胞、膳食补充剂(例如锂水、具有硫辛酸的ω-3脂肪酸、长链甘油三酯、染料木黄酮、白藜芦醇、姜黄素和葡萄籽提取物等)、血清素受体6的拮抗剂、p38αMAPK抑制剂、重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、被动免疫疗法、活性疫苗(例如CAD106、AF20513等)、tau蛋白聚集抑制剂(例如TRx0237、氯化甲基硫亚胺等)、改善血糖控制的疗法(例如胰岛素、艾塞那肽、利拉鲁肽吡格列酮等)、抗炎剂、磷酸二酯酶9A抑制剂、σ-1受体激动剂、激酶抑制剂、磷酸酶活化剂、磷酸酶抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、CB1和/或CB2内源性大麻素受体部分激动剂、β-2肾上腺素能受体激动剂、烟碱性乙酰胆碱受体激动剂、5-HT2A反向激动剂、α-2c肾上腺素能受体拮抗剂、5-HT1A和1D受体激动剂、谷氨酰胺肽环转移酶抑制剂、APP产生的选择性抑制剂、单胺氧化酶B抑制剂、谷氨酸受体拮抗剂、AMPA受体激动剂、神经生长因子刺激剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、神经营养剂、毒蕈碱M1受体激动剂、GABA受体调节剂、PPAR-γ激动剂、微管蛋白调节剂、钙通道阻断剂、抗高血压药、他汀类药物以及其任何组合。
在另一个替代方案中，药物组合物可以包含激酶抑制剂。合适的激酶抑制剂可以抑制一千零一个氨基酸激酶(TAOK)、CDK、GSK-3β、MARK、CDK5、Fyn、5'腺苷单磷酸活化蛋白激酶(AMPK)、钙-钙调蛋白激酶II、细胞周期蛋白-依赖性激酶5(cdk5)、酪蛋白激酶1(CK1)、酪蛋白激酶2(CK2)、环状AMP-依赖性蛋白激酶(PKA)、双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)、糖原合酶激酶-3(GSK-3)、JNK、LRRK2、微管亲和力调节激酶(MARK)、MSK1、p35/41、p42/p44丝裂原活化蛋白激酶(ERKs1/2)、p38丝裂原活化激酶(p38MAPK)、p70S6激酶、磷酸化酶激酶、PKB/AKT、蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶N(PKN)、前列腺源性无菌20样激酶1α/β、90kDa核糖体S6激酶(RSK1/2)(PSK1/TAOK2)、前列腺源性无菌20样激酶2(PSK2/TAOK1)、应激活化蛋白激酶(SAPK)1γ、SAPK2a、SAPK2b、SAPK3、SAPK4、SGK1、SRPK2或Tau-微管蛋白激酶1/2(TTBK1/2)。
在另一个替代方案中，药物组合物可以包含磷酸酶活化剂。作为非限制性实例，磷酸酶活化剂可以增加蛋白磷酸酶1、2A，2B或5的活性。
在部分II中描述了用于测量tau磷酸化和总tau的方法，并且以引用的方式将其并入此部分中。在一个优选的实施方案中，分离的tau样品包含已通过亲和纯化从血液或CSF中纯化的tau，并且tau磷酸化通过质谱法测量。在另一个优选的实施方案中，分离的tau样品包含已使用特异性结合tau中间结构域内的表位的配体并且任选地使用特异性结合tau的N末端内的表位的第二配体通过亲和纯化从血液或CSF中纯化的tau，并且tau磷酸化通过高分辨率质谱法测量。在另一个优选的实施方案中，分离的tau样品包含已使用特异性结合tau中间结构域内的表位的配体并且任选地使用特异性结合tau的MTBR或C末端内的表位的第二配体通过亲和纯化从血液或CSF中纯化的tau，并且tau磷酸化通过高分辨率质谱法测量。在一个示例性实施方案中，使用实施例中概述的质谱方案。
V.临床试验
本公开的另一方面是一种用于将受试者纳入临床试验，特别是针对Aβ或tau疗法的临床试验的方法，条件是已经满足所述临床试验的所有其他标准。在一个实施方案中，用于将受试者纳入临床试验的方法可包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并在所述分离的tau样品中测量在选自T111、S113、T181、S199、S202、S208、T153、T175、T205、S214、T217和T231的一个或多个氨基酸残基处的tau磷酸化，并且任选地测量总tau；以及(b)当如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的，测量的磷酸化水平显著偏离不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体的平均值时，将受试者纳入临床试验。在另一个实施方案中，用于将受试者纳入临床试验的方法可包括(a)提供从受试者获得的第一和第二分离的tau样品，并在每个分离的tau样品中测量在选自T111、S113、T181、S199、S202、S208、T153、T175、T205、S214、T217和T231的一个或多个氨基酸残基处的tau磷酸化，并且任选地测量总tau；(b)计算在每个测量的残基处的位点特异性磷酸化的变化以及任选地总tau的变化；以及(c)当如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的，计算的变化显著偏离不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体的平均值时，将受试者纳入临床试验。在部分IV中定义了短语“如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体”。“显著偏离平均值”是指高于或低于平均值至少1个标准偏差，优选地至少1.3个标准偏差，更优选地至少1.5个标准偏差或甚至更优选地至少2个标准偏差的值(即，分别为1σ、1.3σ、1.5σ或1.5σ，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的正态分布所定义的标准偏差。除了使用阈值(例如，高于或低于平均值至少1个标准偏差)之外，在一些实施方案中，高于或低于平均值的变化程度可用于纳入受试者的标准。
可替代地或除了使用位点特异性tau磷酸化的测量、任选地使用总tau的测量之外，在任何以上实施方案中，可以使用由所测量的磷酸化水平计算的比率或由所测量的磷酸化水平和总tau计算的比率。由测量的磷酸化水平计算的比率可以是p-T181与p-T205之间、p-T217与p-T205之间或p-T181与p-T217之间的比率。由测量的磷酸化水平和总tau计算的比率可以是p-T181与总tau之间、p-T205与总tau之间或p-T217与总tau之间的比率。也可以使用除比率之外的数学运算。例如，实例在各种统计模型(例如线性回归、LME曲线、LOESS曲线等)中使用位点特异性tau磷酸化值，并结合其他已知的生物标志物(例如APOEε4状态、年龄、性别、认知测试评分、功能测试评分等)。
可以通过本文公开的方法极大地辅助Aβ和tau疗法的临床试验的设计。设计了许多临床试验来测试靶向在AD症状发作之前发生的特定病理生理变化的成像剂或治疗剂的功效。如在以上部分V中所讨论的，可以通过向具有某些位点特异性tau磷酸化水平的受试者施用所述药剂来提高这些各种药剂的功效，如通过本文公开和说明的方法所测量的。类似地，招募具有AD症状的受试者(例如，由AD引起的MCI发作后)的临床试验也将受益于能够对登记者的AD状态进行准确地分期，以便确定功效是否与AD的特定阶段有关。因此，在将受试者纳入临床试验，特别是纳入临床试验的治疗组之前，如本文所述测量tau磷酸化水平可以导致试验较小和/或结果改善。在一些情况下，可开发本文所述的方法并将其用作治疗剂的伴随诊断。
在一个示例性实施方案中，用于将受试者纳入临床试验的方法可包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并在所述分离的tau样品中测量在选自T181、T205和T217的一个或多个氨基酸残基处的tau磷酸化，并且任选地测量总tau；以及(b)当如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的，测量的磷酸化水平显著偏离不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体的平均值时，将受试者纳入临床试验。在另一个示例性实施方案中，用于将受试者纳入临床试验的方法可包括(a)提供从受试者获得的第一和第二分离的tau样品，并在每个分离的tau样品中测量在选自T181、T205和T217的一个或多个氨基酸残基处的tau磷酸化，并且任选地测量总tau；(b)计算在每个测量的残基处的位点特异性磷酸化的变化以及任选地总tau的变化；以及(c)当如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的，计算的变化显著偏离不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体的平均值时，将受试者纳入临床试验。在部分IV中定义了短语“如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体”。“显著偏离平均值”是指高于或低于平均值至少1个标准偏差，优选地至少1.3个标准偏差，更优选地至少1.5个标准偏差或甚至更优选地至少2个标准偏差的值(即，分别为1σ、1.3σ、1.5σ或1.5σ，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的正态分布所定义的标准偏差。除了使用阈值(例如，高于或低于平均值至少1个标准偏差)之外，在一些实施方案中，高于或低于平均值的变化程度可用于纳入受试者的标准。
在一个实例中，本公开提供一种用于将受试者纳入临床试验的方法，所述方法包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并测量在(i)T217和T205处、(ii)T181和T205处或(iii)T181、T205和T217处的tau磷酸化；以及(b)当T217和/或T181处的tau磷酸化为约1.5σ或更高且T205处的tau磷酸化为约1.5σ或更低时，将药物组合物施用给受试者，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的T217和T205处、T181和T205处或T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准偏差。在各种实施方案中，在T217处的tau磷酸化和/或在T181处的tau磷酸化可以为约1.3σ、约1.35σ、约1.4σ、约1.45σ、约1.5σ、约1.6σ、约1.7σ、约1.8σ、约1.9σ、约2σ或高于2σ。在其他实施方案中，在T217处的tau磷酸化和/或在T181处的tau磷酸化可以为约1.85σ、约1.9σ、约1.95σ、约2σ、约2.1σ、约2.2σ、约2.3σ、约2.4σ、约2.5σ或高于2.5σ。在每个以上实施方案中，在T205处的tau磷酸化可以为约1.3σ、约1.35σ、约1.4σ、约1.45σ、约1.5σ、约1.51σ、约1.55σ、约1.6σ、约1.7σ、约1.8σ、约1.9σ、约2.0σ或低于2.0σ。可替代地，在T205处的tau磷酸化可以为约2.0σ、约2.05σ、约2.1σ、约2.2σ、约2.3σ、约2.4σ、约2.5σ或低于2.5σ。在另一个实例中，在T217处的tau磷酸化和/或在T181处的tau磷酸化为约2σ或更高，并且在T205处的tau磷酸化可以为约2σ或更低。除了使用阈值(例如，高于或低于平均值至少1个标准偏差)之外，在一些实施方案中，高于或低于平均值的变化程度可用于纳入受试者的标准。在其他实施方案中，可以在各种数学运算中使用在T205处以及在T181和/或T217处测量的tau磷酸化水平，以与各自相比提高预测能力。例如，可以由所测量的磷酸化水平计算比率。也可以使用除比率之外的数学运算。
在另一个实例中，本公开提供一种用于将受试者纳入临床试验的方法，所述方法包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并测量总tau以及在(i)T217和T205处、(ii)T181和T205处或(iii)T181、T205和T217处的tau磷酸化；以及(b)当T217处的tau磷酸化与总tau的比率和/或T181处的tau磷酸化与总tau的比率为约1.5σ或更高并且T205处的tau磷酸化与总tau的比率为约1.5σ或更低时，将药物组合物施用给受试者，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的总tau以及T217和T205处、T181和T205处或T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准偏差。在各种实施方案中，在T217处的tau磷酸化与总tau的比率和/或在T181处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约1.3σ、约1.35σ、约1.4σ、约1.45σ、约1.5σ、约1.6σ、约1.7σ、约1.8σ、约1.9σ、约2σ或高于2σ。在其他实施方案中，在T217处的tau磷酸化与总tau的比率和/或在T181处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约1.85σ、约1.9σ、约1.95σ、约2σ、约2.1σ、约2.2σ、约2.3σ、约2.4σ、约2.5σ或高于2.5σ。在每个以上实施方案中，在T205处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约1.3σ、约1.35σ、约1.4σ、约1.45σ、约1.50σ、约1.55σ、约1.6σ、约1.7σ、约1.8σ、约1.9σ、约2.0σ或低于2σ。可替代地，在T205处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约2.0σ、约2.05σ、约2.1σ、约2.2σ、约2.3σ、约2.4σ、约2.5σ或低于2.5σ。在另一个实例中，在T217处的tau磷酸化与总tau的比率和/或在T181处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约2σ或更高，并且在T205处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约2σ或更低。除了使用阈值(例如，高于或低于平均值至少1个标准偏差)之外，在一些实施方案中，高于或低于平均值的变化程度可用于纳入受试者的标准。
在另一个实例中，本公开提供一种用于将受试者纳入临床试验的方法，所述方法包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并测量在(i)T181和T205处、(ii)T217和T205处或(iii)T181、T217和T205处的tau磷酸化；以及(b)当(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化为约1.5σ或更高时，将药物组合物施用给受试者，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的T217和T205处、T181和T205处或T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准偏差。在各种实施方案中，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化可以为约1.3σ、约1.35σ、约1.4σ、约1.45σ、约1.5σ、约1.6σ、约1.7σ、约1.8σ、约1.9σ、约2σ或高于2σ。在其他实施方案中，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化可以为约1.85σ、约1.9σ、约1.95σ、约2σ、约2.1σ、约2.2σ、约2.3σ、约2.4σ、约2.5σ或高于2.5σ。在另一实例中，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化可以为约2σ或更高。除了使用阈值(例如，高于或低于平均值至少1个标准偏差)之外，在一些实施方案中，高于或低于平均值的变化程度可用于纳入受试者的标准。在其他实施方案中，可以在各种数学运算中使用(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处测量的tau磷酸化，以与各自相比提高预测能力。例如，可以由所测量的磷酸化水平计算比率。也可以使用除比率之外的数学运算。
在另一个实例中，本公开提供一种用于将受试者纳入临床试验的方法，所述方法包括(a)提供从受试者获得的分离的tau样品，并测量总tau以及在(i)T181和T205处、(ii)T217和T205处或(iii)T181、T217和T205处的tau磷酸化；以及(b)当(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化与总tau的比率为约1.5σ或更高时，将药物组合物施用给受试者，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的总tau以及T217和T205处、T181和T205处或T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准偏差。在各种实施方案中，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约1.3σ、约1.35σ、约1.4σ、约1.45σ、约1.5σ、约1.6σ、约1.7σ、约1.8σ、约1.9σ、约2σ或高于2σ。在其他实施方案中，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约1.85σ、约1.9σ、约1.95σ、约2σ、约2.1σ、约2.2σ、约2.3σ、约2.4σ、约2.5σ或高于2.5σ。在另一实例中，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化与总tau的比率可以为约2.0σ或更高。除了使用阈值(例如，高于或低于平均值至少1个标准偏差)之外，在一些实施方案中，高于或低于平均值的变化程度可用于纳入受试者的标准。
在另一个实例中，本公开提供一种用于将受试者纳入临床试验的方法，所述方法包括(a)提供从受试者获得的第一和第二分离的tau样品，其中“第一”和“第二”是指收集样品的顺序，并且测量在(i)T181和T205处、(ii)T217和T205处或(iii)T181、T217和T205处的tau磷酸化；(b)计算每个测量的残基的位点特异性磷酸化的变化，以及任选地总tau的变化；以及(c)当T181和/或T217处的磷酸化水平降低或保持相同并且T205处的磷酸化水平和任选地总tau增加时，将受试者纳入临床试验。可以间隔数天、数周或数月收集第一和第二分离的tau样品。通常，对于两个样品，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化也将为约1.5σ或更高，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的T217和T205处、T181和T205处或T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准偏差。在其他实施方案中，可以在各种数学运算中使用(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处测量的tau磷酸化，以与各自相比提高预测能力。例如，可以由所测量的磷酸化水平计算比率。也可以使用除比率之外的数学运算。
在另一个实例中，本公开提供一种用于将受试者纳入临床试验的方法，所述方法包括(a)提供从受试者获得的第一和第二分离的tau样品，其中“第一”和“第二”是指收集样品的顺序，并且测量总tau以及在(i)T181和T205处、(ii)T217和T205处或(iii)T181、T217和T205处的tau磷酸化；(b)计算每个测量的残基的位点特异性磷酸化的变化，以及总tau的变化；以及(c)当T181和/或T217处的磷酸化水平降低或保持相同、T205处的磷酸化水平降低或保持相同并且总tau增加时，将受试者纳入临床试验。可以间隔数天、数周或数月收集第一和第二分离的tau样品。通常，对于两个样品，(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处的tau磷酸化也将为约1.5σ或更高，其中σ是由如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中所测量的T217和T205处、T181和T205处或T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准偏差。在其他实施方案中，可以在各种数学运算中使用(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特异性位点处测量的tau磷酸化，以与各自相比提高预测能力。例如，可以由所测量的磷酸化水平计算比率。也可以使用除比率之外的数学运算。
在部分II中描述了用于测量tau磷酸化和总tau的方法，并且以引用的方式将其并入此部分中。例如，使用实施例5-9详述的方案，如通过PET成像测量，如在从CSF纯化的分离的tau样品中测量的，在不具有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中，T181、T205和T217处的tau磷酸化分别为21.7±2.3、0.34±0.13和1.2±0.66(参见表3，突变非携带者列)。因此，对于p-T181、p-T205和p-T217，高出突变非携带者群体中发现的平均值两倍标准偏差(即2σ)分别为43.4、0.68和2.4。然而，技术人员将理解，绝对值可以根据方案而变化。
在一个优选的实施方案中，分离的tau样品包含已通过亲和纯化从血液或CSF中纯化的tau，并且tau磷酸化通过质谱法测量。在另一个优选的实施方案中，分离的tau样品包含已使用特异性结合tau中间结构域内的表位的配体并且任选地使用特异性结合tau的N末端内的表位的第二配体通过亲和纯化从血液或CSF中纯化的tau，并且tau磷酸化通过高分辨率质谱法测量。在另一个优选的实施方案中，分离的tau样品包含已使用特异性结合tau中间结构域内的表位的配体并且任选地使用特异性结合tau的MTBR或C末端内的表位的第二配体通过亲和纯化从血液或CSF中纯化的tau，并且tau磷酸化通过高分辨率质谱法测量。在一个示例性实施方案中，使用实施例中概述的质谱方案。
在每个以上实施方案中，可以将受试者纳入临床试验的治疗组。在部分V中定义了“治疗”。可以向纳入临床试验的治疗组的受试者施用药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物可包含成像剂。成像剂的非限制性实例包括功能性成像剂(例如氟脱氧葡萄糖等)和分子成像剂(例如匹兹堡化合物B、氟比他班、氟贝他吡、氟替莫尔、放射性核素标记的抗体等)。可替代地，药物组合物可包含活性药物成分。活性药物成分的非限制性实例包括胆碱酯酶抑制剂、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、抗抑郁剂(例如选择性血清素再摄取抑制剂、非典型抗抑郁剂、氨基酮、选择性血清素和去甲肾上腺素再摄取抑制剂、三环抗抑郁剂等)、γ-分泌酶抑制剂、β-分泌酶抑制剂、抗Aβ抗体(包括其抗原结合片段、变体或衍生物)、抗tau抗体(包括其抗原结合片段、变体或衍生物)、干细胞、膳食补充剂(例如锂水、具有硫辛酸的ω-3脂肪酸、长链甘油三酯、染料木黄酮、白藜芦醇、姜黄素和葡萄籽提取物等)、血清素受体6的拮抗剂、p38αMAPK抑制剂、重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、被动免疫疗法、活性疫苗(例如CAD106、AF20513等)、tau蛋白聚集抑制剂(例如TRx0237、氯化甲基硫亚胺等)、改善血糖控制的疗法(例如胰岛素、艾塞那肽、利拉鲁肽吡格列酮等)、抗炎剂、磷酸二酯酶9A抑制剂、σ-1受体激动剂、激酶抑制剂、磷酸酶活化剂、磷酸酶抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、CB1和/或CB2内源性大麻素受体部分激动剂、β-2肾上腺素能受体激动剂、烟碱性乙酰胆碱受体激动剂、5-HT2A反向激动剂、α-2c肾上腺素能受体拮抗剂、5-HT1A和1D受体激动剂、谷氨酰胺肽环转移酶抑制剂、APP产生的选择性抑制剂、单胺氧化酶B抑制剂、谷氨酸受体拮抗剂、AMPA受体激动剂、神经生长因子刺激剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、神经营养剂、毒蕈碱M1受体激动剂、GABA受体调节剂、PPAR-γ激动剂、微管蛋白调节剂、钙通道阻断剂、抗高血压药、他汀类药物以及其任何组合。在一个示例性实施方案中，药物组合物可以包含激酶抑制剂。合适的激酶抑制剂可以抑制一千零一个氨基酸激酶(TAOK)、CDK、GSK-3β、MARK、CDK5、Fyn。在另一个示例性实施方案中，药物组合物可以包含磷酸酶活化剂。作为一个非限制性实例，磷酸酶活化剂可以增加蛋白质磷酸酶2A的活性。
在每个以上实施方案中，受试者可以是有症状或无症状，如本文所用，“无症状受试者”是指未示出AD的任何体征或症状的受试者。可替代地，受试者可能表现出AD的体征或症状(例如，记忆丧失、错放东西、情绪或行为的变化等)，但并未表现出用于临床诊断轻度认知受损的足够认知或功能受损。有症状或无症状的受试者可能患有Aβ淀粉样变性；但是，对Aβ淀粉样变性的现有知识不是治疗所必需的。在其他实施方案中，受试者可以患有AD。在任何上述实施方案中，受试者可能携带已知引起显性遗传的阿尔茨海默氏病的基因突变之一。在替代性实施方案中，受试者可能不携带已知引起显性遗传的阿尔茨海默氏病的基因突变。
包括以下实施例以示范本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当了解在以下实施例中公开的技术代表本发明人发现在实践本发明时起较好作用的技术。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在已公开并仍获得类似或相似结果的特定实施方案中做出改变。因此，在附图中阐述或示出的所有内容应被解释为说明性的，而不是限制性的。
以下实施例说明了本发明的各种迭代。
实施例1-正常非AD人脑中的tau蛋白上的磷酸化位点
为了确定正常可溶性脑tau的磷酸化位点，通过使用Tau-1和HJ8.5tau抗体进行免疫捕获从而浓缩磷酸化和未磷酸化tau二者来纯化来自健康对照的提取物。对脑tau同种型的胰蛋白酶消化产生27种未修饰的肽，所述肽的长度和疏水性足以通过LC-MS检测到(Barthélemy等人,2016)。25种肽含有丝氨酸和/或苏氨酸作为潜在磷酸化位点。几种肽含有多个潜在磷酸化位点(4-9)，这使得考虑在LC分离期间可能一起共洗脱的不同单磷酸化肽。此后，将上文所述的PRM筛选方法应用于这些肽。
对tau序列(103-126)中的投射结构域的分析结果表明，多种p-tau肽洗脱为重叠的复杂LC-MS/MS模式(图3-7)。从0N同种型(tau蛋白的最短同种型)中鉴定出3个磷酸化位点。尽管LC系统不具有区分3种磷酸化肽的分辨率，但是使用片段鉴定和对应的强度来对由残基S113处的一个主要磷酸化位点和残基T111和T123处的两个次要磷酸化位点组成的信号进行去卷积(图3)。相比之下，当从较长的1N和2N同种型中进行tau序列的PRM筛选时，需要进一步色谱分离以简化磷酸化肽洗脱模式，尤其是当在同一肽序列内预测多个潜在单磷酸化位点时(图4-6)。LC分离使得能够鉴定出含有不同地磷酸化的残基的共洗脱的半特异性MS/MS片段。但是，还鉴定出一些可能由LC伪像产生的信号，可能是由溶液中同一种肽的双重构象所引起(图5)。这种作用对于未修饰和磷酸化肽的包含氨基酸残基45-67(在0N同种型中)的肽序列是重要的(图5)，而对于序列68-126(1N)和88-126(2N)不太普遍(图4和图6)。
残基S113、T111和T123处的磷酸化在肽序列68-126(1N)和88-126(2N)上得到证实。在所有情况下，S113信号是三者中最丰富的，其中磷酸化率为0.2-0.5％(图4和图6，表1)。在肽序列45-67(由1N和2N同种型共有)上清楚地鉴定出残基T50、T52和S56处的磷酸化。在同一种肽上，LC-MS信号表明三个残基(S61、T63和S64)中的至少两个被磷酸化(图5)。未发现鉴定残基S46处的潜在磷酸化的特异性信号。在序列68-126(1N)和68-87(2N)中证实了残基S68和T69处的磷酸化，但未检测到区分其LC-MS模式的特异性片段。在相同的1N和2N肽序列上，在T71上检测到较低的磷酸化水平。还鉴定出T76、T101和T102残基上的2N特异性磷酸化(汇总于图8中)。
也考虑诱导胰蛋白酶漏切割(trypsin missed cleavage)以用于筛选位于如先前所报告的胰蛋白酶位点(位点T175、T181、S212、T231和S396)之后的磷酸化残基(Hanger等人，1998)。PRM筛选成功检测到对应于Hanger等人已在正常脑组织中描述的磷酸化tau肽(T181、S199、S202和S404，图8)的LC-MS模式。对应的LC-MS信号较高，这表明先前在正常人脑中报告的p-tau肽可能是最丰富的。对S199和S202磷酸化的比较表明，S202处的磷酸化丰度高得多(图8)。使用抗Tau1抗体进行tau提取，与192-199个氨基酸序列上的非磷酸化表位相结合，可以解释提取物中S199磷酸化的低回收率。鉴于提取物中S202和S404磷酸化的丰度，从序列195-209和386-406中搜索二磷酸化肽的存在。检测到特异性片段对应于在S202/S199和S202/S198处的双磷酸化的两种LC-MS模式和对应于在396/404处的双磷酸化的一种LC-MS模式(图8)。
对脑提取物中的可溶性tau进行的额外筛选证明了对应于T175、S214、T217、T231和S396处的磷酸化残基的其他丰度较小的单磷酸化肽。当筛选单磷酸化肽序列181-190时，也以低水平检测到对应于S184或S185处的磷酸化肽的片段的信号(图8)。对长序列407-438上的单磷酸化的搜索发现与残基S409和S416处的磷酸化以及残基S412/S413/T414的组上的至少一个磷酸化一致的模式。
总之，使用PRM筛选方法鉴定出在从正常非AD脑中提取的可溶性tau级分中可检测的最少29个独特的磷酸化位点(表1)。其中25个位点可以明确地分配给独特的LC-MS信号，并且证明了4个其他磷酸化位点，而没有分配给确切的LC-MS模式。这些位点位于三个簇上：最少14个磷酸化位点位于N末端投射结构域中，10个位于序列中间的富脯氨酸结构域中，并且6个位于C末端中(图14)。
表1–脑/CSF池磷酸化率比较(HJ8.5+tau1IP-MS)。
实施例2-CSF中的tau蛋白上的磷酸化位点
与脑tau消化物相比，使用tau特异性抗体的CSF tau纯化和消化主要从蛋白序列的中部结构域(残基150-221)产生可检测的肽。从N末端可检测到肽的程度较低，并且从tau的微管结合重复序列(MTBR)结构域或C末端几乎检测不到序列(Barthélemy等人,2016；Sato等人,2018)。信号恢复的这种差异可能由tau在从神经元释放期间被截短所引起(Sato等人,2018)。使用当前的PRM方法，此中间结构域的肽回收足以监测对应的次要磷酸化同种型。相反，需要MS方法的显著技术进步来检测MTBR和C末端结构域中的磷酸化肽。
来自正常对照CSF的tau磷酸肽的PRM筛选鉴定出在T181(未示出)、S199、S202和T217处的与脑可溶性tau共有的几个磷酸化位点(图9)。还检测到对应于pS214的低信号(图9)。在CSF提取物中鉴定出对应于pT205的特异性片段化模式，并且通过色谱法将其与pS199/pS202信号分离(图9)。
为了增加在CSF tau中检测到额外磷酸化位点的可能性，分析患有轻度至中度痴呆的AD患者的CSF池。预期AD CSF池将含有增加浓度的tau以及增加水平的磷酸化tau。在ADCSF中检测到正常CSF中发现的相同磷酸化残基(T181、S199、S202、T217和T231)。另外，在ADCSF中检测到对应于先前在脑中tau中发现但在正常CSF中未发现的pS113和pT175的信号(图9，图10)。含有特异性片段的LC-MS/MS模式和与S202/S199磷酸化肽不同的保留时间允许鉴定出在S208处新的磷酸化肽。当在正常CSF中重新检查pS208时，检测到低丰度的对应信号。检测到与残基T153处新的磷酸化肽匹配的LC-MS/MS模式，其接近于对应的未磷酸化肽的水平(图10)。对脑提取物数据的仔细再检查表明存在对应于此位点的低丰度信号。最后，发现对应于来自AD CSF中的0N同种型的103-126个氨基酸序列上的磷酸化的特异性信号，这表明T111作为此肽上的主要磷酸化位点，而S113几乎未被磷酸化(图11)。总之，在CSFtau中检测到12个磷酸化位点，其中两个位点在脑裂解物中检测不到(图12)。
实施例3-CSF p-tau丰度测量突显与脑中的p-tau丰度相比的差异
在脑中，S404是所检查的磷酸化位点中磷酸化程度最高的(pS404/S404＝110％，即52％的S404被磷酸化)。因此，与S202和T181处的其他高度磷酸化位点相比(分别为9.7％和9.5％)，超过一半的脑tau在S404处被磷酸化。1.3％的S199被磷酸化，但是这可能因为用于提取的Tau1抗体无法结合其对应的磷酸化表位而被低估(Liu等人,1993)。发现除S404之外的C末端位点上的磷酸化为约1％。在N末端，T52、S68/T69、T50和S113也被磷酸化，其丰度范围为约0.5％至2％。其他检测到的位点似乎以低得多的水平被磷酸化(<0.5％)。
除了在CSF tau中而不是脑中独特检测到pT205和pS208之外，与对照CSF tau相比，在脑tau中检测到的某些其他磷酸化位点的相对磷酸化丰度发生改变(图13)。与脑相比，CSF tau磷酸化在位点pS199(降低6倍，p＝0.008)处、pS202(降低5倍，p＝0.016)处和pS214(降低2倍，p＝0.016)处显著降低。相反，CSF tau磷酸化在0N的位点pT217(增加4倍，p＝0.016)处、pT231(增加7倍，p＝0.016)处和pT111(增加16倍)处明显更高。CSF和脑中的PT181丰度是相似的(约10％)。当在AD CSF中测量时，pT175保持较低(0.1-0.2％，相比之下在脑中为0.1％)。
脑和CSF tau具有不同的截短模式：脑tau同种型主要是全长，而CSF tau同种型被截短。在IP之后回收的脑和CSF tau同种型以及对应的肽取决于用于免疫沉淀的抗体(Sato等人,2018)。类似地，用于使tau免疫沉淀的抗体可能会影响tau磷酸化回收。为了评估这种对p-tau回收的影响，使用不同抗体(Tau13、HJ8.5、HJ8.7、Tau1和Tau5)以及Tau1+HJ8.5组合来比较IP-MS对磷酸化率的结果(图14)。当在脑和CSF中使用Tau1或Tau1+HJ8.5时，观察到pS199/S199比率的显著降低。这表明与脑相比，N末端与中间结构域之间的CSF截短可能会影响pS199磷酸化测量。用其他抗体在脑和CSF中测量的PS199/S199比率似乎是相对类似的。有趣的是，尽管在报告的Tau1表位的末端存在S199磷酸化(192-199)，但仍在脑提取物中观察到pS199的一些反应性并且在CSF中程度较低，这表明Tau1的非特异性结合。
由于在尸检之前的死亡时间(PMI)期间磷酸酶活性可以降低脑提取物中测量的tau磷酸化，因此研究了PMI对通常在CSF和脑提取物中发现的磷酸化率的影响。分析从PMI范围为5至16小时的参与者收集的无tau病理的10份脑样品(额中回)。最初分析的脑提取物的PMI都不大于16小时。未发现PMI与在T181、S199、S202、S214、T217、T231和S404位点上测量的磷酸化率之间的显著关联(Spearman检验，95％置信区间，未示出)。
实施例4-CSF中的AD特异性p-tau变化
通常在AD中报告的CSF p-tau增加可能是两个潜在作用的结果：1)tau的整体增加，无论其磷酸化状态如何，或2)在特异性位点处的超磷酸化增加。使用非磷酸化tau对p-tau信号或水平进行归一化允许对发生在特异性位点处的磷酸化化学计量的变化(即与正常CSF或脑tau相比超磷酸化或低磷酸化)进行定量，而与总tau的整体变化无关。正如最近所证明的，AD中可溶性tau产量增加，并且与淀粉样蛋白斑块相关。因此，对量以及磷酸化率的控制是理解的关键。pT181、pT217、pT231、pT205、pS208和pS214与0N特异性pT111一样在AD CSF中被超磷酸化(图13)。pT153和pT175在非AD中未检测到，并且在AD中可能略有增加。与非AD相比显示出显著超磷酸化的位点是pT181(p＝0.010)、pS214(p＝0.005)和pT217(p＝0.003)。pT181、pS214和pT217分别显示出磷酸化的约1.2倍、1.6倍和4倍增加。有趣的是，并非所有监测位点都被超磷酸化：pS199/S199没有显著变化，并且pS202/S202显著降低(p＝0.030)，其降低约1.2倍。
通过将CSF孵育16小时来评定磷酸化比率的稳健性。孵育没有显著影响在非AD与AD CSF之间观察到的tau磷酸化比率差异(图15)。此外，在孵育后掺入CSF中的重组15N-tau上磷酸化的不可检测性证实CSF tau缺乏激酶活性(未示出)。
实施例1-4的讨论
关于p-tau测量的PRM的技术进步-报告了迄今为止对正常脑组织和CSF中p-tau的最全面的定性和定量分析。我们的方法与之前关于tau磷酸化的DDA研究相反，后者不能捕获潜在的次要磷酸化位点。但是，我们的方法在PRM模式下使用高度敏感的靶向MS来检测并定量次要磷酸化。磷酸化位点鉴定出取决于对LC-MS/MS模式的仔细人工解释，以鉴定每个检查的磷酸肽的特异性离子片段的共洗脱。在先前的研究中，主要在富含来自PHF的超磷酸化tau的不溶性提取物中研究脑tau磷酸化，并且迄今为止，最详细的研究已报告了正常人tau蛋白中的9个磷酸化位点(Hanger等人2007)。深入的PRM数据分析检测到超过29个磷酸化残基，其中大多数磷酸化残基的丰度很低。实际上，先前报告的9个位点是蛋白质中最丰富的修饰。将PRM分析应用于与脑相比以低得多的丰度存在的正常CSF tau，导致最初检测到9个磷酸化位点，在AD CSF中检测到3个额外位点。
除了检测到的磷酸化位点数目显著增加之外，证明了灵敏的PRM筛选如何使得能够定量地评定tau磷酸化率或化学计量，而与整体tau浓度无关。当绝对CSF p-tau浓度可仅由于整体tau同种型浓度增加而增加且不是由于相对磷酸化tau丰度的变化而增加时，此概念经常被忽略，但对于评定AD的变化是至关重要的。此研究中的磷酸化率测量首次使得能够比较在不同区室(脑细胞内对比细胞外CSF)和不同病理条件(AD对比非AD)中跨越蛋白质的磷酸化率变化(超磷酸化对比低磷酸化)的程度和分布。
PRM筛选过程的一些警告是发现的低通量以及缺失此研究中未假设的p-tau种类或其他翻译后修饰(PTM)的风险。来自MS数据的鉴定可进一步用于较大的验证或临床群组中，以设计预定的LC-MS方法，从而提高复用和通量(Gillette和Carr,2013)。其他蛋白酶诸如AspN可以提供与来自胰蛋白酶消化物的tau和p-tau肽不同的一组tau和p-tau肽，从而允许更好地覆盖tau，即C-末端结构域(Hanger等人1998；Sato等人2018)。可以通过筛选此研究中未考虑的额外双磷酸化或三磷酸化tau肽来进一步改进搜索，尽管他们的丰度可能是最小的，除非存在位点磷酸化的生物配位。
鉴定出tau投射结构域上的磷酸化位点簇-在含有选择性剪接依赖性肽的tau的N末端投射结构域上发现了先前未描述的磷酸化残基簇。有趣的是，先前未发现此结构域在不溶性人脑部分的PHF中被广泛磷酸化(Funk等人,2014；Hanger等人,2007；Russell等人,2016；Thomas等人,2012)。在最近对鼠脑中的小鼠tau蛋白进行的综合研究中也没有广泛地表征此簇(Morris等人,2015)。这些差异可以归因于难以表征磷酸化肽的复杂混合物，仅通过少量特异性MS/MS片段和/或在LC上的微小保留时间偏移即可区分。例如，S46是先前在正常人tau的此结构域中报告的唯一磷酸化位点(Hanger等人1998)。但是，没有检测到此种类的特异性信号，所述信号可以因搜索算法与T50或T52处相邻的磷酸化位点混淆，从而共享紧密的片段化模式。在这方面，人工检查对于清楚地解释并破译每个磷酸化位点的对应LC-MS/MS模式是至关重要的。这种差异的另一种可能的解释可能是与MTBR结构域、中间结构域和C末端相比，PHF中N末端结构域的丰度相对更低(Mair等人,2016)。
此N末端投射结构域最近作为排斥性屏障的主要组分的一部分被分配，所述排斥性屏障防止相邻微管(通过MTBR结构域与tau缔合)彼此靠近(Chung等人,2016)。此序列含有许多酸性残基，并且磷酸化的增加可有助于增加整体酸性，从而增强排斥性屏障。与可变量的通过外显子2-3上的选择性剪接诱导的N末端延伸一起，tau磷酸化可调节tau/tau N末端相互作用和微管分子间距离。
脑对比CSF的不同p-tau概况的生物学意义-Tau主要是在微管稳定性方面起作用的细胞内蛋白，并且在传统上被认为仅在神经损伤或细胞死亡时才释放到细胞外。但是，最近的研究表明，tau在生理和病理条件下以受调节的方式分泌(Karch等人2012；Yamada等人2014)。通过将可溶性脑tau和CSF tau概况与神经元模型中的细胞内和细胞外tau概况和代谢平行比较，最近已显示tau分泌是涉及tau同种型(包括截短的tau和p-tau)的不同周转率的主动过程(Sato等人,2018)。通过比较脑和CSF p-tau概况来了解tau的这种主动分泌与磷酸化之间的关联性，可提供对AD发病机理的潜在见解。
据推测，CSF中富含的p-tau同种型对微管的亲和力较小，并且分泌的可能性较高。相反，CSF中缺乏的p-tau同种型可能更倾向于留在神经元内部和/或避免裂解。结果表明，与脑提取物相比，CSF中显著富含若干个磷酸化残基，例如T217、T231、T153和T111。所有残基都是脯氨酸定向的位点，是GSK-3β蛋白激酶的潜在底物，并且可进行激酶依赖性调节。与pT217不同，pS214在CSF中与在脑中相比并未升高。pT217超出pS214的这种细胞外富集与先前在细胞内针对这些同种型鉴定的动力学差异一致(Sato等人,2018)，其中pT217的周转率比未磷酸化tau和tau-pS214更短。或者，在脑提取物中与CSF相比某些tau位点上观察到的磷酸化降低也可能由PMI期间发生的部分去磷酸化所致(Matsuo等人,1994)。尽管在5-16小时PMI范围内未观察到这种降低，但不能排除死亡与此研究间隔之间的磷酸化比率的改变。通过质谱评定脑活检物中这些tau位点的去磷酸化的动力学，将有助于解决此现象对后续CSF/脑比较结果的影响。考虑到影响脑tau磷酸化测量的潜在脑磷酸酶偏差，将支持CSFtau磷酸化状态在神经元中比在死后收集的脑提取物中更可能反映体内tau磷酸化状态。但是，CSF中监测的体内tau磷酸化将局限于由于CSF tau截短而主要在tau中间结构域中检测到的位点。
相反，pS202在CSF中显著降低，并且pS199和pS202在AD中没有升高，这表明这些磷酸化可促进神经元内的tau汇集。T181在CSF和脑中等同被磷酸化。pT205和pS208仅在CSFtau中检测到，并且在脑中的可溶性tau蛋白中未检测到。考虑到S202、T205和S208处的三重磷酸化被常用于表征脑中tau聚集的Braak阶段(Braak和Braak,1995)的抗AT8抗体(Malia等人,2016)识别，这是令人感兴趣的。实际上，pS208在PHF中通过MS检测到(Hanger等人1998)。在研究中，pT205和pS208不存在于正常可溶性脑tau中，这证实不可能检测到正常脑tau中的AT8的免疫反应性。此外，最近的研究表明pT205和pS208作为组合的磷酸化模式，与pS202一起导致tau自聚集(Despres等人,2017)。pT205和pS208仅存在于CSF中并且AD中两个位点的磷酸化率进一步增加可能指示神经元从细胞中去除这些病理倾向的p-tau种类的潜在保护性清除机制。AD CSF中pS202的同时降低也可对应于当与AD脑中富集的AT8阳性缠结中的pT205和pS208聚集时相关同种型的汇集增加。可替代地，在脑提取物中的pT205和pS208上不存在磷酸化，可由PMI期间发生的磷酸酶对其特异性降解所引起。从脑活检物中收集到的tau上报告的AT8反应性的快速消失(<3小时)支持了这一想法(Matsuo等人,1994)。因此，有效靶向pT205和pS208的此类磷酸酶活性也可以看作预防AT8阳性物质在神经元中的长半衰期的另一种机制。在AD CSF中发现的pT205和pS208增加将表明此保护机制的潜在病理学降低。最后，AD CSF中pS202的同时降低也可对应于当与AD脑中富集的AT8阳性缠结中的pT205和pS208聚集时相关同种型的汇集增加。
不能令人信服地检测来自正常脑的可溶性部分中的MTBR结构域的磷酸化残基。据称MTBR结构域上的磷酸化位点降低tau对微管的亲和力(Biernat等人,1993)。在正常tau中不存在此类磷酸化，可支持在PHF中发现的这些修饰的异常(Hanger等人2007)。CSF tau截短限制了对体内磷酸化变化的检查，因为在tau截短后MTBR结构域可在细胞内降解(Kanmert等人,2015)，并且因此通过此研究中所用的免疫捕获方法不能回收。
作为AD生物标志物的CSF p-tau比率-除了检测到的磷酸化位点数目显著增加之外，还证明可以如何对tau磷酸化比率或化学计量进行定量，而与整体tau浓度无关。当绝对CSF p-tau浓度可仅由于总tau浓度增加(即pT181)而增加且不是由于相对磷酸化比率本身增加而增加时，此概念经常被忽略，但对于评定AD中CSF tau磷酸化变化是至关重要的。此研究中的磷酸化率测量首次使得能够比较在不同区室(脑细胞内对比细胞外CSF)和不同病理条件(AD对比非AD)中跨越蛋白质的磷酸化率变化(超磷酸化对比低磷酸化)的程度和分布。如最近使用免疫化学所进行的(Neddens等人2018)，此方法可在未来用于跨越观察脑区域和Braak阶段中的多个位点上的AD脑磷酸化的修饰。
在此研究中，证明与非AD CSF相比，AD CSF中的tau通常被超磷酸化。但是，超磷酸化的程度取决于位点。T111、T205、S208和T217的超磷酸化程度高于T181，所述T181是用作AD的p-tau生物标志物的最常测量的靶标(Fagan等人2009)。还鉴定出仅在AD CSF中发现的T153磷酸化。有趣的是，在AD CSF中发现的超磷酸化的位点对应于与脑相比，在正常CSF中已显著增加的位点(即，T111、T205、S208和T217，以及程度较低时为T231)。这将表明AD病理学加剧在tau释放到CSF中期间有助于特异性p-tau同种型富集的细胞机制。总之，在这些位点上发现的巨大变化使得可以设想将其用作检测AD的敏感生物标志物。研究依赖于有限数目的CSF池，并且未来对较大CSF群组的研究将更好地建立p-tau变化和脑淀粉样变性与疾病进程中的tau聚集之间的潜在关系。还可以询问在其他非AD tau蛋白病(例如PSP、CBD和FTD)中是否存在任何特异性p-tau概况变化。可替代地，此方法可用于追踪体内和体外的不同激酶活性，并且还可提供评定靶向异常tau代谢的新药的有前途的工具。
实施例1-4的方法
脑可溶性tau提取-涉及参与者的脑和CSF研究由华盛顿大学人类研究委员会(Washington University Human Studies Committee)和综合临床研究中心(GeneralClinical Research Center)批准。在纳入研究之前，已从所有参与者获得书面知情同意。如先前所述(Sato等人,2018)提取脑可溶性tau。简言之，如先前所述(Sato等人,2018)来自不具有淀粉样蛋白和tau病理的对照的冷冻人脑组织获自华盛顿大学医学院(WashingtonUniversity School of Medicine，St.Louis,MO)的奈特阿尔茨海默氏病研究中心(KnightAlzheimer’s Disease Research Center，ADRC)。如文献报告(Hanger等人1998)，通过超速离心从推定的tau聚集物中分离出Sarkosyl可溶性tau并合并。将冷冻的人脑(200-400mg，额叶区域)在冰上在Tris-HCl缓冲液(25mM Tris-HCl、150mM NaCl、10mM EDTA、10mM EGTA、1mM DTT、磷酸酶抑制剂混合物3、Roche蛋白酶抑制剂、pH7.4、最终3.25mL/mg组织)中均质化。将均质物在4℃下以11,000xg离心60分钟。将上清液溶于1％Sarkosyl中60min，并以100,000xg离心2小时。将Sarkosyl可溶性级分合并，并在免疫沉淀之前用0.5％人血浆将50uL级分稀释10倍。为了进行脑/CSF比较，在免疫纯化之前将脑裂解液池稀释500到8000倍，以匹配CSF tau水平。
CSF tau提取-将来自80名参与者群组的人CSF合并，所述参与者包括淀粉样蛋白阴性且认知正常(CDR＝0)对照(n＝47，年龄60+)和淀粉样蛋白阳性且CDR>0的AD患者(n＝33，年龄60岁+)。分别从对照组和AD组产生500uLCSF等分试样的五个和七个池。在初始收集时，将CSF以1,000xg离心10min以去除细胞碎片，并立即在-80℃下冷冻。在实验期间添加蛋白酶抑制剂混合物。如先前所述，使tau免疫沉淀并且将其脱盐处理，并做了一些修改(Sato等人,2018)。简言之，将CNBr活化的琼脂糖珠(GE Healthcare 17-0430-01)分别与抗体Tau1和HJ8.5交联，其浓度为每克珠3mg抗体。在每mL样品的每个目标序列中，在样品中掺入对应于10fmol磷酸化tau和100fmol非磷酸化tau的AQUA肽(ThermoFisher Scientific)。使用这些内部标准物计算Tau和p-tau浓度。在洗涤剂(1％NP-40)、离液试剂(5mM胍)和蛋白酶抑制剂(Roche完全蛋白酶抑制剂混合物)中使可溶性tau免疫沉淀。将与琼脂糖珠缀合的抗Tau1和HJ8.5抗体分别在灭活的琼脂糖珠中稀释10倍和5倍，并且在室温下将30uL的50％抗体珠浆液与溶液一起旋转90min。将珠在25mM三乙基碳酸氢铵缓冲液(TEABC,Fluka 17902)中洗涤三次。将结合的tau在37℃下在珠上用400ng MS级胰蛋白酶(Promega,V5111)消化16小时。根据制造商的说明，将消化物加载到TopTip C18(Glygen,TT2C18.96)，将其脱盐并洗脱。通过真空离心(CentriVap Concentrator Labconco)干燥洗脱的肽，并且将其重悬浮于25uL的2％乙腈和0.1％甲酸在MS级水中的溶液中。
质谱法-将5uL肽重悬浮液的等分试样注入到nano-AcquityLC中以进行MS分析。nano-Acquity LC(Waters Corporation,Milford,MA)装备有HSS T3 75umx100um，1.8um柱，并且使用0.5uL/min流速的溶液A和B梯度来分离肽。溶液A由MS级水中的0.1％甲酸组成，并且溶液B由乙腈中的0.1％甲酸组成。在28分钟内使用2％至20％梯度的溶液B，然后再使用20％至40％溶液B持续13分钟来从柱上洗脱肽，然后再在3分钟内斜升至85％的溶液B来清洗柱。Orbitrap Fusion Lumos配备有Nanospray Flex电喷雾离子源(Thermo FisherScientific,San Jose,CA)。靶向从10um SilicaTip发射器(New Objective,Woburn,Ma)喷射到离子源的肽离子并在四极杆中分离。然后通过HCD使这些肽离子片段化，并在轨道阱中检测到离子片段(分辨率为60,000，质量范围为150-1200m/z)。在HSS T3 300umx100um、1.8mm柱上以4ul/min流速对亲水性肽(SSRcalc<9，全部不含亮氨酸)监测肽概况分析，其中用2％至12％溶液B梯度进行洗脱并在30mm SilicaTip发射器上进行喷雾操作。
用于p-tau肽发现的PRM原理-通过消化富含Tau的生物提取物(例如人脑可溶性级分)中的蛋白质产生含有假定的磷酸化位点的tau肽。通过靶向MS分析使用四极杆轨道阱仪器(例如Thermo Fisher Orbitrap Lumos)来筛选这些肽。对于每个磷酸化肽，在计算机上进行靶向MS参数诸如前体质量、碰撞能量或预期保留时间的选择，并使用对样品中丰度高得多的对应未修饰肽测量的生物物理特性进行精选。为了检测到磷酸化肽，设置四极杆以选择包括假定的前体质量的质量窗口。前体碰撞后，在色谱洗脱过程中，在轨道阱中同时测量所有生成的片段。可以在生成数据的后分析中搜索潜在磷酸化肽。使用Skyline软件(MacCoss Lab,University of Washington,WA)提取LC-MS/MS数据。筛选的假定肽被检测为LC-MS/MS指纹，其由从预测的MS/MS片段中提取的质量的严格共洗脱构成(图2)。PRM方法相对于传统DDA或靶向MS方法的优点在于其能够以可能的最高灵敏度配置使用MS仪器并保存发现能力。
在筛选期间四极杆轨道阱仪器的最大灵敏度对于检测次要离子片段是至关重要的，并有利于鉴定磷酸化肽并定位磷酸化位点。PRM测量的灵敏度主要取决于从目标靶标转移到轨道阱分析仪中的离子数目。通过增加用于获得一次MS/HRMS扫描的填充时间来提高此数目。填充时间对应于将靶向前体质量从离子束累积到离子阱设备中所花费的时间。然后将累积的前体片段化，并将产物片段转移到轨道阱中进行分析。因此，将填充时间设置为最大，这受限于需要足够的MS扫描速率以获得足够的数据点来描述色谱信号(即每个色谱峰8-15次扫描)。对每个研究的磷酸化肽进行PRM筛选的填充时间通常设定为1秒。
填充时间也受限于阱饱和风险。当在同一扫描内对太多离子进行采样并将其转移到轨道阱时，会发生这种情况，从而由于空间电荷效应而导致不准确的质量测量。为了避免这种饱和，选择窄的前体分离(0.7Da)以及在基质上富集靶标的适当样品纯化(免疫纯化)，以降低潜在的近等压干扰的影响。
PRM发现实验的特异性取决于LC-Q轨道阱系统的分辨能力。分辨能力可以通过不同的分析参数来提高，其最终目的是获得靶向肽的无干扰LC-MS/MS指纹。这限制了由假阳性信号引起的模糊片段分配的风险。优先富集p-tau的样品纯化还可以改善发现次要磷酸化tau肽的特异性。高色谱峰容量和分辨率限制了共洗脱的可能性。如上文所述，前体的窄四极杆分离窗降低了对MS/MS谱图干扰的可能性，并限制了阱饱和的风险。高轨道阱分辨率和分析器校准允许在数据处理期间准确提取质量片段，从而限制过渡干扰的风险(Gallien等人,2012；Peterson等人,2012)。轨道阱分辨率(60k)的选择是在需要更多采集时间的高分辨率和与色谱采集兼容的合理扫描速率之间的平衡。
定量评定tau的位点特异性磷酸化率-为了定量评定来自脑和CSF的tau中的特异性位点的磷酸化的相对丰度，测量所检测的每个位点上的磷酸化程度。为此，使用三种方法：1)磷酸化肽异构体之间的相对比较：使用过渡离子的信号比较来鉴定每个磷酸化位点。这可以估计共享相同序列的每个磷酸化肽的相对丰度。2)将磷酸化肽以非磷酸化肽作为参考进行归一化：将每个磷酸化肽特有的LC-MS/MS跃迁与非磷酸化肽的对应跃迁进行比较。可以在整个蛋白质序列中比较获得的每个磷酸化位点比率。此策略可能因非磷酸化肽与磷酸化肽之间的片段化效率差异而产生偏差。当磷酸化位点是胰蛋白酶漏切割的一部分时，不能使用此方法。3)使用内部合成标记标准品(例如AQUA)对每种磷酸化肽和非磷酸化肽进行绝对定量：来自磷酸化和非磷酸化标准品的信号用于定义内部比率。此策略考虑了每个比较的肽的片段特异性，但是需要为每个监测种类合成肽。
在此研究中，除了包括漏胰蛋白酶切割的那些之外，使用第二种方法来计算磷酸化率。当合成的磷酸化肽可用(即T175、T181、S199、S202、T205、T217和T231)并仅在脑中发现一个位点(S404)(表1)时，还对脑和CSF提取物中发现的有限磷酸化位点应用第三种方法(AQUA归一化)。对于AQUA测量，将脑提取物稀释500到8000倍以与CSF tau水平相当。这种稀释使基质效应最小化，这种效应可能由脑中AQUA内部标准物与tau肽水平的比率显著不同于CSF所引起。第一种方法用于初步解释来自含有大量磷酸化残基的p-tau序列的复杂LC-MS/MS模式。
统计学-除非另有说明，否则数据表示为平均值±SD。在确认数据的正态分布后，进行单向ANOVA，然后进行事后分析(Tukey检验)，以比较tau磷酸化率。使用GraphPadSoftware Inc.的GraphPad版本8.0.1(244)完成其他统计分析。使用双尾非配对Mann-Whitney t检验确定相关组之间的统计学显著性。在0.01和0.05水平下评估显著性。
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实施例5：脑淀粉样蛋白病理与tau超磷酸化中的位点特异性差异相关联
皮质PiB-PET的标准摄取值比率(SUVR)可靠地鉴定出显著的皮质Aβ斑块，并用于将受试者分类为PIB阳性(淀粉样蛋白+，SUVR≥1.25)或阴性(淀粉样蛋白-，SUVR＜1.25)。为了探索淀粉样蛋白斑块与可溶性tau种类之间的关系，比较了皮质PiB-PET的SUVR与CSF总tau和多个位点处的CSF tau磷酸化(即，tau的磷酸化位点与未磷酸化位点的比率)。(图16A)Thr217处的tau磷酸化(p-T217)具有97.2％曲线下面积(AUC)(95％置信区间(CI)为0.94、0.99)；Thr181处的tau磷酸化(p-T181)具有89.1％AUC(CI 0.83、0.94)；Thr205处的tau磷酸化(p-T205)具有74.5％AUC(CI 0.69、0.82)；总tau具有72％AUC(CI 0.65、0.79)，以将突变携带者(MC)分类为患有皮质Aβ斑块(即淀粉样蛋白+)。这些数据表明，在显著原纤维Aβ阳性斑块的早期阶段，磷酸化的增加已经在及时连接这两个过程的特异性位点处开始。这些数据还表明，T217的磷酸化与未磷酸化比率的增加可以充当原纤维Aβ斑块病理的灵敏诊断标记物。
然后，通过PiB-PET SUVR四分位数比较四个磷酸化位点的平均标准化磷酸化比率和总tau水平，以探索总Aβ斑块负荷与磷酸化之间的关系，图16B。除Ser202(p-S202)外，所有磷酸化位点均表现出磷酸化增加和更大Aβ斑块病理。还发现其他三个位点之间的差异。p-T217和p-T181一旦斑块开始就显示出最大的增加(四分位数2-3)，但这些增加的幅度随着斑块负荷的增加而减小；相反，p-T205处的磷酸化和总tau水平的增加与Aβ斑块一起继续增长。这些结果表明，最初导致AD中的tau磷酸化增加的事件可能与Aβ斑块病理相关，可能通过调节磷酸化位点特异性的不同激酶和磷酸酶来进行。此外，数据表明p-T217可以充当原纤维Aβ斑块病理的替代生物标志物，从而鉴定Aβ相关tau加工的潜在独特特征。重要的是，在突变非携带者(NC)中，仅有显示T217处的磷酸化增加的参与者是PiB+的那些(SUVR>1.25，n＝4)。
接下来，通过探索特异性tau磷酸化位点与淀粉样蛋白斑块沉积的皮质和皮质下区域之间的相关性来评定位点特异性tau磷酸化是否与脑Aβ斑块病理的解剖学分布相关，如通过PiB-PET SUVR测量的，图16C。T217、T181和T205处的磷酸化与整个脑中的Aβ斑块呈正相关，而S202处的磷酸化呈负相关。在楔前叶(早期淀粉样蛋白斑块沉积的区域)中，基于控制年龄、性别和距症状发作的估计年数(EYO)的二元回归的强度比较与tau同种型的相关性，并进行调整以用于多重比较。发现与Aβ斑块具有正相关性的p-T217(β＝0.68，p<10
实施例6：疾病阶段和进展与tau超磷酸化的位点特异性差异和纵向变化率相关联
疾病发作的确定性和DIAD的症状发作的可预测性使得能够基于EYO对个体进行分期
实施例7：疾病进展的神经成像标志物与tau超磷酸化的位点特异性差异相关联
除了使用家族史(EYO)估计症状的发作之外，还可以使用跟踪疾病进展的各个组成(例如脑萎缩和代谢下降)的神经成像测量来估计DIAD中的疾病进展。这些测量已显示出在症状发作前的不同时间段会发生变化，在症状发作前发生脑代谢下降(通过[F18]氟脱氧葡萄糖[FDG]-PET测量)长达18年并发生大脑萎缩(通过MRI确定)高达13年
MRI-超磷酸化与无症状MC中的皮质厚度成反向关联：p-T205与脑中皮质和皮质下厚度的减小最强相关联，图18A，而p-T217和总tau水平显示出更少的区域关联性和较弱的相关性。p-T181处的超磷酸化与皮质萎缩的总体相关性最低，限于内侧和外侧顶叶以及内侧背-内侧额叶。这表明p-T205在-13 EYO时的初始升高可能与皮质萎缩的潜在病因相关，先前已经证明这在楔前叶中在约-13 EYO时开始
FDGPET-除皮质萎缩外，神经元和神经胶质中葡萄糖代谢的下降与AD中的疾病进展相关联。因此，测试了在皮质或皮质下代谢损伤与tau磷酸化之间是否存在明显的关联性。在无症状MC中，T205处的磷酸化与整个皮质和皮质下区域中的葡萄糖低代谢相关，如通过FDG-PET测量的，图18B。在无症状MC中，对于其他p-tau位点或总tau水平鉴定了最小的关联性。
总之，这些结果表明，如通过神经成像所测量的，在无症状疾病进展期间导致神经元损伤和神经变性的潜在过程与p-T205最密切相关。最近的研究已鉴定出p-T205在通过fyn激酶途径响应于Aβ诱导的突触后细胞毒性
实施例8-认知下降与tau超磷酸化中的位点特异性差异特异性和差异性地相关联
先前的研究表明，AD痴呆与新皮质NFT病理的相关性比新皮层Aβ病理更紧密
随着T217和T181的磷酸化比率减小，认知下降加速(t值2.35，p＝0.02和2.11，p＝0.04)，表3和图19。这表明T217和T181的磷酸化减少，而不是可溶性tau增加，代表认知下降的重要标志。
这些发现挑战了当前的范例，即CSF p-tau的持续升高与认知功能障碍相关联。在此工作中，发现两种一般模式：对于一些位点，磷酸化随着认知下降的开始而显著减少，而其他位点则随着疾病进展而显示出持续增加或没有变化(参见图19中的增加对比降低比率)。此外，疾病进展的其他标志物(Aβ斑块、脑萎缩和代谢)与鉴定的总tau水平和不同位点的磷酸化之间的关联性进一步强调，导致AD中的tau磷酸化的过程可能是多因素的并且是不等同的。
实施例9-未磷酸化tau的增加与通过tau PET得到的皮质NFT相关，但典型的磷酸-tau种类则并不相关
最近对DIAD参与者的tau-PET(
首先，证实MC中的皮质NFT水平仅在接近症状发作时增加，图20，这表明在DIADMC中，当tau聚集体开始增加时，临床下降开始。其次，发现CSF未磷酸化tau的纵向增加与皮质tau-PET(p＝0.03)值升高相关，表4。存在T205磷酸化的增加与较高水平的tau-PET相关联的趋势，并且相反，T217、T181和S202的磷酸化减少与tau-PET水平增加相关联，图21。总之，这些发现表明，CSF中非磷酸化tau的增加，而不是p-tau，与NFT病理的扩散更密切相关。相比之下，当聚集的tau增加时，可溶性p-tau种类减少，这可代表超磷酸化聚集体的汇集过程。
表2.突变携带者和非携带者的人口统计学、脑脊液、神经成像和认知测量。
表3由突变携带者中磷酸化tau位点和总tau水平的纵向变化预测的整体认知的纵向变化。
表4预测在随访脑脊液检查时进行Tau-PET扫描的每个个体的磷酸化比率和总tau的纵向变化(n＝14(10个突变携带者、4个非携带者)，所述随访脑脊液检查用来预测皮质tau标准化单位值比率(SUVR)。此表指示，在此有限群体中tau-PET增加的唯一预测因子是CSF中可溶性tau的水平增加，其中36ng/ml的增加与1单位皮质SUVR的增加相关联。
对实施例5-9的讨论
尽管tau包含标志性AD病理并且可以聚集或可溶形式测量，但是在对这种关键神经元蛋白的翻译后修饰如何在人类中导致NFT
尽管在未来的研究中需要解决因果关系，但是p-T217、p-T181和PiB-PET的同期增加表明，AD中tau水平的广泛磷酸化与Aβ病理学密切相关。此假设与AD转基因小鼠
最近的工作已显示，在Aβ转基因小鼠中由来自AD脑的NFT分离物诱导的神经炎性tau聚集体(营养不良性神经突中的成对螺旋丝)的增加和扩散，其在建立的体细胞NFT之前就已经发生
关于可溶性tau和p-tau的诊断作用的一些常见假设在此受到质疑。具体而言，AD中的当前诊断框架强调存在代表AD特异性和非特异性病理的生物标志物(例如Aβ、p-tau和tau)
鉴于激酶在tau磷酸化中的作用，这组酶目前被视为AD治疗的潜在靶标
总之，现在已经证明，在与常染色体显性突变相关联的AD中，CSF tau超磷酸化发生得非常早并且在疾病的不同阶段表现出位点特异性变化的模式。这些发现背后的潜在机制将对理解所述疾病以及AD的tau导向疗法具有重要意义。
实施例5-9的材料和方法
参与者-将具有至少50％从在PSEN1、PSEN2或APP中具有确认的遗传突变的家族中遗传DIAD突变的风险的参与者纳入显性遗传的阿尔茨海默氏症网络研究(DIAN，NIAU19AG032438)(dian.wustl.edu；clinicaltrials.gov编号NCT00869817)
距症状发作的估计年数(EYO)-在显性遗传的AD中，外显率接近100％，突变携带者在症状发作的年龄对于每个突变并且在每个家族中是相对一致的。这允许指定距症状发作的估计年数(EYO)。EYO定义如下：通过半结构化面谈为每个参与者确定最早症状发作时的父母年龄。然后将每个突变发作时的父母年龄输入数据库，所述数据库由来自DIAN以及来自DIAD群组的先前出版物的合并症状发作值组成。将这些用于计算每种突变特有的平均发作年龄
临床评定-对每个参与者进行标准化临床评估，包括使用研究伙伴。临床痴呆评定量表(CDR)用于指示痴呆阶段。参与者被评定为认知正常(CDR＝0)或患有非常轻度痴呆(CDR＝0·5)、轻度痴呆(CDR＝1)或中度痴呆(CDR＝2)
CSF Tau分析-使用无创Sprotte脊髓针(22Ga)通过标准腰穿程序(L4/L5)将CSF收集到两个13ml聚丙烯管中。将CSF在干冰上直立快速冷冻。将在美国收集的样品在干冰上过夜运输至美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学(Washington University,St.Louis,MO,USA)的DIAN生物标志物核心实验室，而在国际场所收集的样品则储存在-80℃下并每季度在干冰上运输。到达后，随后将每个样品解冻，将其合并到单个聚丙烯管中，并等分(每个500μl)到聚丙烯微量离心管(#05-538-69C,Corning Life Science,Corning,NY,USA)中，然后将它们在干冰上再次快速冷冻并储存在-80℃下。
将每个解冻的CSF样品与25μl溶液混合，所述溶液含有15N-441tau内部标准物(每个样品2.5ng)、50mM胍、10％NP-40和10X蛋白酶抑制剂混合物(Roche)。通过与Tau1(tau表位192-199)和HJ8.5(tau表位27-35)抗体交联的20μl琼脂糖珠在室温下旋转孵育2小时，通过免疫捕获提取Tau。通过离心将珠旋转，然后用1ml25mM TEABC冲洗3次。将样品在37℃下用400ng胰蛋白酶Gold(Promega,Madison,WI)消化过夜。掺入AQUA肽(Life Technologies,Carlsbad,CA)以在每个样品中获得每种标记的磷酸化肽5fmol和每种标记的未修饰肽50fmol的量。将肽混合物加载到TopTip C18尖端上，用0.1％甲酸(FA)溶液洗涤，并用60％ACN 0.1％FA溶液洗脱。将洗脱液用Speedvac干燥，并将干燥的样品在分析前储存在-80℃下。将样品重悬浮于25μl 2％ACN 0.1％FA中。通过nanoLC-MS/HRMS、使用平行反应监测、使用HCD片段化来分析提取物。使用与Fusion Tribrid质谱仪(Thermo Scientific,SanJose,California)联接的nanoAcquity UPLC系统(Waters,Mildford,Massachusetts)进行NanoLC-MS/MS实验。每个样品注入5μl。在Waters HSS T3柱(75μmx100mm，1.8μm)上在60℃在24分钟内完成肽分离。流动相为(A)水中的0.1％甲酸和(B)乙腈中的0.1％甲酸。所用梯度为：0min-0.5％B；7.5min-5％B；22min-18％B；然后将柱用95％B冲洗2分钟。将流速设置为700nl/min，进行7.5min，然后400nl/min用于其余分析。以正离子模式在2200V喷雾电压(Nanospray Flex Ion Source，Thermo Scientific)和设定在270℃下的离子迁移管下获得数据。将S透镜RF电压设定为60V。将MS/HRMS跃迁使用Skyline软件(华盛顿大学MacCoss实验室)提取。使用内源性未磷酸化肽与蛋白质内部标准物的15N标记肽的MS/HRMS跃迁之间的比率计算CSF tau磷酸化水平。使用磷酸化肽和对应未磷酸化肽的MS/HRMS跃迁的比率来测量T181、S202、T205和T217上的磷酸化比率。使用在对应AQUA磷酸化/非磷酸化肽内部标准物的MS/HRMS跃迁上测量的比率，将每个磷酸化/非磷酸化肽内源性比率进行归一化。
脑成像-分别使用
使用FreeSurfer软件(surfer.nmr.mgh.harvard.edu/)获得来自34个皮质和6个皮质下目标区域(ROI)的PIB和FDG SUVR。以灰色小脑作为参考区域来处理SUVR，并使用几何传递矩阵框架中的区域点扩散函数(RSF)
统计分析-将参与者的基线特征总结为连续变量的平均值±SD和分类变量的n(列百分比)。使用用于连续变量的通用线性混合效应模型(LME)和用于分类变量且具有逻辑联结(logistic link)的广义线性混合效应模型，获得用于比较无症状MC、有症状MC和基线时定义的NC之间差异的P值。所有模型都结合了随机家族效应，以说明同一家族内参与者之间的结果测量值的相关性。选择基线皮质PiB PET SUVR的切点，以使MC和NC之间皮质PiBPET的纵向变化率的差异首先开始不同以显著不同于0。
在所有无症状MC(CDR＝0，n＝152)中，在每个ROI上使用双变量LME评估不同tau磷酸化位点与PiB、FDG和皮质厚度/皮质下体积的横截面关系。这些模型包括EYO、教育、性别和家族层面的随机截距的固定效应。与简单的相关性估计方法(Pearson或Spearman相关性)相比，双变量LME可以针对协变量诸如EYO进行调整，并且考虑家族簇内的相关性
对于纵向随访中的个体内的年变化率，使用LME估计每个生物标志物的最佳线性无偏预测因子，然后将其相对于基线EYO作图以检查生物标志物轨迹。然后，在适当情况下，使用线性或线性样条混合效应模型来确定基线EYO点，从所述点，MC的基线水平和每个生物标志物的变化率变得与NC显著不同。线性样条混合效应模型的详情可以在最近的出版物中找到
为了使在EYO范围内的总tau、tau磷酸化位点、皮质PiB和整体认知之间的变化率差异可视化，首先使用NC的平均值和标准偏差对MC的测量值进行归一化。然后使用LME计算每个MC的每个测量值的变化率，并将LOESS曲线拟合以可视地表示在EYO内标准变化率的轨迹。
使用LME评估基线总tau和p-tau在预测纵向认知下降中的效用。模型中的固定效应包括突变组、基线年龄、性别、APOEε4状态、时间以及它们之间所有可能的双向或三向相互作用。模型中的随机效应包括家族簇的随机截距、个体随机截距和具有非结构化协方差矩阵的随机斜率。
使用线性回归来检查达到并包括进行tauPET时的点的MC和NC的tau和磷酸-tau位置的年变化率是否能够预测tau PET SUVR，从而控制年龄的影响。由于参与者数目有限，不包括家族簇。
所有分析均使用SAS9.4(SAS Institute Inc.,Cary,NC)进行。p值<0.05被认为具有统计学显著性。
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实施例10
阿尔茨海默氏病(AD)是全世界痴呆的主要原因。在缺乏特异性和早期生物标志物的情况下，其诊断和治疗仍然极具挑战性。脑脊液(CSF)生物标志物和脑正电子发射断层扫描(PET)成像的最新进展为检测淀粉样蛋白Aβ斑块和神经原纤维超磷酸化tau缠结的病理性AD脑病理提供了有价值的工具。当前，AD患者的CSF概况的特征在于通过标准免疫测定法测量的淀粉样蛋白β42(Aβ42)降低以及总tau和磷酸化tau(p-tau181)增加。此概况允许区分AD对比非AD病理并在认知症状或疾病之前多年检测AD过程。但是，CSF tau和p-tau的变化不是AD特有的。尽管p-tau181增加被解释为由缠结形成引起的超磷酸化的结果，但CSFp-tau与总tau同时增加。脑研究表明许多位点上的tau磷酸化，但是CSF中这些额外磷酸化位点的诊断相关性尚未得到充分解决。基于质谱(MS)的方法比免疫测定更相关，以独立于总tau水平来评定特异性位点的磷酸化水平变化，因为它们允许对磷酸化肽及其对应未修饰对应物进行单独定量。因此，可以比较磷酸肽和未磷酸化肽斜率之间的相关性以评估磷酸化率。为了对CSF中的磷酸化tau同种型进行定量，使用创新的靶向高分辨率MS(HRMS)方法，靶向蛋白质序列的中间结构域中的tau磷酸化肽，所述中间结构域是CSF中最丰富的结构域，并且在脑tau和AD tau聚集体中的许多位点上被磷酸化。
基于CSF Aβ42/40比率和PET-PIB成像，使用包括认知正常个体和患有通过淀粉样蛋白状态分层的轻度认知损害的患者的群组分析CSF中T181、S199、S202、T205和T217上的tau磷酸化。此验证使得能够突显CSF pT217用于AD诊断的潜力，并建立pT217与在疾病早期tau修饰潜在的淀粉样变性之间的相关性
参与者–八十六名认知正常(CDR＝0)或具有轻度认知损害的参与者从Patterson等人2015先前报告的使用可用CSF和淀粉样蛋白PiB-PET数据的华盛顿大学圣路易斯ADRC研究中招募。根据PiB-PET(高于0.18截止值，则认为是阳性)和通过MS测量的CSF Aβ42/Aβ40比率(低于0.12截止值，则认为是病理性)，所述群组包括29名淀粉样蛋白阳性参与者和47个淀粉样蛋白阴性参与者，并且10个病例中PET-PIB和CSF概况之间存在结果冲突(5个病例具有PiB-PET(+)/CSF(-)，并且5个病例具有PiB-PET(+)/CSF(-)淀粉样变性概况)。一式两份提取七个CSF样品并且一式三份提取一个以评定变异性。
使用免疫沉淀法纯化CSF tau蛋白–将经过Aβ免疫沉淀并在-80C下储存之后获得的800μl CSF上清液用于tau分析。向解冻的上清液掺入15N tau内部标准物(每个样品5ng)，并使用Tau1免疫沉淀提取。向样品中加入5mM胍、1％NP-40和蛋白酶抑制剂混合物，然后将样品在室温下与20μl与Tau1抗体交联的琼脂糖珠混合3小时。使珠沉淀，然后用0.5M胍和25mM TEABC冲洗。用400ng胰蛋白酶消化样品。掺入AQUA肽(Life Technologies,Carlsbad,California)以达到每个样品中每个标记的磷酸肽10fmol和每个标记的肽100fmol的单独量。AQUA TPSLPpTPPTR(pT217)替代了发现群组中使用的漏切割版本。将胰蛋白酶消化的肽加载到TopTip C18尖端上，用0.1％FA溶液洗涤并用60％ACN 0.1％FA溶液洗脱。将洗脱液在真空离心机(speedvac)上干燥。将样品储存在-80C下。在LC-MS分析之前，将样品重悬浮于25μl2％ACN 0.1％FA中。通过nanoLC-MS/HRMS分析提取物。
Tau肽和磷酸化肽定量(验证)–使用15N标记肽进行稳定同位素稀释MS定量，计算未修饰肽的绝对水平。通过比较在AQUA未磷酸化和磷酸化肽对应物上获得的面积比与对于对应内源肽测量的面积比进行单点校准，计算每个位点的磷酸化率。通过将未修饰肽水平对应物与对应位点的磷酸化率结合来计算磷酸化肽水平。
统计学-使用GraphPad Prism软件(7.0)进行统计学分析，包括回归线斜率的比较。使用非参数Mann-Whitney检验计算跨越研究组获得的值之间的统计显著性。非参数Spearman的ρ等级相关性系数用于评定两个系列值之间的相关性。统计学显著性定义为p<0.05。
CSF tau磷酸化肽的定量(结果)–在圣路易斯华盛顿大学Knight AD研究中心(ADRC)的群组中检测到AD中T217处的tau磷酸化增加，所述群组包括86名不具有认知障碍或轻度认知损害的参与者。与通过MS测量的PiB-PET和CSF Aβ42/Aβ40比率的结果一致，参与者被分为29名淀粉样蛋白阳性参与者、47名淀粉样蛋白阴性参与者和在PET-PIB和CSF概况之间具有冲突结果的10名参与者。为了提高测定灵敏度，使用Tau1抗体进行免疫纯化。使用磷酸化和非磷酸化肽的同位素标记版本来测量位点磷酸化比率。在所有样品中都检测到所有靶向的磷酸化肽，除了含有pS199的肽不能通过Tau1抗体回收。在此群组中，证实pT217生物标志物在疾病早期具有阳性诊断相关性。pT217/T217比率清楚地分开了淀粉样蛋白阳性组和阴性组(图24B和图24C，AUC0.999)。另外，对pT181/T181比率的测量区分了淀粉样蛋白阳性组和淀粉样蛋白阴性组(图24B，AUC0.956)。T217和T181磷酸化比率也是相关的(r＝0.524，p＝0.0002)，这表明这些位点的磷酸化可能由共同途径引起。然而，pT181的诊断灵敏度低于pT217。两种磷酸化比率都是比通过ELISA测量的p-tau(181)和t-tau水平(分别为AUC0.874和0.932)更好的区分因子。
T217超磷酸化、淀粉样蛋白病理与认知状态之间的相关性(结果)–接下来确定这种新的生物标志物与淀粉样蛋白过程之间的相关性。来自ADRC群组的结果表明T217超磷酸化与淀粉样蛋白状态之间存在密切关系。重要的是，T217磷酸化比率与通过FBP总皮质平均值测量的PiB-PET程度显著相关(图24E，r＝0.60，p＝0.001)。此外，具有PiB-PET(+)/CSF(-)淀粉样变性概况的所有五个冲突病例都在T217上被超磷酸化(图24D、24E)。相比之下，在T217磷酸化与CSF Aβ42/Aβ40比率之间没有发现显著相关性。PiB-PET和CSF Aβ42/Aβ40之间的差异可归因于CSF淀粉样蛋白测定的灵敏度不足，因为对应的CSF Aβ42/Aβ40MS比率接近定量阈值(0.12±0.02，图24E)。在具有相反PiB-PET(-)/CSF(+)淀粉样变性的五位参与者中，两位表现出超磷酸化的T217(图24D、24E)。这表明由其高tau超磷酸化突显的这些病例在检测淀粉样蛋白斑沉积之前可具有显著的CSF Aβ变化。CSF Aβ42/Aβ40比率与T217磷酸化比率的组合可靠地鉴定出不具有PiB-PET数据的淀粉样蛋白阳性参与者，即使CSF Aβ42/Aβ40比值的中间值范围略高于阈值(0.12±20％)。在没有认知疾病(CDR-SB＝0)的参与者中，T217磷酸化能够完全区分淀粉样蛋白阳性参与者(n＝9)与淀粉样蛋白阴性参与者(n＝26，AUC1.00，图25)，这进一步支持此标志物可靠地鉴定临床前AD参与者的能力。然而，在此群体中，在用CDR-SB测量的整体认知表现与T217磷酸化比率之间未观察到相关性(图25)。
讨论–使用创新的靶向HRMS方法同时测量CSF中的低丰度磷酸化tau肽及其未修饰对应物，首次提供直接证据证明CSF tau磷酸化比率随淀粉样蛋白变化而变化，并且与CSFtau浓度增加不同。这种方法允许研究AD特异性tau磷酸化率，从而评定超磷酸化和低磷酸化以指示潜在的异常代谢。
当前研究的最惊人结果是在两个独立且特征明确的群组中研究的临床前、轻度和中度AD参与者的CSF tau中T217的高度特异性超磷酸化。淀粉样蛋白病理可能发生在ADtau蛋白病之前，并且T217上的tau超磷酸化与整个疾病阶段密切相关联。这支持淀粉样变性可能与tau磷酸化变化有关的假设。在此研究中不存在具有Aβ-淀粉样变性和正常T217磷酸化的参与者，这表明此tau磷酸化位点可能跟随淀粉样蛋白过程。T217的超磷酸化可能是AD病理生理学过程的关键因素，并且其作用不同于其他tau生物标志物。在群组中，如通过ELISA评定的CSF tau或p-tau水平的增加在鉴定淀粉样变性状态方面不如pT217/T217比率有效。这些AD tau生物标志物的特异性可以改善对最终发展为临床AD的个体中认知下降风险的预测。因此，将淀粉样变性生物标志物与pT217/T217比率测量相结合以检测AD，可以显著改善临床前AD的诊断。尽管与CSF中的淀粉样蛋白标志物相比，T217超磷酸化与通过PiB-PET负荷测量的淀粉样蛋白斑块高度相关，但tau修饰可能并非仅由原纤维性斑块引起。对于具有T217超磷酸化和低CSF Aβ42/40且不具有脑淀粉样蛋白负荷的两名参与者(图24E)，他们可能仅是具有弥散性斑块或Aβ寡聚体形成的病例，未通过PiB-PET检测到，但有助于降低CSF Aβ42水平。
pT181作为AD标志物在临床中广泛使用，可能是由于其高可检测性水平，但不一定是高特异性。与非AD痴呆相比，pT181的测量突显了其在AD中的磷酸化化学计量的轻微变化。在验证群组中研究的特征明确的淀粉样蛋白阳性组中，T181的磷酸化率提高更为明显。在两项研究中，将ELISAt-tau与p-tau181结合的比率都无法证明T181上发生的磷酸化比率的变化，从而强调ELISA准确监测这些变化的局限性。因此，在AD CSF中广泛报告的pT181的增加主要由tau同种型水平的同时增加引起，而不是由T181磷酸化化学计量的显著变化引起。淀粉样蛋白-Aβ病理诱导T181上的超磷酸化，但是与在T217上观察到的相对增加相比，所得修饰似乎特异性更低或不太显著。
在AD CSF中在S199、S202和T205上观察到的磷酸化化学计量的改变可能反映了先前在AD脑中观察到的tau磷酸化的特异性变化。实际上，pS202和pT205是由AT8抗体识别的双磷酸化表位的一部分。AT8结合在AD脑尸检中发现的tau聚集体，并且AT8免疫反应性聚集体的程度与tau蛋白病的严重程度(Braak分期)相关。AT8对正常tau或与CSF中测量的与AD相关的tau不具有反应性。此外，与含有S199的非磷酸化表位处的正常tau结合的Tau1抗体对AD tau聚集体不具有亲和力。总之，这些发现支持来自AD脑的tau聚集体中S199、S202和T205的同时且大量的超磷酸化。然而，关于此类磷酸化tau同种型在AD中促进tau聚集的内在特性存在争议。在轻度和中度AD CSF中观察到的S199和S202磷酸化的量减少与聚集体中对应磷酸化tau同种型的积累一致。此外，主要在中度AD CSF中检测到T205磷酸化表明此位点在淀粉样蛋白相关性tau蛋白病的病理机制中的重要作用。在由临床前和轻度AD参与者组成的第二群组中未检测到S202/T205磷酸化的改变(数据未示出)，这表明在疾病过程期间特异性位点上的tau磷酸化的动态过程。
本发明的发现可表明AD淀粉样变性与T217上的tau超磷酸化之间的相互作用，并程度较低时与在T181上的tau超磷酸化之间的相互作用。这些位点都是丝氨酸/苏氨酸脯氨酸导向的激酶GSK-3的底物，并且提出Aβ低聚物对GSK-3的激活作为淀粉样蛋白肽和tau磷酸化之间的联系。患有淀粉样变性的患者中这两个GSK-3位点上的共同且相关性相对良好的超磷酸化可能与这种机制一致。被设计用于比较CSF和脑中的tau磷酸化率的进一步研究(包括通过tau PET测量的tau聚集体)可能为AD病理生理学提供新颖的见解，并可能鉴定新颖的治疗方法。这些发现指出AD中淀粉样蛋白斑块与tau蛋白病之间的特异性联系，并提供导致AD的分子事件级联中的潜在联系。因此，考虑到pT217在AD过程中的特异性，它可能代表未来治疗开发的重要靶标，以及跟踪抗淀粉样蛋白药物在限制这种异常tau代谢中的潜在作用的有趣工具。
机译： 基于特异性特异性Tau磷酸化的诊断方法
机译： 基于血液的诊断和治疗基于特异性Tau磷酸化的测定
机译： 基于特异性Tau磷酸化治疗方法
