一种用于植物外源基因改造的CodonPlant系统及其改造方法

摘要

本发明公开了一种用于植物外源基因改造的CodonPlant系统及其改造方法，该CodonPlant系统，包括输入模块、处理模块、输出模块；其中，输入模块用于用户输入基因序列、密码子使用频率排序表以及群体个数n；处理模块用于接收输入的密码子信息内容、密码子使用频率排序表信息内容，并依据用户输入的群体个数n，进行有效处理，并通过输出模块，输出对应的结果。本发明将剪切位点和mRNA等参数进行定点突变放入遗传算法中来保持进化过程中种群的多样性，并加入了基于罚函数的排挤机制，使算法具有良好的全局寻优能力，同时具有很高的全局搜索能力和收敛速度，增加了种群多样性，弥补了遗传算法的收敛性效率偏低的不足，可以使算法提高寻找最优解的能力，有很好的实用性。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于植物外源基因改造的 CodonPlant系统及其改造方法。

背景技术

目前，常用的密码子优化软件均对多目标进行优化，并采用了不同的优化方法。例如，Codon Optimizer(Fuglsang，2003)，JCat，OPTIMIZER OPTIMIZER (Puigbòet al.,2007)和ATGme(Daniel et al.,2015)等。最近发展根据多目标寻优算法发展了不同思路的软件。其中GeneDesigner，Upgene和GeMS都先随机生成一组候选序列，然后根据预定义的条件执行筛选器。SGD(Wu et al.,2006)沿着合成基因一步一步地扫描密码，选择基于概率模型的首选密码。 DNAWorks(Hoover and Lubkowski,2002)和EuGene(Gao et al.,2004)使用模拟退火算法来进行codon优化。GASCO(Sandhu et al.,2008)软件包分别采用遗传算法进行密码子优化，QPSOBT(Cai et al.,2008)采用改进的粒子群优化算法进行密码子优化。COStar是一种基于d星的动态搜索算法，用于codon优化算法。

而在实际进行植物密码子优化的实验过程中，如果仅仅使用软件是不能实现的。在真实的进行原核生物优化为植物基因，密码子优化，改变基因序列内的密码子以改进重组蛋白质表达的过程已经被广泛实践。当优化基因序列时，需要考虑影响蛋白质表达的多个相互联系的因素。

通常在植物中表达的转基因来自其他植物物种或非植物。这些基因是进化适应于在宿主生物体中以所需表达水平表达的宿主生物体，但是可能不适合在转化的植物中表达。另外还有一些与植物相同植物的基因在相同的植物中可能不适合高水平的表达。不同的生物有所不同DNA碱基组成(AT％或GC％)，如真核细胞内的不同基因组(核与线粒体(也有T到U)和植物细胞(质体))。DNA碱基对组成的这种差异影响了DNA的频率出现编码相同氨基酸的简并密码子(密码子使用频率)。同源的丰富带电荷的tRNA通常与基因组中目标密码子的频率成比例。因此例如基因由于缺乏某些带电荷的tRNA，富含GC％的富含AT％的生物体翻译不充分。它是本领域众所周知的是通过重新编码转基因可以克服这个问题，使得密码子的使用反映了这一点用于转基因生物中，如果需要高表达，则匹配密码子使用与高表达该生物体中的基因。

除了密码子使用问题之外，真核细胞核基因还有转录剪接和聚腺苷酸化信号在真核生物之间可能不同(例如在动物和昆虫之间或在双子叶植物之间和单子叶植物)，并且可能在其他生物如原核生物中不存在。由于植物中的多聚腺苷酸化信号富含AT，而原核生物缺乏这些信号，富含AT％的原核生物经常含有可被识别为聚腺苷酸化序列的序列。因此，在转基因的编码区域存在这种“隐蔽的”聚腺苷酸化基序已被归因于差在植物中表达，诸如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的基因。Fischhoff等人(US7741118 B1)描述了这一点六聚体 AATAAA样基序的去除将改善基因表达。他们提供了16个潜在的聚腺苷酸化的列表在转基因的编码区中频率应该降低的基序以改善植物中的表达。

植物中非植物基因的高水平表达是关键的农艺问题。因此，需要开发新的方法来提高植物中的基因表达，特别是通过提供比本领域已知的一些其他基因修饰方法提出的修饰少的修饰方法。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种用于植物外源基因改造的CodonPlant系统，满足植物外源基因改造的使用需求。本发明的另一目的是提供一种上述CodonPlant系统的植物外源基因改造方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于植物外源基因改造的CodonPlant系统，包括输入模块、处理模块、输出模块；其中，输入模块用于用户输入基因序列、密码子使用频率排序表以及群体个数n；处理模块用于接收输入的密码子信息内容、密码子使用频率排序表信息内容，并依据用户输入的群体个数n，进行有效处理，并通过输出模块，输出对应的结果；

所述的输入模块包括序列模块、密码子使用频率排序表模块和群体个数模块，序列模块可输入的序列必须为三的倍数，输入的序列以三联体划分，传送到处理模块中；密码子使用频率排序表模块可输入的格式为同义密码子放在同一行，且按使用频率高低从左到右依次排列，中间以冒号隔开，非同义密码子在换行表示；群体个数模块用于输入群体个数n；

所述的处理模块依据遗传算法进行处理最终获得一条最优序列，至少包括种群序列产生模块、期望值设置模块、种群序列处理模块以及增加序列模块；

所述的输出模块，输出的序列保存在output.txt中。

所述的种群序列产生模块用于依据用户输入的信息，产生n条随机序列构成一个种群；期望值设置模块用于用户输入多目标优化期望值；种群序列处理模块在收到用户输入的多目标优化期望值，根据轮盘赌原则选择2条基因，进行基因交叉处理，然后进行基因随机变异，针对剪切位点，进行定点随机变异，针对重复序列，进行定点随机变异，其中，随机变异均使用同义密码子替换，计算估值函数，并替换较差序列，放回原种群，进行循环操作，依据多目标参数计算估值函数得到打分，最终得到优化种群，从中选择出最优序列。

所述的增加序列模块，用于增加亚细胞器定位序列、kozak序列、内含子片段序列等，获得最终用于输出的序列。

所述的遗传算法，过程如下：

1)依据输入的种群数量，随机产生20条序列，构成一个种群；

2)轮盘赌法随机挑取2条序列；

3)1条父本序列，一条母本序列，50％交叉率得到子代；

4)5％随机同义突变；

5)检查是否含有剪切位点，含有时进行定点同义突变：去除植物序列剪切信号、去除多聚腺苷酸化序列、去除酶切信号；

6)检查是否有mRNA二级结构，含有时进行定点同义突变：正向重复、反向重复、镜像重复、倒转重复；

7)统计剪切位点个数、重复序列个数和CAI指数，多目标参数计算估值函数，得到打分。

所述的CodonPlant系统的植物外源基因的改造方法，包括以下步骤：

第一步：序列以及密码子使用频率的输入，并输入群体个数n；

第二步：遗传算法计算，依据用户输入的信息，产生n条随机序列构成一个种群，用户输入多目标优化期望值，根据轮盘赌原则选择2条基因，进行基因交叉处理，然后进行基因随机变异，针对剪切位点，进行定点随机变异，针对重复序列，进行定点随机变异，其中，随机变异均使用同义密码子替换，删除mRNA 降解信号，去除植物序列剪切信号、去除多聚腺苷酸化序列、去除内含子切割序列CATTG、去除AT富集区；计算估值函数，并替换较差序列，放回原种群，进行循环操作，依据多目标参数计算估值函数得到打分，最终得到优化种群，从中选择出最优序列；

第三步：增加亚细胞器定位序列、kozak序列、内含子片段序列；

第四步：输出序列：输出结果保存在output.txt中，方法结束。

第一步中，基因序列由ATG开始TAA终止，每条序列为三的整数倍，要求一个序列一行，序列结束有换行。

第一步中，密码子使用频率表要求格式为同义密码子放在同一行，且按使用频率高低从左到右依次排列，中间以冒号隔开，非同义密码子在换行表示。

第二步中，

1)删除mRNA降解信号：AUUUA、AUUAA；

2)去除植物序列剪切信号：AATAAA、AATAAT、AATTAA、AACCAA、 ATTA、ATTTA、ATAAAA、ATGAAA、AAGCAT、ATATAA、AATCAA、 ATACTA、ATACAT、AAAATA、ATTAAA、AATTAA、AATACA、CATAAA；

3)去除多聚腺苷酸化序列：AATAAT类型，AATCAA类型，AATGAA类型， ATGGAA类型，AATTAA类型，TATAAA类型，其他类型包括ATGTAA、 TGTGAA、AATGCT、GATATG、ATGCAA、AATGTG、AAAGAT、ATTAA、 AATAAA、AATAAT；

4)去除编码区序列中含有的内含子切割序列：5’剪接位点一般为AG/ GTAAGT的保守序列、3’剪接位点末端为TGCAG/G的保守序列；

5)修改连续的大于等于4个AT富集区；

反复循环直到基因序列没有任何一个需要删除的序列并且替换时均已三联体同义密码子进行替换，即可进如下一步。

第二步中，正向重复、反向重复、镜像重复和倒转重复均可选择大于7/8/9/10。

第三步中，增加亚细胞器定位序列、kozak序列、内含子片段序列具体如下：

1)亚细胞器定位序列：序列来自TAIR网站中提供的蛋白亚细胞定位数据库 SUBA；

内质网定位序列：Kdel序列、Hdel序列；

叶绿体定位序列：TP转运肽；

2)kozak序列：烟草kozak序列、拟南芥kozak序列、其他序列；

3)内含子片段序列：玉米内含子adh1、玉米内含子ubil、水稻actl、马铃薯 SBgLR2。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1)对于一个富含AT的细菌基因中含有大量的腺苷酸剪切位点，而大部分植物最优密码子也是在第三位上大量含有AT，所以在需要去掉腺苷酸剪切位点和需要最优密码子上有很强的冲突和矛盾，进一步如果在进行密码子优化的过程中，可能由于选用了更多的第三位的AT产生更多的腺苷酸剪切位点，因此只采用普通的贪婪算法加迭代很容易陷入死循环。另外在所有的软件中，虽然密码子优化算法很多，但是真正实际解决不同物种间的异源转化问题就效率很低，例如 Bt基因的植物表达优化中，许多优化实例证明植物剪切位点要尽可能的去除，才能保证密码子优化后，在植物中高效表达。而所有的密码子优化软件并没有考虑植物本身的这一重要特性，无一例外的全部没有考虑植物多聚腺苷酸化序列、植物序列剪切信号、内含子切割序列因素。导致软件开发但不能解决实际问题。而在考虑了这些因素后，又有新的问题摆在面前，就是密码子优化和剪切序列两个因素直接的冲突。因此，本申请采用罚函数和定向突变的改进遗传算法来解决了这一问题。

2)现有的采用大多数比较经典的优化算法只适用于解空间中的单个解，因为它们往往是基于高阶导数或者目标函数梯度来产生下一个确定的计算序列，但是，这个解会随着迭代深度的增加不断沿着最大速度下降的方向进行改变，这就很有可能会导致局部最优解。但遗传算法在解决高复杂度问题时，比如大空间、非线性、多峰值、全局优化等则显示出了非常独特的优势。它将适应值函数作为参考基础，通过向个体施加遗传操作的方法来达到对群体中的个体结构进行优化重组的目的，从而在全局的范围内逼近最优解。本申请在群遗传算法的基础上引入了一种基于罚函数的小生境技术。传统遗传算法的遗传操作大部分是完全随机的，这种随机的遗传操作的好处进化前期种群的多样性比较好，但是随着进化的继续，适应度低的个体被大量淘汰，留下的大多是相似度较高的个体，再进行遗传操作，也不能产生新的个体，导致种群多样性的降低。本申请将剪切位点和mRNA等参数进行定点突变放入遗传算法中来保持进化过程中种群的多样性，并加入了基于罚函数的排挤机制，使算法具有良好的全局寻优能力，同时具有很高的全局搜索能力和收敛速度，增加了种群多样性，弥补了遗传算法的收敛性效率偏低的不足，可以使算法提高寻找最优解的能力。

3)现有植物序列大多数进行改造主要基于两点：第一密码子的优化，第二是植物剪切信号的去除。许多高表达密码子采用的是TA结尾，而植物剪切信号需要大量去除TA，这样两者之间的矛盾和平衡，如果只采用最优密码子排序进行替换，或者替换掉稀有密码子，很容易进入死循环或者难以找到全局最优解，而进入局部最优解。即本申请要通过寻找好的算法来解决原核生物中大量含有 AT碱基(需去掉)；最优密码子第三位上大量含有AT碱基(需保留)；植物剪切序列大量含有AT碱基(需去掉)参数之间的矛盾，并最终寻找到可以高表达的同义突变序列。在大量现有植物优化实验中大量进行着植物剪切信号的去除，而现行软件并没有一个很好的针对真核生物进行优化的软件，尤其是针对植物这种特定序列的优化。本申请所有替换均以密码子为单位进行替换，即在所有优化过程所需替代密码子时，同义密码子中使用频率高的优先使用，全部是三联体一起替换，且最终保证所表达的蛋白一级序列不变。通过定向突变和建立罚函数，本系统不仅进行了密码子分优先级逐级优化，还保证了原核生物适应真核系统表达所需该基因中去除植物剪切位点，专为植物系统开发，具有很好的实用性。

附图说明

图1是用于植物外源基因改造的CodonPlant系统的流程图；

图2是典型的遗传算法流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

一种用于植物外源基因改造的CodonPlant系统，如图1所示，包括输入模块、处理模块、输出模块；其中，输入模块用于用户输入基因序列、密码子使用频率排序表以及群体个数n(n≥2的整数)；处理模块用于接收输入的密码子信息内容、密码子使用频率排序表信息内容，并依据用户输入的群体个数n，进行有效处理，并通过输出模块，输出对应的结果。

该输入模块包括序列模块、密码子使用频率排序表模块和群体个数模块，序列模块可输入的序列必须为三的倍数，输入的序列以三联体划分，传送到处理模块中；密码子使用频率排序表模块可输入的格式为同义密码子放在同一行，且按使用频率高低从左到右依次排列，中间以冒号隔开，例如格式为“密码子：密码子：密码子”，非同义密码子在换行表示。群体个数模块用于输入群体个数n。

该处理模块依据遗传算法进行处理最终获得一条最优序列，至少包括种群序列产生模块、期望值设置模块、种群序列处理模块以及增加序列模块。种群序列产生模块用于依据用户输入的信息，产生n条随机序列构成一个种群；期望值设置模块用于用户输入多目标优化期望值(统计剪切位点个数为零、重复序列个数为零和CAI指数越高越好)；种群序列处理模块在收到用户输入的多目标优化期望值，根据轮盘赌原则选择2条基因，进行基因交叉处理，然后进行基因随机变异，针对剪切位点，进行定点随机变异，针对重复序列，进行定点随机变异，其中，随机变异均使用同义密码子替换，计算估值函数，并替换较差序列，放回原种群，进行循环操作，依据多目标参数计算估值函数得到打分，最终得到优化种群，从中选择出最优序列。增加序列模块，用于增加亚细胞器定位序列、kozak 序列、内含子片段序列等，获得最终用于输出的序列。

在该处理模块中，如图2所示，典型的遗传算法，过程如下：

1)依据输入的种群数量，随机产生20条序列，构成一个种群；

2)轮盘赌法随机挑取2条序列；

3)1条父本序列，一条母本序列，50％交叉率得到子代；

4)5％随机同义突变；

5)检查是否含有剪切位点，含有时进行定点同义突变：去除植物序列剪切信号、去除多聚腺苷酸化序列、去除酶切信号；

6)检查是否有mRNA二级结构，含有时进行定点同义突变：正向重复、反向重复、镜像重复、倒转重复；

7)统计剪切位点个数、重复序列个数和CAI指数F，多目标参数计算估值函数F，得到打分。具体如下：

1、相对同义密码子使用度(Relativ e Synonymous Codon Usage，RSCU)：是指对于某一特定的密码子在编码对应氨基酸的同义密码子间的相对概率，它去除了氨基酸组成对密码子使用的影响。如果密码子的使用没有偏好性，该密码子的RSCU值等于1，当某一密码子的RSCU值大于1时，代表该密码子为使用相对较多的密码子，反之亦然。第i个氨基酸的第j个密码子的相对同义密码子使用度值的计算公式如下：

公式中，x_ij是编码第i个氨基酸的第j个密码子的出现次数，n_i是编码第i>

2、密码子适应指数(Codon Adaptation Index，CAI)：可以根据已知高表达基因的序列来估计未知基因密码子使用的偏好性程度。CAI的值在0～1之间，如果越高则表明该基因的密码子使用偏好性越强。CAI值一般用来预测种内基因的表达水平，又可以用来预测外源基因的表达水平。

w_ij(The>

式中，RSCU_imax、X_imax分别指编码第i个氨基酸的使用频率最高的密码子的>

式中，L是指基因中所使用的密码子数。

重复序列个数Sum_{duplicate_seqence}：

重复序列参数Param_{duplicate_seqence}＝0.1。

剪切位点个数Sum_Polyasite：

剪切位点参数Param Polya＝0.05。

F＝C-Sum_{duplicate_seqence}*Param_{duplicate_seqence}–Sum_Polyasite*Param>

该期望值函数在0和1之间，数值越接近1表示该基因表达量越高。

该输出模块，输出的序列保存在output.txt中。

本实施例的CodonPlant系统的运行使用依托于运行平台，该运行平台至少包括相互配合使用的输入设备、主机以及显示界面；典型的运行平台可以为计算机 (笔记本、台式机)、工控机、单片机、移动终端(手机、平板)等，运行平台自带的运行系统可以为常用的Windows、android、Mac和Linux等系统或不常用系统甚至是专用系统。

上述CodonPlant系统的植物外源基因改造方法，具体步骤如下：

第一步：序列的输入：

1)基因序列由ATG开始TAA终止，每条序列为三的整数倍，要求一个序列一行，序列结束有换行。

2)密码子使用频率：该使用频率表要求格式为同义密码子放在同一行，且按使用频率高低从左到右依次排列，中间以冒号隔开。必须是“密码子：密码子：密码子”这种格式，非同义密码子在换行表示。

例如输入“密码子使用频率表”格式可以是：

TTT:TTC

TTA:TTG:CTT:CTC:CTA:CTG

GTT:GTC:GTA:GTG

CCT:CCC:CCA:CCG

ACT:ACC:ACA:ACG

GCT:GCC:GCA:GCG

TAT:TAC

TAA:TAG

CAT:CAC

CAA:CAG

AAT:AAC

AAA:AAG

GAT:GAC

GAA:GAG

TGT:TGC

CGT:CGC:CGA:CGG:AGA:AGG

GGT:GGC:GGA:GGG

AGT:AGC:TCT:TCC:TCA:TCG

该系统会首先将密码子表转化成为下列矩阵，体现密码子使用的优先级：

0 0 TTT 0 1 TTC

1 0 CTT 1 1 TTG 1 2 CTC 1 3 TTA 1 4 CTG 1 5 CTA

2 0 ATT 2 1 ATC 2 2 ATA 2 3 GTG

3 0 GTT 3 1 GTG 3 2 GTA 3 3 GTC

4 0 CCA 4 1 CCT 4 2 CCC 4 3 CCG

5 0 ACT 5 1 ACA 5 2 ACC 5 3 ACG

6 0 GCT 6 1 GCA 6 2 GCC 6 3 GCG

7 0 TAT 7 1 TAC

8 0 TAA 8 1 TAG

9 0 CAT 9 1 CAC

10 0 CAA 10 1 CAG

11 0 AAT 11 1 AAC

12 0 AAG 12 1 AAA

13 0 GAT 13 1 GAC

14 0 GAG 14 1 GAA

15 0 TGT 15 1 TGC 15 2 CGA 15 3 CGG 15 4 AGA 15 5 AGG

16 0 AGA 16 1 AGG 16 2 CGT 16 3 CGA 16 4 CGC 16 5 CGG

17 0 GGT 17 1 GGA 17 2 GGG 17 3 GGC 17 4 TCA 17 5 TCG

18 0 TCT 18 1 TCA 18 2 AGT 18 3 TCC 18 4 AGC 18 5 TCG

3)群体个数n的输入，以步骤以n＝20为例。

第二步：遗传算法，主要进行的是删除mRNA降解信号，去除植物序列剪切信号、去除多聚腺苷酸化序列、去除内含子切割序列CATTG、去除AT富集区(连续的大于等于4个AT富集区序列)，后面统称为特异序列。

如其中AATAAA、AATAAT、AATTAA、AACCAA、ATTA、ATTTA、 ATAAAA、ATGAAA、AAGCAT、ATATAA、AATCAA、ATACTA、ATACAT、AAAATA、ATTAAA、AATTAA、AATACA、CATAAA。均为内含子切割序列。在实际方法运行中，首先进行AATAAA的寻找，当找到它第一个A在序列中的位置后，首先得到其在第几号碱基，将此号除以三的余数为1，则此A为三联体的第一位，如余数为2，则此A为三联体的第二位，余数为0，则此A为三联体的第三位，如果是第一位则直接替换AATAAA的第一个AAT，换为其同义密码子(同义密码子排号为0的使用频率越高，为最优密码子。如果第一位上次已被更换为排好为1，则这次更换第二个密码子AAA排好为0的密码子，同样以同义密码子排号小为优选。如果第二个密码子AAA排号也为1则替换第一个密码子AAT排号为2的密码子，以此来推。)如果是三联体的第二位则该序列加入全基因中 AATAAA前的一个碱基*AATAAA(一般同义密码子第一位相差不大，当然也有例外)。*AA作为第一个开始换位其同义密码子(同义密码子排号小的使用频率越高为最优。如果*AA为同义密码子表中的最大排号，则第一密码子*AA不变，更换第二个密码子TAA，同样以同义密码子排号小为优选。)如果是三联体的第三位则**A作为第一个开始替换的密码子，方法同前。总之，在替换同义密码子的过程中全部以三联体密码子进行替换已保证最终所得蛋白质完全相同。

替换该基因序列里的AATAAA之后，重新返回检测是否有该检测位点，如果没有，则进入下一个AATAAT内含子切割序列的检测，同样方法循环进行，当该序列完成第一次各种需要删除的序列检测后，还需要重新再循环再次检测看是否因为密码子改过后又出现以前检测过的切割序列等重复。

该步骤所需去掉的序列为：

1)删除mRNA降解信号：AUUUA、AUUAA、其他；

2)去除植物序列剪切信号：AATAAA、AATAAT、AATTAA、AACCAA、 ATTA、ATTTA、ATAAAA、ATGAAA、AAGCAT、ATATAA、AATCAA、 ATACTA、ATACAT、AAAATA、ATTAAA、AATTAA、AATACA、CATAAA、其他；

3)去除多聚腺苷酸化序列：AATAAT类型，AATCAA类型，AATGAA类型， ATGGAA类型，AATTAA类型，TATAAA类型，其他类型(包括ATGTAA、 TGTGAA、AATGCT、GATATG、ATGCAA、AATGTG、AAAGAT、ATTAA、 AATAAA、AATAAT)；

4)去除编码区序列中含有的内含子切割序列：5’剪接位点一般为AG/ GTAAGT的保守序列、3’剪接位点末端为TGCAG/G的保守序列、其他序列；

5)修改连续的大于等于4个AT富集区。

反复循环直到基因序列没有任何一个需要删除的序列并且替换时均已三联体同义密码子进行替换，即可进如下一步。

第三步：避免mRNA的形成：在上步所生成的序列中扫描是否有正向重复(可选择大于7/8/9/10)、反向重复(可选择大于7/8/9/10)、镜像重复(可选择大于 7/8/9/10)、倒转重复(可选择大于7/8/9/10)。

第四步：增加亚细胞器定位序列、kozak序列、内含子片段序列等。具体如下：

1)亚细胞器定位序列：序列来自TAIR网站中提供的蛋白亚细胞定位数据库 SUBA(The Subcelular Proteomic Database)；

内质网定位序列：Kdel序列、Hdel序列、其他序列；

液泡定位序列：其他序列；

叶绿体定位序列：TP转运肽、其他序列；

线粒体定位序列：其他序列。

2)kozak序列：烟草kozak序列、拟南芥kozak序列、其他序列。

3)内含子片段序列：玉米内含子adh1、玉米内含子ubil、水稻actl、马铃薯 SBgLR2、其他序列。

第五步：输出序列：输出结果保存在output.txt中，方法结束。

实施例2

采用实施例的用于植物外源基因改造的CodonPlant系统，进行具体植物外源基因改造，过程如下：

第一步：输入Bacillus thuringiensis菌的NADH dehydrogenase原始基因序列 (序列如SEQ ID NO.1所示。)

第二步：根据该序列任意合成20条同义序列(即具有相同蛋白质的不同核苷酸序列)，编号为[0]～[19]，序列对应如SEQ ID NO.2-21所示。

第三步：使用轮盘赌法随机抽取这20条中的2条。例如抽取第[0]号其期望值是0.2476，第[3]号其期望值是0.2489，作为亲本，将这两条序列各取一半进行交叉重组得到新序列命名为new_seq，将新序列进行5％的随机同义突变后，再扫描其中的特异位点，定向针对特异位点进行定点随机突变，第二次继续扫描其中的重复序列，定向针对重复序列进行定点随机突变，最后计算经过三次突变后的序列作为子代计算期望值为0.3005。比较亲本和子代的期望值大小，[0]、[3] 和子代分别为0.2476、0.2489和0.2934。舍掉期望值最小的序列，将其余两条序列重新放回20条序列库中。在这20条序列中[1]期望值最大为0.3005。[1]号中有8个特异位点。

第四步：迭代100次，即重复上面第三步100次循环。

开始第一代的重复进化，通过轮盘赌法选择第[14]号和[5]号，经过三次突变后，新子代序列的期望值为0.2921，与[14]号的0.2927，[5]的0.2617相比，[5] 用新子代替换，计算20条各自的最大期望值为第1号0.3005，其中有8个特异位点。经过16代重复1-3步遗传进化后，特异位点全部去除，新序列的期望值为0.5825，亲本14号为0.2927，[10]为0.4702，替换后的20条序列中最大期望值为新序列0.5825。从17代开始，后面都没有特异序列和重复序列。100次迭代后最后序列的期望值为0.6127，亲本为第[5]号，期望值为0.6092，第七号期望值为0.5861，最大值为第[13]号0.6175。

第16次迭代后，最优序列如SEQ ID NO.22所示，第100次迭代后最优序列如SEQ ID NO.23所示(输出结果)，表1是100代前后结果比较。

表1 100代前后结果比较

从表1可以看出，该序列经过100代优化后，序列表达量显著增加。

实施例3

方法同实施例2，以cry9Aa-0的原始序列如SEQ ID NO.24所示(输入序列) 进行基因改造，100代优化后的序列如SEQ ID NO.25所示(输出结果)，表2 是100代前后结果比较。

表2 100代前后结果比较

从表2可以看出，该序列经过100代优化后，序列表达量显著增加。

序列表

<110> 南京晓庄学院

<120> 一种用于植物外源基因改造的CodonPlant系统及其改造方法

<130> 100

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1611

<212> DNA

<213> Bacillusthuringiensis

<400> 1

atgagcaatc caaataaaga tttagaggag ctgaaaaaag aagcagctag gcgtgcaaaa 60

gaagaagcga gaaaacgcct tgtagcgaaa cacgaggcgg aaataagtga gcttgaggaa 120

gaagatcaag aaaaagagaa agcgctacca aaaaacgatg atattactat agaagaagca 180

aaacgacgtg cagcagcggc tgcaaaagca aaagtgacgg cgttagcgaa gcagaaaaga 240

gaaggaaccg aagaagtaac ggaagaagaa aaagcaaaag ccaaggcgaa ggcagcagcg 300

gctgcaaaag caaaagcggc agcgttagcg aagcagaaaa gagaaggaac cgaagaagtg 360

acggaagaag aaaaagcgaa agccaaggcg aaggcagcag cagctgcaaa agcaaaagcg 420

gcgacgttag cgaagcagaa aagagaagga atagaagaag taacggaaga agaaaaagcg 480

aaagccaagg cgaaggcagc agcggctgca aaagcaaaag tggcggcgtt agcgaagcag 540

aaaagagaag gaatagaaga agtaacggaa gaagaaaaag cgaaagccaa ggcaaaagcg 600

gcggcgttag cgaagcagaa aagagaaggg acagaagaag taacggaaga agaaaaagcg 660

aaagccaagg caaaagcggc ggcgttagcg aagcagaaaa gagaagggac agaagaagta 720

acggaagaag aaaaagcgaa agccaaggca aaagcggcag cattggcgaa gcagaaagcc 780

tcgcaaggtg atggggattc gggagatgaa aaggcaaagg caattgcagc ggcaaaagcg 840

aaagcagcag cggctgcaag agcgaagaca aagggggctg aaggtaagaa agaggatgag 900

ccgaagcagg aagaactgtc cgtaaatcag ccgtatttaa atcagtatgt tgaggctatt 960

agggagaagt taggagaggg tgcattagta gattcctaca ttaataaact gtcaaaggat 1020

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catgagggac ttgcttttga ttatatgtca gagctacatg cgacggattt tgtgacacat 1140

atggaagtgt atgttcattt gttttcatat agtaagaaac aatcggtagc ggtgaaggta 1200

aagctagacc gagaaacgcc gcaagtcgaa tctgtgacag cgctttggaa aggggctgac 1260

tggccggagc gagaagcata cgatttgctc ggcattatat ttaaagggca tccgaattta 1320

acacgtattt taatgccaga ggattgggta ggatatccgc ttagaaaaga ctatgaaccg 1380

tatgatgtgg aggtgtaggt gtggccgtta aggttaagtt ggatcgcgag acaccgcaag 1440

tggagtctgt caccgcgctc tggaaaggcg ctgattggcc agagcgtgaa gcttatgacc 1500

ttctgggaat tattttcaag ggccatccta atctcacaag gatccttatg ccagaggatt 1560

gggttggata tcccctgcgt aaagactacg agccctacga cgttgaggtg t 1611

<210> 2

<211> 1611

<212> DNA

<213> 编号[0]序列(Artificial)

<400> 2

atgagtaatc ctaacaagga tctagaagag ttaaaaaaag aggcggcacg ccgagctaaa 60

gaagaggcca gaaagcggct tgtagcaaaa catgaagcgg agattagcga attagaggaa 120

gaagaccagg aaaaggaaaa ggctctgcca aaaaacgatg atataacgat cgaagaagct 180

aaacggaggg ctgcagcagc ggctaaagca aaagttaccg ctctcgctaa gcaaaaacga 240

gaaggcaccg aggaggtaac cgaggaggag aaagcaaagg caaaagccaa agcagccgca 300

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acggaggagg aaaaagcgaa agccaaagct aaagcggcag ccgcggctaa agcaaaagcc 420

gcgacactag caaaacagaa gcgggagggt attgaggagg tcaccgagga ggaaaaggcc 480

aaagccaaag caaaagcggc tgctgcagca aaggctaaag tggctgcgct cgctaaacaa 540

aagcgagagg ggattgagga agttacggag gaggaaaaag ctaaggcaaa ggcgaaagca 600

gccgcgttag cgaaacaaaa acgggaaggc acggaagaag ttactgagga ggaaaaagca 660

aaagccaagg ctaaagcggc cgcccttgcc aaacaaaagc gagaggggac ggaagaggtg 720

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tcccaaggtg acggggactc gggagatgag aaggctaagg ccattgccgc tgcaaaggcc 840

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cgggaaaaac tcggcgaagg agccttggta gacagttaca tcaataagct gagcaaagat 1020

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catgaagggc ttgcatttga ttatatgtcg gagctacatg cgacggattt tgtgacgcat 1140

atggaggtgt atgtccatct attctcatac tccaaaaagc agtccgtggc ggtcaaggta 1200

aaacttgata gagagacccc gcaggtagaa tctgttacgg cactctggaa aggggcggat 1260

tggccggaga gggaagccta tgatttgtta gggattatct ttaaagggca cccaaatcta 1320

acacggatcc taatgcccga agactgggta ggatacccct tgcgaaagga ttacgagccg 1380

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<210> 3

<211> 1611

<212> DNA

<213> 编号[1]序列(Artificial)

<400> 3

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<210> 4

<211> 1611

<212> DNA

<213> 编号[2]序列(Artificial)

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aaggcagccg cggctgctcg agctaaaacg aagggggctg agggcaaaaa ggaagatgag 900

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<211> 1611

<212> DNA

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<210> 6

<211> 1611

<212> DNA

<213> 编号[4]序列(Artificial)

<400> 6

atgtcgaacc ctaataagga tttagaagag ttaaagaaag aggctgcaag acgtgctaaa 60

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gaaggtacag aagaagtgac tgaagaagag aaggcgaagg ctaaggcaaa ggccgcagca 300

gcagctaaag caaaagcggc ggccctggca aaacagaaac gagagggtac tgaagaagtt 360

acggaggaag agaaagcaaa agctaaggca aaagccgcgg ctgctgccaa agctaaggcg 420

gcgaccttag ctaagcagaa acgagagggg atagaggagg taacagaaga agagaaggca 480

aaagccaagg caaaggcagc ggctgcggcc aaagctaaag tggcagcact agctaaacag 540

aaacgagaag gaattgaaga ggtaactgaa gaggagaaag ctaaagcaaa agctaaggct 600

gcagcactgg ctaaacagaa gcgcgaaggt acagaagaag tcaccgagga agaaaaggct 660

aaagcaaagg caaaggcagc agctcttgcc aagcagaaac gtgaggggac cgaggaagtt 720

accgaggagg aaaaagcaaa ggcaaaagcc aaggcggcag cgttagcaaa gcagaaagcc 780

tcgcaaggtg atggtgattc aggagacgaa aaggccaagg cgattgcggc cgctaaagca 840

aaggccgcag ctgccgcacg tgcaaaaacc aagggggcgg aaggtaaaaa ggaagacgag 900

ccgaagcaag aagagttatc agtcaaccag ccttatctga accagtatgt agaagcaata 960

cgagagaagt taggcgaagg ggcgctggtt gattcataca tcaacaaatt gtctaaagat 1020

gtccccaccc tcgttgtgga ccccgaaaag tactacgagg taatggagtc actccgattc 1080

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<212> DNA

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tcacaaggtg atggtgacag tggtgacgaa aaggcgaaag ccatcgccgc cgcgaaagct 840

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<211> 1611

<212> DNA

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cacgagggat tggctttcga ctatatgtcg gagttgcatg caacggattt cgtcacacac 1140

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tggccagaga gagaagcata tgacctcctg ggtataatat tcaaggggca ccccaacctg 1320

acccggatcc taatgccgga agactgggtg gggtaccctc tacgcaagga ttatgagccg 1380

tatgatgttg aggtctaagt ctggccacta aggctgtcgt ggatagcccg acaccgtaag 1440

tggtcgctta gccctcgaag tgggaaagcc ctcattgggc agagtgttaa gttaatgacc 1500

ttttgggagt tgttctccag agcgattctg ataagtcagg ggtcgttatg ccagcggatt 1560

gggttggata ttccatgcgt taaaaccact agccctacga cccttcgttg t 1611

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<211> 1611

<212> DNA

<213> 编号[7]序列(Artificial)

<400> 9

atgagtaatc ccaacaagga ccttgaggag ttaaaaaagg aggcggcacg acgcgcaaaa 60

gaggaggccc ggaagcgcct cgtggcaaaa cacgaagccg agatttcaga gctagaagag 120

gaagaccaag aaaaagagaa agcccttccc aagaacgatg atataacaat agaagaagcc 180

aagcgcaggg cagcagcggc ggcgaaagct aaggtcacgg cactggcgaa acaaaagcgc 240

gaaggcacag aggaggttac tgaagaggaa aaggctaaag ccaaagcgaa agccgccgct 300

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aaagcgaagg cgaaggcagc tgcggcggct aaggcgaagg ttgcggcgct tgcaaagcag 540

aaaagagaag ggattgaaga agttaccgag gaggaaaaag cgaaagcgaa ggctaaagca 600

gcagcgttag ccaaacaaaa gcgggaagga actgaagaag tcaccgaaga agagaaggct 660

aaagcaaagg ccaaggcggc agctttggcc aaacagaaac gtgaagggac ggaagaagtc 720

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tcccaggggg acggcgactc tggagatgag aaggcaaaag ccatagctgc ggccaaggca 840

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ccaaaacagg aagaactatc cgttaaccaa ccgtatctaa atcagtacgt cgaagcgatt 960

cgcgagaagt tgggcgaggg tgcgttagtc gactcgtaca taaacaagct atcgaaagat 1020

gttccgactt tggtcgtcga ccccgaaaaa tactacgaag tgatggagtc gcttcgtttc 1080

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tggccagaac gcgaggcata tgatctatta ggtataatct ttaaggggca cccgaacctt 1320

acgaggatcc taatgcctga agactgggtc ggctatccgc ttcgaaaaga ttatgaacct 1380

tatgacgtag aggtctgagt atggccacta cgtctatcat ggatagcccg tcaccgaaaa 1440

tggtcactca gcccacgatc cggaaaagca ttaataggtc aaagtgtaaa gttaatgacc 1500

ttttgggagc tctttagtcg tgcgatacta atatctcaag gttccttatg tcagcgcata 1560

ggacttgaca ttccttgcgt taaaactaca agccccacga ccctgcgatg t 1611

<210> 10

<211> 1611

<212> DNA

<213> 编号[8]序列(Artificial)

<400> 10

atgagtaatc ccaataagga tttagaggag ctaaagaagg aggccgcaag gcgcgctaaa 60

gaggaggctc ggaagcgcct tgtagcaaaa cacgaggcgg agataagtga gctcgaggaa 120

gaagatcagg aaaaggaaaa ggcattacct aagaacgacg acataacaat tgaagaagca 180

aagagaaggg ccgcggctgc cgcaaaggca aaagtaacag ctttagccaa acagaagcgt 240

gaaggcacgg aggaggtgac tgaggaagag aaagctaaag ctaaagcgaa ggcagccgct 300

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accgaggaag aaaaggcaaa ggcaaaggct aaggcagcag cggccgccaa agccaaagcc 420

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acagaggagg agaaggctaa agcaaaggcc aaggcagcag cgcttgccaa acaaaaagct 780

tcgcaggggg acggcgactc tggagatgag aaagcaaagg cgatcgccgc ggctaaagcg 840

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cgggaaaagt taggcgaagg agctttggtg gactcttata ttaataagct ttcaaaagac 1020

gttcccacgc tcgtagtgga tccggagaaa tactatgagg taatggaatc cttacgtttt 1080

cacgagggac tagctttcga ttacatgtcc gaattgcatg cgactgattt tgttactcac 1140

atggaggtgt acgttcacct attctcatat tctaagaaac aatcggttgc agtaaaggta 1200

aaattagaca gggaaacgcc tcaagtggag tcagtgacgg cgttatggaa aggtgcggac 1260

tggccggagc gggaagctta cgacttgtta ggtataatct ttaaagggca tcctaacctg 1320

acccgtatcc tgatgcccga agactgggtt ggttatccct tgcggaaaga ttacgaacca 1380

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<210> 11

<211> 1611

<212> DNA

<213> 编号[9]序列(Artificial)

<400> 11

atgtcgaatc caaacaaaga tcttgaagaa ttgaagaagg aggccgcacg gcgagcaaag 60

gaggaggcga gaaagaggct tgtcgcaaaa catgaggccg agatttctga gttagaggaa 120

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aaattagatc gagaaacgcc tcaagtcgaa tctgtgaccg cactctggaa aggagctgat 1260

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<210> 12

<211> 1611

<212> DNA

<213> 编号[10]序列(Artificial)

<400> 12

atgtcgaatc cgaacaagga cttggaggag ttaaagaaag aggctgcgag gcgcgccaaa 60

gaggaggcaa ggaagcgtct tgtggctaag catgaggccg agatttccga actggaagaa 120

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<210> 13

<211> 1611

<212> DNA

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<400> 13

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<210> 14

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<212> DNA

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<400> 14

atgagcaatc ccaacaagga ccttgaggag ctaaaaaagg aagctgctag acgggccaag 60

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<210> 15

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<212> DNA

<213> 编号[13]序列(Artificial)

<400> 15

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<211> 1611

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<400> 16

atgtctaatc ccaataagga tttggaggaa ttaaagaaag aggccgcccg gcgggcgaag 60

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<211> 1611

<212> DNA

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gaggatcaag aaaaggagaa agctttacct aaaaatgatg acattactat cgaggaggcc 180

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acagaggagg aaaaggctaa agcaaaagcc aaggcggccg cagctgcgaa agctaaagca 420

gcaacattgg cgaaacaaaa acgtgagggc attgaagaag tgacggaaga ggaaaaagct 480

aaagcaaaag caaaggccgc tgccgcggcc aaagcaaagg ttgctgcgct cgccaagcag 540

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<210> 18

<211> 1611

<212> DNA

<213> 编号[16]序列(Artificial)

<400> 18

atgtctaacc cgaataaaga cttagaagag ttaaagaagg aagcggctag acgggcgaaa 60

gaggaagctc gtaagaggct cgttgcgaag cacgaagccg agatttctga actagaggaa 120

gaagaccaag agaaggaaaa agcccttcct aagaacgacg acatcactat cgaagaagct 180

aaacgacgcg ccgctgcggc agcaaaggca aaggttacag cccttgcgaa acaaaagagg 240

gagggaaccg aagaagttac agaagaagag aaagcaaagg caaaggccaa ggcggcagcc 300

gcggcaaagg ccaaggctgc ggcgcttgcg aaacaaaaac gtgaaggaac ggaggaggtg 360

accgaagaag agaaagcaaa ggccaaggcg aaagctgctg ccgcagctaa agcaaaagct 420

gccacactcg cgaaacagaa gcgggaggga atagaagaag taacagagga ggagaaagct 480

aaagctaaag cgaaagcggc cgcggcagca aaagctaagg tggcagcttt ggcgaagcaa 540

aagagggagg gaatcgagga agtgacggaa gaggagaagg cgaaggccaa ggcgaaagct 600

gctgcgctag caaaacagaa gagggagggc acggaggagg tgacagagga ggaaaaggct 660

aaagcgaagg ccaaggcagc ggccctcgcc aagcagaaac gtgaaggaac cgaagaagtc 720

acggaagaag aaaaggcgaa agcaaaggct aaggccgcgg cattggccaa gcaaaaagcg 780

tcccaggggg atggtgactc tggggatgaa aaagccaagg cgattgctgc cgccaaagcc 840

aaagctgctg ccgctgccag agctaagacc aagggggctg aaggaaagaa ggaggacgaa 900

cctaagcaag aagagttatc tgtgaaccag ccttacctaa accaatatgt tgaggctatt 960

cgagaaaagc taggggaagg tgcgttggtt gacagttata taaataaact gagcaaggat 1020

gtgccaacac tagttgttga tcctgaaaaa tattacgagg taatggaaag cttgaggttc 1080

cacgagggac tggcattcga ctacatgagc gagctgcacg ctaccgattt tgtaactcac 1140

atggaggtgt acgtacatct gttcagttat tccaaaaaac aatcggtggc ggtcaaggtc 1200

aagctcgacc gggaaacgcc acaggtcgaa tctgtgacgg cactatggaa gggggccgac 1260

tggcccgaga gagaagctta tgatttattg ggaataatct ttaaaggcca cccgaatctt 1320

acacgaatac tcatgcccga ggattgggtc gggtatccgc tgaggaaaga ttatgaacct 1380

tacgatgtgg aggtgtaggt atggcctctg cgccttagtt ggatcgcccg tcacagaaag 1440

tggtctttga gcccccgctc tggtaaggcc ctcataggcc agtctgttaa gttaatgact 1500

ttttgggagc tatttagcag ggcaatctta atcagccaag gatcgttatg ccagcgcatt 1560

gggctagata taccctgcgt taaaacaacg tcacctacta cgctgcggtg t 1611

<210> 19

<211> 1611

<212> DNA

<213> 编号[17]序列(Artificial)

<400> 19

atgagtaacc ctaataagga cctagaagaa ctgaaaaaag aagcagctcg acgagcgaaa 60

gaagaagcga gaaagagact cgttgcaaag catgaggcag agatctcaga gctagaggag 120

gaagatcaag aaaaagaaaa agcacttccg aagaatgatg atatcacaat tgaggaagca 180

aaaagaaggg cagctgctgc tgcaaaggcg aaggtgacgg ccctggccaa acaaaagaga 240

gagggtactg aggaagtcac tgaggaagaa aaggccaagg cgaaggccaa agcggccgcc 300

gcagccaagg ccaaggcggc ggctttagct aaacaaaagc gcgaggggac ggaggaagtt 360

acagaagaag aaaaagcaaa agccaaagct aaggcggcag cggcagcgaa ggcaaaggca 420

gcaaccctgg caaagcaaaa gagagaagga atagaggagg tgactgaaga agagaaagcg 480

aaagccaaag caaaagctgc cgctgccgct aaagccaaag tggcggcatt agccaagcaa 540

aaacgtgagg gcatagaaga agttacggaa gaggagaaag caaaggccaa agcgaaggcc 600

gcggccctag cgaagcagaa gcgagaaggc acggaagagg ttactgagga agagaaggcg 660

aaagccaagg ctaaagcagc agctctagct aaacaaaaaa gggaaggcac cgaagaggtg 720

acggaagaag aaaaagcgaa ggcgaaagcg aaggccgccg ccctagcgaa gcagaaggcg 780

tcgcaaggtg acggcgattc gggcgacgaa aaagccaaag ctatagcggc agcgaaggcg 840

aaggccgcag cagcggcccg ggctaaaacg aaaggtgcgg agggcaaaaa agaagatgaa 900

ccaaaacagg aggaactaag cgtcaatcag ccgtacctga accaatacgt tgaagcaatt 960

cgggagaaac tcggggaggg tgctctggta gatagttata ttaataagct cagcaaggat 1020

gtaccgacgc tggttgtcga tccggaaaaa tactacgagg ttatggaatc attaaggttc 1080

cacgaaggtc tcgcgttcga ttacatgtcg gaacttcatg ccaccgattt tgtgactcac 1140

atggaagtgt acgtgcattt gttttcgtac tcaaagaaac aaagtgtcgc ggttaaggta 1200

aaattagata gagagactcc gcaagtcgaa tcggtaacgg ccctgtggaa gggggccgac 1260

tggcccgaga gagaggcata tgacctcctg gggataatct tcaagggcca tccaaacttg 1320

acccgaattc tcatgccgga ggattgggtt ggttatcctc tacggaagga ttatgaacct 1380

tacgacgtgg aagtataggt atggccattg cgattgtcgt ggatagctcg tcataggaaa 1440

tggtcgctgt ccccgagaag tgggaaggct ctcatcggac aaagcgttaa actcatgact 1500

ttttgggaat tgttctcccg cgcaattttg atcagtcagg gttcattgtg ccaacggatt 1560

ggtttggata tcccgtgtgt aaaaacaacc tccccgacca cccttcggtg t 1611

<210> 20

<211> 1611

<212> DNA

<213> 编号[18]序列(Artificial)

<400> 20

atgtcaaatc ccaataaaga cctggaagaa ctaaagaaag aggctgctcg acgtgccaag 60

gaagaggcta ggaaaagatt agtagcaaaa catgaggctg aaatctctga gttagaagag 120

gaggatcaag aaaaggaaaa ggccctaccc aagaatgacg atatcactat agaggaagca 180

aaacgccgtg ccgcggctgc ggcaaaggct aaggtaactg cgcttgctaa acagaaaagg 240

gaaggcactg aggaggtaac tgaggaggaa aaagcgaaag ccaaagcaaa agcagcagct 300

gcagccaaag ccaaggctgc cgcgttggcg aaacaaaagc gcgaagggac cgaagaagta 360

actgaggagg aaaaagcgaa ggcaaaggcg aaggcggccg cggcggcaaa agctaaggct 420

gctaccctcg cgaagcaaaa gagggaggga atagaggagg tgacggaaga agaaaaagct 480

aaggctaagg ctaaggcagc ggctgccgct aaggcgaaag tagcagcgtt agcgaagcaa 540

aagagggagg ggattgagga ggtaacagag gaagaaaagg ccaaggccaa ggcaaaggct 600

gctgctctcg ccaagcagaa acgggaaggg acagaggaag ttactgaaga ggaaaaggcc 660

aaagcaaagg caaaagccgc tgccctcgcg aagcaaaaga gggagggtac tgaagaggtg 720

accgaggagg aaaaagcaaa agccaaagca aaggcagccg cactcgccaa acagaaagcg 780

tcacaaggcg atggagactc cggcgatgaa aaggctaagg caatcgcggc ggcgaaagcg 840

aaagccgctg cggctgcccg cgccaaaacc aagggtgccg agggcaaaaa agaagacgag 900

cctaaacaag aggaactctc ggttaatcaa ccatacttga accaatacgt agaggccatt 960

agagaaaagt tgggagaggg tgcgctagtg gattcataca tcaataaatt atcaaaagac 1020

gttccgactt tagtagtaga tcccgaaaaa tactatgagg ttatggaatc actcaggttt 1080

catgaaggat tggcatttga ttatatgagc gaattgcatg caacagattt cgttacccac 1140

atggaggtgt acgtccatct attctcgtac tctaagaaac agtcagttgc tgtcaaagtc 1200

aagctcgatc gtgagacccc tcaggtcgag tctgtgactg ctttgtggaa aggagctgat 1260

tggccggaac gtgaagcgta tgacctgtta ggtattatct ttaaagggca tccaaatttg 1320

acgagaatat taatgccgga ggactgggtc ggatatccgc tacgaaaaga ctacgagcca 1380

tacgatgtgg aggtgtaggt atggcctctg cgactgtctt ggatcgcccg ccatcgaaaa 1440

tggagtctca gcccacgaag tggcaaagca ctgatcggtc agtctgtgaa gctgatgacc 1500

ttttgggagc tgttctcccg cgcaatctta attagccagg ggtcattatg ccagaggata 1560

ggcttggaca ttccgtgcgt taagacgact tcgccgacca cgttgcgttg t 1611

<210> 21

<211> 1611

<212> DNA

<213> 编号[19]序列(Artificial)

<400> 21

atgtctaacc ctaacaagga cttagaggaa cttaagaaag aagccgcacg gcgcgctaaa 60

gaggaggcac ggaagaggct cgttgccaag catgaggctg aaatttctga attagaggag 120

gaagatcaag agaaggagaa ggcgcttcca aaaaatgatg atatcactat agaggaggct 180

aagcggaggg cagctgccgc tgctaaggca aaggtgacgg cactggctaa acagaaacgt 240

gaaggtaccg aggaagtgac tgaagaagag aaagcgaaag ccaaggcgaa ggccgccgcc 300

gcggcaaaag caaaagcggc ggcgttggcg aaacagaagc gagaaggcac ggaggaggta 360

accgaggaag agaaggccaa agccaaggca aaggcagccg ctgccgcaaa agctaaagct 420

gcaacattag cgaagcaaaa aagggagggt atagaagagg taacggaaga ggaaaaggcg 480

aaggcaaaag cgaaagcggc tgcggcagca aaggcaaaag tcgccgccct ggctaaacag 540

aagcgagagg gaatagagga agtaactgaa gaagaaaagg ccaaagccaa agcaaaggcc 600

gctgcgctag cgaagcaaaa gcgagaaggg acggaagaag taacggaaga ggagaaggcc 660

aaagctaaag ccaaagccgc agcacttgcc aaacagaaac gggaaggcac tgaagaggtt 720

acggaggaag aaaaggcaaa ggcgaaagcg aaagcggcag ccctggccaa acagaaggct 780

tcccaggggg atggagacag cggagacgag aaagccaaag caatagcagc ggcgaaagcc 840

aaggcggccg ctgccgcgag agcaaagaca aaaggcgcgg agggtaaaaa ggaagacgag 900

ccgaagcaag aggaactctc cgtcaatcaa ccctatctca accagtacgt cgaggcgatc 960

cgcgagaagc taggggaagg tgctctggtt gacagttata taaacaaatt gtcaaaggat 1020

gtgcctacgt tagttgtcga ccctgagaag tattacgaag tgatggagag tttaagattc 1080

cacgaagggc tcgcctttga ttatatgagc gaattgcacg ctacggactt cgtaactcac 1140

atggaggtct acgttcacct gttctcttac tcaaagaaac agtctgtagc tgtgaaagtc 1200

aagttggaca gggagacacc tcaagtcgag tcggttaccg cattgtggaa aggcgctgat 1260

tggccggaac gggaggcata tgacctcctt ggtataattt tcaaaggcca ccctaatctt 1320

acgcgaatcc ttatgccaga agattgggtg ggttacccgc tgcgaaagga ctatgagcct 1380

tatgacgtgg aggtgtaagt gtggccctta cgtctatcgt ggattgcgcg tcaccgcaag 1440

tggtcactgt ccccccggtc ggggaaagct ttgatagggc agagcgtcaa gttaatgacg 1500

ttttgggagc tgttttccag agcaatctta atctctcagg ggtccctgtg tcagagaatc 1560

ggcttagaca ttccttgtgt caaaaccaca agtccaacta cacttaggtg c 1611

<210> 22

<211> 1611

<212> DNA

<213> 第16次迭代后最优序列(Artificial)

<400> 22

atgtctaatc ccaataagga tctcgaggaa ttgaagaaag aggccgcccg gcgggcgaag 60

gaggaggcta gaaaacgcct agttgctaag cacgaagcgg agatttctga attggaagag 120

gaagatcaag agaaagagaa ggccctccca aagaatgacg atatcactat tgaagaggca 180

aagcgtcgag ccgcggctgc agcgaaggca aaagttaccg ccttagcaaa gcagaagagg 240

gaagggaccg aggaggtcac tgaggaagag aaggcgaaag ctaaagccaa ggcagccgcg 300

gctgccaagg ccaaagcagc agcactcgcc aaacaaaaaa gagagggcac cgaggaggtt 360

acggaggagg agaaagcgaa agccaaggca aaagcagcag ccgctgcgaa ggctaaagct 420

gcgactcttg ctaagcaaaa acgtgaaggg attgaagaag tcactgaaga ggagaaggcg 480

aaagcgaagg ctaaggctgc cgctgcggcg aaagcaaaag tggctgccct cgcaaaacaa 540

aagcgcgagg gtatcgaaga ggtcacggag gaagaaaaag ctaaagctaa agccaaggcg 600

gctgcactcg caaagcagaa gagggaaggt accgaagaag taacagagga ggaaaaagca 660

aaagcaaaag caaaagccgc ggccttggca aaacagaaga gggaaggaac cgaggaagtc 720

acagaggagg agaaagctaa agccaaggct aaggcggcag cgcttgcgaa gcagaaagct 780

agtcaaggtg acggcgatag cggcgacgaa aaagctaagg cgattgcagc agctaaagct 840

aaggccgcag ctgccgcccg ggcgaaaaca aaaggagcag aaggtaagaa agaggacgaa 900

cctaagcaag aggagttgtc agttaatcag ccatacctga atcagtacgt tgaggcaata 960

agagagaaac tgggcgaggg cgctctcgta gatagctaca tcaacaagtt aagcaaagac 1020

gttcctacct tagtagtcga cccagagaag tactacgaag ttatggagtc actaagattc 1080

catgaaggac tagcgttcga ctacatgtct gagctacacg ctactgactt tgtaacacat 1140

atggaggtgt atgtccatct gttctcatac agcaaaaaac agtctgtcgc agttaaggtg 1200

aagcttgata gagagacccc gcaagtcgaa agcgttacgg ccctgtggaa aggggcggac 1260

tggcctgaac gagaagcgta tgacctactc ggtatcatat tcaaaggcca cccaaactta 1320

acacgcattc ttatgcctga agactgggta ggctacccgc ttaggaaaga ctatgagccg 1380

tacgacgtcg aggtctgagt ctggcccctg cgtctttcct ggatagcacg acaccgtaag 1440

tggagtttaa gcccaaggag cgggaaagcg ttaatcgggc aatccgtcaa actcatgacc 1500

ttttgggaac tgttttcacg agcaattttg atcagtcaag gatctctgtg tcagcgtata 1560

ggtctggata taccgtgcgt caagacgacg tcaccgacga ctctgaggtg t 1611

<210> 23

<211> 1611

<212> DNA

<213> 第100次迭代后最优序列(Artificial)

<400> 23

atgtctaacc cgaataagga cttagaagag ttaaagaaag aggccgctag gcgggctaaa 60

gaagaggctc gtaagagact ggtggctaaa cacgaggctg agataagtga gctggaggag 120

gaagatcagg agaaagaaaa agctctgccc aaaaacgacg acatcaccat agaagaggcc 180

aagcgtcggg ccgctgcagc agctaaagca aaagttaccg cgttggcgaa gcagaaacgg 240

gaaggaacag aggaagtgac cgaggaagaa aaggctaaag ctaaggctaa agcggcagcc 300

gctgcaaaag caaaggctgc tgctcttgcg aagcagaaac gagaaggaac cgaagaggta 360

accgaagaag agaaggcaaa ggctaaggca aaggctgcgg cagctgcgaa agcgaaggct 420

gcaactcttg caaaacagaa gcgagaaggg atcgaggaag tgactgagga ggagaaggct 480

aaagccaaag ctaaggcagc tgcggccgct aaagctaaag tcgcagcact cgctaagcag 540

aagagagaag gtatcgaaga agtgaccgaa gaggagaaag caaaagcgaa agctaaggca 600

gcagcccttg ctaaacaaaa gcgtgagggt accgaggaag taacagagga agagaaagca 660

aaggccaagg ccaaagctgc ggccttagca aagcagaaga gggaagggac cgaggaggtt 720

accgaagagg aaaaagctaa ggcaaaggcc aaggccgcag cccttgccaa acagaaagct 780

agccagggtg atggagatag tggagatgag aaggcgaaag caatagcggc cgcaaaagcc 840

aaagccgccg ccgcggcccg agccaagact aaaggcgccg agggtaagaa agaggatgag 900

cccaagcagg aagagctctc cgtgaatcag ccatacctca accagtacgt agaggctatc 960

agagagaagt taggcgaagg cgccctagtt gacagttata tcaacaagct ctcaaaggat 1020

gtgcccacac tcgtggttga tcctgaaaag tactatgaag tcatggagtc tctgagattt 1080

catgagggcc tcgcattcga ctatatgtcc gagctccatg cgacagattt tgtgacgcat 1140

atggaggttt acgttcacct gttctcctac tcaaagaagc aatccgtcgc cgtgaaggtt 1200

aagttggata gggaaactcc gcaggttgaa tcagtcactg cactctggaa gggtgcggat 1260

tggcctgagc gcgaggctta cgatctactt ggaatcattt tcaaagggca cccaaacctt 1320

actagaattc ttatgccgga agactgggtg ggatatcctt tgcgaaagga ctacgagcca 1380

tacgatgtag aagtgtgagt ctggccacta agactttcct ggatagcacg acatcgtaaa 1440

tggtctctct caccacgttc tggtaaagcg ctgattggac agtctgttaa acttatgaca 1500

ttttgggaac ttttttcacg tgctatcctc atatctcagg gttcgttatg tcaacgaatt 1560

ggcttggaca taccttgtgt aaagaccact tcgccaacta cgctccgctg t 1611

<210> 24

<211> 2052

<212> DNA

<213> Bacillusthuringiensis

<400> 24

atggcgaatc aaaataaaca cggaattatt ggcgcttcca attgtggttg tgcatctgat 60

gatgttgcga aatatccttt agccaacaat ccatattcat ctgctttaaa tttaaattct 120

tgtcaaaata gtagtattct caactggatt aacataatag gcgatgcagc aaaagaagca 180

gtatctattg ggacaaccat agtctctctt atcacagcac cttctcttac tggattaatt 240

tcaatagtat atgaccttat aggtaaagta ctaggaggta gtagtggaca atccatatca 300

gatttgtcta tatgtgactt attatctatt attgatttac gggtaagtca gagtgtttta 360

aatgatggga ttgcagattt taatggttct gtactcttat acaggaacta tttagaggct 420

ctggatagct ggaataagaa tcctaattct gcttctgctg aagaactccg tactcgtttt 480

agaatcgccg actcagaatt tgatagaatt ttaacccgag ggtctttaac gaatggtggc 540

tcgttagcta gacaaaatgc ccaaatatta ttattacctt cttttgcgag cgctgcattt 600

ttccatttat tactactaag ggatgctact agatatggca ctaattgggg gctatacaat 660

gctacacctt ttataaatta tcaatcaaaa ctagtagagc ttattgaact atatactgat 720

tattgcgtac attggtataa tcgaggtttc aacgaactaa gacaacgagg cactagtgct 780

acagcttggt tagaatttca tagatatcgt agagagatga cattgatggt attagatata 840

gtagcatcat tttcaagtct tgatattact aattacccaa tagaaacaga ttttcagttg 900

agtagggtca tttatacaga tccaattggt tttgtacatc gtagtagtct taggggagaa 960

agttggttta gctttgttaa tagagctaat ttctcagatt tagaaaatgc aatacctaat 1020

cctagaccgt cttggttttt aaataatatg attatatcta ctggttcact tacattgccg 1080

gttagcccaa gtactgatag agcgagggta tggtatggaa gtcgagatcg aatttcccct 1140

gctaattcac aatttattac tgaactaatc tctggacaac atacgactgc tacacaaact 1200

attttagggc gaaatatatt tagagtagat tctcaagctt gtaatttaaa tgataccaca 1260

tatggagtga atagggcggt attttatcat gatgcgagtg aaggttctca aagatccgtg 1320

tacgaggggt atattcgaac aactgggata gataacccta gagttcaaaa tattaacact 1380

tatttacctg gagaaaattc agatatccca actccagaag actatactca tatattaagc 1440

acaacaataa atttaacagg aggacttaga caagtagcat ctaatcgccg ttcatcttta 1500

gtaatgtatg gttggacaca taaaagtctg gctcgtaaca ataccattaa tccagataga 1560

attacacaga taccattgac gaaggttgat acccgaggca caggtgtttc ttatgtgaat 1620

gatccaggat ttataggagg agctctactt caaaggactg accatggttc gcttggagta 1680

ttgagggtcc aatttccact tcacttaaga caacaatatc gtattagagt ccgttatgct 1740

tctacaacaa atattcgatt gagtgtgaat ggcagtttcg gtactatttc tcaaaatctc 1800

cctagtacaa tgagattagg agaggattta agatacggat cttttgctat aagagagttt 1860

aatacttcta ttagacccac tgcaagtcct gaccaaattc gattgacaat agaaccatct 1920

tttattagac aagaggtcta tgtagataga attgagttca ttccagttaa tccgacgcga 1980

gaggcgaaag aggatctaga agcagcaaaa aaagcggtgg cgagcttgtt tacacgcaca 2040

agggacggat aa 2052

<210> 25

<211> 1914

<212> DNA

<213> cry9Aa优化后序列(Artificial)

<400> 25

atggctaatc aaaataagca tggtattatt ggtgctagta attgtggttg tgctagtgat 60

gatgctaagt atcctttagc taataatcct tatagtagtg ctttaaattt aaatagttgt 120

caaaatagta gtattttaaa tattaatatt attggtgatg ctgctaagga agctagtatt 180

ggtactacta ttagtttaat tactgctcct agtttaactg gtttaattag tatttatgat 240

ttaattggta agttaggtgg tagtagtggt caaagtatta gtgatttaag tatttgtgat 300

ttattaagta ttattgattt acgtagtcaa agtttaaatg atggtattgc tgattttaat 360

ggtagtttat tatatcgtaa ttatttagaa gctttagata gtaataagaa tcctaatagt 420

gctagtgctg aagaattacg tactcgtttt cgtattgctg atagtgaatt tgatcgtatt 480

ttaactcgtg gtagtttaac taatggtggt agtttagctc gtcaaaatgc tcaaatttta 540

ttattaccta gttttgctag tgctgctttt tttcatttat tattattacg tgatgctact 600

cgttatggta ctaatggttt atataatgct actcctttta ttaattatca aagtaagtta 660

gaattaattg aattatatac tgattattgt cattataatc gtggttttaa tgaattacgt 720

caacgtggta ctagtgctac tgctttagaa tttcatcgtt atcgtcgtga aatgacttta 780

atgttagata ttgctagttt tagtagttta gatattacta attatcctat tgaaactgat 840

tttcaattaa gtcgtattta tactgatcct attggttttc atcgtagtag tttacgtggt 900

gaaagtttta gttttaatcg tgctaatttt agtgatttag aaaatgctat tcctaatcct 960

cgtcctagtt ttttaaataa tatgattatt agtactggta gtttaacttt acctagtcct 1020

agtactgatc gtgctcgtta tggtagtcgt gatcgtatta gtcctgctaa tagtcaattt 1080

attactgaat taattagtgg tcaacatact actgctactc aaactatttt aggtcgtaat 1140

atttttcgtg atagtcaagc ttgtaattta aatgatacta cttatggtaa tcgtgctttt 1200

tatcatgatg ctagtgaagg tagtcaacgt agttatgaag gttatattcg tactactggt 1260

attgataatc ctcgtcaaaa tattaatact tatttacctg gtggtgatat tcctactcct 1320

gaagattata ctcatatttt aagtactact attaatttaa ctggtggttt acgtcaagct 1380

agtaatcgtc gtagtagttt aatgtatggt actcataaga gtttagctcg taataatact 1440

attaatcctg atcgtattac tcaaattcct ttaactaagg atactcgtgg tactggtagt 1500

tataatgatc ctggttttat tggtggtgct ttattacaac gtactgatca tggtagttta 1560

ggtttacgtc aatttccttt acatttacgt caacaatatc gtattcgtcg ttatgctagt 1620

actactaata ttcgtttaag taatggtagt tttggtacta ttagtcaaaa tttacctagt 1680

actatgcgtt taggtgaaga tttacgttat ggtagttttg ctattcgtga atttaatact 1740

agtattcgtc ctactgctag tcctgatcaa attcgtttaa ctattgaacc tagttttatt 1800

cgtcaagaat atgatcgtat tgaatttatt cctaatccta ctcgtgaagc taaggaagat 1860

ttagaagctg ctaagaaggc tgctagttta tttactcgta ctcgtgatgg ttaa 1914