一种检测布鲁菌感染的方法及其应用

摘要

本发明提供了一种检测布鲁菌感染的方法，即血清血细胞同步检测法。该检测法包括血清样本检测与活的血细胞样本检测两种操作步骤和一个配套试剂盒。此试剂盒可用于临床体外检测布鲁菌的血液样本前处理。血清血细胞同步检测法可用于布鲁菌感染早期临床快速诊断和治疗过程中指导用药，还可用于预后判定和布病流行病学调查等方面。本发明还可用于其他胞内寄生菌感染的早期临床快速诊断。

说明书

技术领域

本发明属于生物化学和分子生物学领域，具体涉及血清血细胞内布鲁菌DNA同步检测方法及其用途。

背景技术

布鲁氏菌病(简称布病)的早期快速诊断技术开发与推广普及应用是有效防控布病的关键技术之一。新型快速诊断技术的研究、标准化与应用是布病研究的重点和难点。我国法定的人、畜布病诊断涉及的技术方法有：用于初筛的平板凝集实验或虎红平板凝集试验、全乳环状试验，血清学检查的试管凝集试验、补体结合试验和抗人球蛋白试验，以及病原菌的分离，奶牛的布病诊断还可以用PCR法检测病原，但病原菌的分离需要的时间长、培养要求条件苛刻，技术复杂，检出率低，同时对实验人员的健康安全构成极大的威胁。传统的血清学方法存在假阳性和假阴性的现象。随着科学技术的发展，一些新的免疫学和分子生物学布病诊断技术得到发展，如间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)、竞争ELISA、补体结合ELISA、胶体金技术、荧光偏振试验以及各类的核酸诊断技术等，其中多数方法是基于检测血清中的抗布鲁菌抗体，抗体产生在细菌感染的数日之后，而且有相当比率的感染者不能检出抗体，耽误治疗；各类核酸诊断技术均基于全血，不能确定感染的布鲁菌是否存在于活细胞内。因此，上述方法虽然各具特色，但都存在一定的局限性，需要对这些诊断技术的敏感性、特异性以及在布病防治、监测中的应用价值进行综合评价。布鲁菌感染急待解决的重要问题有：布鲁菌感染早期临床快速诊断；药物疗效及预后判定；特异性检测活细胞内布鲁菌的布病流行病学调查等。到目前为止，尚没有一种独立的确诊布病的方法，布病的确诊大多是几种方法相结合，开发特异、灵敏的诊断方法仍是目前亟待解决的问题。另外，各种诊断技术在大规模的推广与应用之前，尚需制备标准化的配套诊断试剂和标准物质，以及建立相应的标准化操作流程。

以聚合酶链式反应(PCR)为代表的分子生物学技术因其具有较高的灵敏度和特异性，逐渐成为诊断布病的重要手段。自Fekete等首先成功报道应用PCR检测布鲁菌以来，已成为当今国内外研究布病的分子生物学热点。众多的PCR衍生方法被研发用于直接识别布鲁菌属，这些技术中的一部分已被证明对于人布病的诊断是有价值的。PCR技术不仅能够准确鉴定布鲁菌，在临床上可对分离培养和血清免疫学方法起到确证和辅助作用，而且在患者随访及治疗监测上较传统方法更具优势。有试验表明PCR方法比血清学方法和细菌培养的敏感性高。因为血细胞中出现细菌及细菌碎片要比特异性抗体出现的早，所以PCR方法检测布病能在短时间内出结果。而且这种方法与细菌感染途径、菌株的毒力无关，因此在早期诊断中具有无可比拟的优越性。

目前，PCR已被证明在急性和慢性疾病中比血培养敏感，比血清学试验特异，可以检测低至0.1pg DNA，此外，PCR技术可降低因具有高度传染危险的血培养造成的实验室获得性感染布鲁菌的风险，再者，布鲁菌DNA可在不同的临床标本包括血清、全血和尿液样品，不同的组织，脑脊髓液、滑液或胸腔积液、脓液中检测到，且上述标本容易获得，故已成为实验室检测布鲁菌的重要的诊断方法。

布鲁菌的发病机制认为，细菌自皮肤或粘膜侵入机体，随淋巴液到达淋巴结，被吞噬细胞吞噬。如吞噬细胞未能将菌杀灭，则细菌在胞内生长繁殖，形成局部原发病灶。细菌在吞噬细胞内大量繁殖导致吞噬细胞破裂，随之大量细菌进入淋巴液和血循环形成菌血症。在血液里细菌又被血流中的单核细胞吞噬并在其中繁殖，随血流带至全身，在肝、脾、淋巴结、骨髓等处的单核—吞噬细胞系统内繁殖，形成多发性病灶。

布病所累及的组织器官很广泛，但以单核—巨噬细胞系统、骨关节系统、神经系统等常见。所以血液样本常用来诊断人布病。DNA的提取是影响PCR广泛应用于检测布鲁菌的主要原因。造成PCR敏感度低的主要原因是模板DNA量少，因此，优化DNA的提取方法非常重要。最好的DNA提取试剂盒与差的DNA提取试剂盒提取的DNA量相差两个数量级，所以提取的DNA量少与DNA纯化试剂盒的关系很大。任何抑制DNA样品来源的都可能限制PCR方法的使用。然而，PCR抑制剂常常干扰结果。当样品中含有EDTA、RNA酶、DNA酶、血红素、肝素、苯酚、聚胺类、植物多糖类、尿液或者藻酸钙等时，或者样品污染都可引起假阴性反应。

PCR检测布鲁菌DNA还会受到样本采集时期是急性期、亚急性期还是慢性期，以及模板DNA提取的方法，模板之间的相互污染等各方面因素的限制。布鲁菌PCR主要以从样本中提取的DNA核酸为模板，所以核酸提取是PCR检测工作中必不可少的一步。过去的研究表明不同试剂盒提取核酸的效率有所不同，而且影响了荧光定量PCR的检测下限，检测下限的最大差别可达500倍。可见核酸提取效率(包括DNA量和DNA纯度)的高低会对PCR灵敏度产生巨大影响。探索更加高效的核酸提取方法，成为研究提高PCR检测灵敏度进而增加布病检出率的一种有效的手段。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的检测布鲁菌感染的方法，其可以同步检测血清血细胞内布鲁菌DNA。本发明提供了检测布鲁菌感染的血细胞样本检测的预处理试剂盒及其应用。

具体而言，在第一方面，本发明提供了检测布鲁菌感染的血细胞样本的预处理试剂盒，其包括分别装有SolutionⅠ、SolutionⅡ、SolutionⅢ、SolutionⅢ、SolutionⅣ和SolutionⅤ的容器，其中，SolutionⅠ为含368mg/42mL氯化钠的水溶液；

SolutionⅡ为含1g/125mL氯化钠、25mg/125mL氯化钾，177.5mg/125mL磷酸氢二钠和33.75mg/125mL磷酸二氢钾的水溶液；

SolutionⅢ为含42.399mg/35mL三羟甲基氨基甲烷、306.81mg/35mL氯化钠和102.284mg/35mL乙二胺四乙酸的水溶液；

SolutionⅣ为Triton X-100或为含35mg/0.35mL十二烷基硫酸钠的水溶液；

SolutionⅤ为双蒸水。

其中，优选SolutionⅢ可以调节pH至pH 8.0(25℃)。

在第二方面，本发明提供了本发明第一方面所述的试剂盒在制备用于检测布鲁菌感染的方法的试剂产品中的应用，其中，所述试剂盒检测血清布鲁菌DNA和血细胞布鲁菌DNA，即可进行血清血细胞内布鲁菌DNA同步检测。

优选在本发明第二方面的应用中，所述试剂盒用于富集外周血中布鲁菌感染的活细胞，并分离提取布鲁菌DNA。

优选在本发明第二方面的应用中，所述检测布鲁菌感染的方法通过活细胞中提取DNA来明确活的血细胞中是否存在布鲁菌DNA，从而说明被检测对象是否正处于感染状态。

优选在本发明第二方面的应用中，所述检测布鲁菌感染的方法用于体液中感染的活细胞布鲁菌DNA检测。

优选在本发明第二方面的应用中，所述检测布鲁菌感染的方法能够检测结核分枝杆菌感染或其他胞内寄生菌感染。

优选在本发明第二方面的应用中，血清和血细胞是同一布鲁菌感染者的同一次采取的外周血中的血清和活的血细胞。更优选其中，血细胞是外周血中活的单核细胞。

优选在本发明第二方面的应用中，检测血清布鲁菌DNA包含以下操作步骤：

取0.2mL血清于1.5mL Ep管中；室温，15000×g，离心15分钟；弃上清；加SolutionⅤ0.2mL于1.5mL Ep管中；震荡；室温，15000×g，离心10分钟；弃上清；加SolutionⅤ20μL于1.5mL Ep管中；震荡，瞬间离心；100℃，加热10分钟；置于冰中或－20℃冰箱中2分钟；室温，15000×g，离心10秒钟；吸取15或10μL上清液做模板，进行PCR(包括荧光定量PCR)反应。

其中，Ep管是Eppendorf管的简称，其是本领域技术人员所常用的。

优选在本发明第二方面的应用中，检测血细胞布鲁菌DNA包含以下操作步骤：

取1mL外周血；加SolutionⅠ1mL混匀；平铺到6孔细胞培养板上；37℃孵育1小时；弃掉上清液，用SolutionⅡ洗净至无红色；加SolutionⅡ1mL于细胞培养板孔内，反复吹打，洗下孔底部的沉淀物(即，活的单核细胞)至1.5mLEp管中；4℃500×g离心5分钟；弃上清；加SolutionⅢ800μL，充分混匀；加SolutionⅣ8μL，充分混匀；55℃孵育1小时；室温，8000rpm离心10分钟；弃上清；加SolutionⅤ800μL，充分混匀；室温，8000rpm离心10分钟；弃上清；加SolutionⅤ20μL，震荡，充分混匀；100℃，加热10分钟；室温，15000×g，离心10秒钟；吸取15或10μL上清液做模板，进行PCR(包括荧光定量PCR)反应。

更优选在本发明第二方面的应用中，检测血细胞布鲁菌DNA的操作步骤能把活的血细胞胞内含有的布鲁菌释放出来。

在第三方面，本发明提供了本发明第一方面所述的试剂盒在制备用于布鲁菌感染早期临床快速诊断的试剂产品中的应用。

在第四方面，本发明提供了本发明第一方面所述的试剂盒在制备用于布病治疗过程中用药指导和药物疗效判定的试剂产品中的应用。

在第五方面，本发明提供了本发明第一方面所述的试剂盒在制备用于布病的预后判定的试剂产品中的应用。

在第六方面，本发明提供了本发明第一方面所述的试剂盒在制备用于布病流行病学调查的试剂产品中的应用。

在第七方面，本发明提供了本发明第一方面所述的试剂盒在制备用于进行布鲁菌的科学研究的工具中的应用。

在第八方面，本发明提供了本发明第一方面所述的试剂盒在制备用于牧区农牧民的健康体检的试剂产品中的应用。

为促进PCR法在临床诊断布病方面的应用，本专利发明了一种检测布鲁菌感染的方法，即血清血细胞同步检测法。该检测法包括血清样本检测和血细胞(主要是指活的单核细胞)样本检测两种操作步骤和一个配套试剂盒。其中血细胞检测较全血检测有以下几个方面的优点：

1、充分利用了新鲜(一般指采血后3小时以内)单核细胞在固体(玻璃或聚苯乙烯)培养皿(或培养板)上能贴壁生长的特点，把占全血约45％的红细胞清洗出去，把单核细胞纯化浓缩出来，保证了PCR反应所需要的最低DNA模板量以及纯度(血红蛋白等PCR反应抑制剂在细胞破碎之前就能被彻底清除)。

2、收集好的单核细胞用试剂盒中的缓冲液充分悬浮后再加入表面活性剂裂解细胞膜，保证每一个细胞都能充分裂解，尽可能多的释放布鲁菌。发明人反复多次实验发现，如果按大量现有文献所述方法，把表面活性剂配制到缓冲液中对单核细胞进行裂解，按相同的步骤进行PCR，检测不到布鲁菌DNA，原因是单核细胞团加入含有表面活性剂的缓冲液后没等细胞充分悬浮，细胞团外侧的一层细胞就已经被裂解，裂解的细胞释放出粘性物质把细胞团紧紧包裹住，隔断了缓冲液与细胞团内侧的细胞进一步接触，使表面活性剂不能裂解更多的细胞膜，导致胞内细菌不能释放出来。

3、表面活性剂裂解细胞膜的主要原理是能溶解细胞膜中的膜蛋白，有非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂和两性表面活性剂。本发明选择非离子型表面活性剂Triton X-100作为细胞膜裂解剂，主要考虑到后续PCR，低浓度Triton X-100不影响PCR，0.01％Triton X-100促进PCR聚合酶反应，高浓度Triton X-100为PCR反应抑制剂。发明人反复多次实验发现，用1％Triton X-100裂解细胞膜恰到好处，既保证了对细胞膜的充分裂解，又保证了后续PCR产物电泳条带清晰，从加入表面活性剂后溶液由浑浊变得澄清这一现象就能明确的判断这一结论。用2％或以上Triton X-100裂解细胞膜，虽然细胞膜裂解更加充分，但后续PCR产物电泳条带模糊一片。选择阴离子型表面活性剂SDS(十二烷基硫酸钠)作裂解剂，只有在浓度很低(如0.1％)情况下，还得保证在清洗阶段时多次清洗，以尽可能除去残留的SDS，才能保证后续PCR，但这样一来回收的DNA模板量受到损失，SDS是PCR聚合酶反应的抑制剂，所以作为裂解剂不优先考虑。

4、把全血作为样本进行DNA提取，PCR反应阳性结果说明不了是血清中布鲁菌DNA还是血细胞中布鲁菌DNA得到扩增，也就不能判断是血清阳性还是血细胞阳性。本发明血细胞样本检测如果PCR结果是阳性的，就一定能明确判断是血细胞感染了布鲁菌，这是全血作为样本提取DNA再进行PCR反应所无法比拟的。

5、血细胞样本检测较全血样本检测PCR敏感度更高，因为经过本发明专利提供的试剂盒提取的DNA较市面上常规的血液基因组提取试剂盒亦或是细菌基因组提取试剂盒提取的DNA有二方面的优势，一方面能保证PCR阳性反应的最低DNA模板量，另一方面提取的DNA纯度高。对于DNA模板量而言，本发明血细胞样本处理量为1mL外周血，经本发明试剂盒分离、提取、浓缩全部回收DNA做模板进行PCR反应，保证了PCR阳性反应的最低DNA模板量。而全血样本经市售的DNA提取试剂盒处理量一般不超过0.2mL，否则后续操作非常麻烦，即使有意处理1mL外周血，经后续繁琐的纯化处理后DNA损失很大，很多情况下经PCR检测不到感染的布鲁菌，这就解释了临床全血样本PCR检测阳性率不高的现象。退一步而言，即使个别患者能检测到感染的布鲁菌DNA，由于繁琐的纯化操作也限制了这一方法普及应用到临床诊断。对于DNA纯度而言，本发明试剂盒提取的DNA至始至终都没有接触到血红蛋白等PCR抑制剂，在血细胞样本检测操作一开始就通过活的单核细胞贴壁培养而与含血红蛋白等PCR抑制剂的红细胞以及其他细胞分离，提取的DNA高度纯化。而全血样本用当前市售的DNA提取试剂盒处理，红细胞内含有的血红蛋白等PCR抑制剂与提取的DNA混在一起，后续需经过酚处理(苯酚:氯仿:异戊醇为25:24:1)，势必影响后续反应模板DNA的纯度。考虑到残留酚影响后续的PCR而不用酚处理，那也一定要经过其他的多次清洗等繁琐操作，也达不到PCR模板要求的纯度。

即使用世界上最好的Qiagen公司生产的UCP Pathogen Kits DNA提取试剂盒，QIAamp UCP Pathogen Kit能有效裂解及纯化全血样本病原菌核酸(见Qiagen公司产品说明书中的描述：QIAGEN provides QIAamp UCP Pathogen Kits for reliablepurification of nucleic acids from whole blood or DNA from a variety ofsample types.)，或多种类型的样本病原菌DNA。QIAGEN试剂盒具有有效裂解特点(Efficient lysis of microbial cells)，该试剂盒通过机械珠研磨原理裂解全血中含有的病原菌(These tubes provide efficient lysis of microbial cells with amechanical bead beating step.)，在机械株研磨裂解病原菌的同时也不可避免的研磨裂解如红细胞等真核细胞，很显然，病原菌DNA释放的同时，真核基因组DNA或血红蛋白等也都释放出来了，但都与我们欲检测的目标DNA混在一起。QIAGEN试剂盒也具有有效纯化特点(Efficient purification of nucleic acids)，即在消化掉真核DNA的同时把病原菌DNA纯化出来(The QIAamp UCP PurePathogen Blood Kit enables purification ofbacterial，fungal，viral，and free-circulating nucleic acids by paralleldepletion of human DNA.)，由此可以看出，Qiagen公司的DNA提取试剂盒提取纯化全血中病原菌DNA的过程为先裂解后纯化(Contaminants>先纯化后裂解，具体在上面已有详细的阐述。理论上讲，“血清血细胞同步检测”法对病原菌DNA提取纯化的更彻底(因为它把含杂质的血红细胞提前分离出去了，减少杂核酸和杂蛋白等与目标DNA混合的机会)。

6、血清血细胞同步检测较单一的血清样本检测或全血样本检测，检测范围更宽，对于早期感染患者、感染急性期患者或菌血症期患者，血清样本检测阳性率高，但对于治疗期患者或慢性期患者，由于联合应用抗生素治疗，血清中的细菌被杀灭清除，躲藏到单核细胞内的布鲁菌不能被清除，对于这种情况的患者，用全血样本做PCR检测不到。相反，本发明用血细胞样本PCR能很容易检测到。从实施例4就能得出这一结论。换言之，对于只有血清含菌、只有血细胞含菌或血清血细胞同时含菌这三种情况，用本发明专利血清血细胞同步检测法则很容易明确诊断出来。只进行单一的血清样本PCR检测或单一的全血样本PCR检测做不到这一点。

即使用Qiagen公司产品，也不能确定病原菌所在部位，即血清中或血细胞中或血清血细胞中同时兼而有之。本发明的“血清血细胞同步检测”能明确布鲁菌存在部位，即单纯血清中含有、单纯血细胞中含有、或血清血细胞中同时含有。明确布鲁菌存在部位在临床诊断以及治疗过程中意义重大。

7、用本发明提供的血细胞样本PCR检测，包括普通PCR、荧光定量PCR和其他各种衍生的PCR。普通PCR需要进行琼脂糖凝胶电泳，对胞内布鲁菌DNA具有半定量作用；荧光定量PCR不需要电泳就能直接定量布鲁菌DNA量。而全血样本用市售的基因组DNA提取试剂盒处理后进行PCR虽然也能够半定量或定量布鲁菌DNA，但结果不具有客观性，也就是说不同人检测结果不具有可比性，因为他们所使用的试剂盒千差万别，不同的试剂盒提取纯化病原菌的能力不同，检测结果也会不一致，这就是到目前为止全血样本PCR检测不能在布病临床诊断普及应用的根本原因。当然，血清样本PCR检测也能半定量或定量布鲁菌DNA，但目前没有普及应用到布病临床诊断的主要原因是血清样本PCR检测不能客观反映所有的临床布鲁菌感染的情况。

8、一定数量的临床治愈、没有任何症状的慢性或复发的布病患者，布鲁菌DNA载量仍可在数月甚至数年后被检测到。因此，布病患者对抗生素治疗的临床反应并不等同于病原菌被逐渐清除，关于部分临床治愈的患者，其存在低水平的布鲁菌DNA载量，可能与布鲁菌长期在人体单核-巨噬细胞内存在有关，并处于低水平的增殖，这也是布病患者复发的常见原因之一。本发明血清血细胞同步检测对鉴定慢性布病患者是一种比较有效的方法，尤其适合于那些有症状无并发症且用现有的检测方法不能鉴别出的患者。

本发明的血清血细胞同步检测法用于临床布鲁菌感染诊断具有以下特点：

1、“血清血细胞同步检测”能明确活的血细胞(具体指活的单核细胞)中是否存在布鲁菌DNA，活细胞中提取DNA，能说明被检测对象正处于感染状态，这比常规的临床单纯检测血清中抗体获得的诊断信息确切，抗体阳性只能说明被检测对象曾经有过感染或正处于感染期，不能确定正在感染状态。治疗中的慢性布病患者血清中通常检不出布鲁菌DNA，侵藏在活细胞中的布鲁菌，用抗生素等药物是杀不死的。慢性患者血清中不能检出布鲁菌DNA，但活的血细胞中如果检出布鲁菌DNA，说明患者仍处于感染状态。如果用Qiagen公司的DNA提取试剂盒检测相同的患者就不能明确获得以上这些临床诊断信息。比如患者经过治疗病原菌已经从活血细胞中清除，但布鲁菌仍有可能残留在血液中，这时如果用Qiagen公司的DNA提取试剂盒可能提取检测到布鲁菌DNA，相反，用“血清血细胞同步检测”法就检测不到布鲁菌DNA，如此，临床诊断结果就会大相径庭，两种方法在临床诊断中的科学性不言而喻，“血清血细胞同步检测”法更接近临床客观结果。

2、病原菌核酸检测，检测布鲁菌DNA，操作安全性高。目前用于临床诊断的靶标主要有病原菌分离培养，但该方法技术要求高，耗时，费力，阳性率低，对操作人员安全威胁大；血清学抗体检测，虽然方法多，但都不能独自用于临床诊断，需要几种方法配合在一起使用，诊断存在假阴性和假阳性。同时血清学检测方法可与多种微生物产生交叉反应，有时难以区分较低滴度的血清学检测结果是布鲁菌感染还是交叉反应；补体结合试验(CFT)和抗人免疫球蛋白试验(Coomb’s)操作繁琐，使用范围小；荧光偏振试验(FPA)以及胶体金免疫层析检测技术(GICA)不能区分自然感染和疫苗免疫诱导的血清学反应，故易出现假阳性和假阴性等，因此并未广泛应用。

3、提取外周血中布鲁菌DNA灵敏度高，普通PCR可检出10pg DNA量，荧光定量PCR可检出0.1pg DNA量。

4、用于后续临床诊断准确率高，几乎无漏检(传统的临床诊断方法RBPT、SAT、PAT、AGT、ELISA、胶体金等漏检率达约37％)。

5、可用于早期快速诊断(在特异性抗体产生之前即可检出布鲁菌)，使临床诊断无窗口期。

6、可为临床提供细菌在血清和血细胞中的分布信息，定量确定其感染程度。

7、可用于布病治疗过程中用药指导和药物疗效判定。

8、可作为是痊愈还是临床治愈的判定指标。

9、用本发明配套试剂盒提取的布鲁菌DNA结合探针荧光定量PCR(Cycling Probe法)，利用单核苷酸多态性(SNP)位点，可鉴别自然感染与疫苗接种感染。

10、可为布病流行病学调查提供更灵敏、更准确的新技术。

所以，本发明血清血细胞同步检测法的出现很大程度上弥补了现有DNA提取试剂盒处理的模板进行PCR检测普遍存在的假阴性等不足之处，使得PCR技术能更广泛的应用于临床诊断，并在监测布病患者病情、预后以及指导用药等方面有着广阔的应用前景，也为进行布鲁菌的科学研究提供了一种强有力的工具，因此，本发明血清血细胞同步检测技术将为布病临床诊断开创一个新领域，并且可成为临床上的布病诊断方法。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。

附图说明

图1显示了布鲁菌感染患者血清及血细胞PCR检测核酸电泳图，其中，1、2、3、4、5为5位临床就诊患者，左侧为血清布鲁菌DNA PCR检测图谱，右侧为分别对应的同一患者血细胞布鲁菌DNA PCR检测图谱；M为Marker；1.5％琼脂糖凝胶，5μL上样量；左右箭头所指为目标DNA条带。

具体实施方式

以下实验操作所用化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司，PCR反应试剂盒和琼脂糖凝胶购自Takara公司。所有实验均按分子生物学实验的常规操作。

实施例1试剂盒组分(以1套试剂盒能检测40个布鲁菌感染者所需要的量为例)

SolutionⅠ(42mL)：含368mg氯化钠；SolutionⅡ(125mL)：含1g氯化钠，25mg氯化钾，177.5mg磷酸氢二钠，33.75mg磷酸二氢钾；SolutionⅢ(35mL)：含42.399mg三羟甲基氨基甲烷，306.81mg氯化钠，102.284mg乙二胺四乙酸，25℃pH 8.0；SolutionⅣ(0.35mL)：Triton X-100；SolutionⅤ(45mL)：双蒸水。

实施例2血清样本检测操作步骤

取0.2mL血清于1.5mL Ep管中；室温，15000×g，离心15分钟；加SolutionⅤ0.2mL于1.5mL Ep管中；震荡；室温，15000×g，离心10分钟；弃上清；加SolutionⅤ20μL于1.5mLEp管中；震荡，瞬间离心；100℃，加热10分钟；置于冰中或－20℃冰箱中2分钟；室温，15000×g，离心10秒钟；吸取15(10)μL上清液做模板，进行PCR(包括荧光定量PCR)反应。

实施例3血细胞样本检测操作步骤

取1mL外周血；加SolutionⅠ1mL混匀；平铺到6孔细胞培养板上；37℃孵育1小时；用SolutionⅡ洗净(无红色)，倒掉上清液；加SolutionⅡ1mL于细胞培养板孔内，反复吹打，洗下孔底部的沉淀物(单核细胞)至1.5mL Ep管中；4℃500×g(约1000rpm)离心5分钟；弃上清；加SolutionⅢ800μL，充分混匀；加SolutionⅣ8μL，充分混匀；55℃孵育1小时；室温，8000rpm离心10分钟；弃上清；加SolutionⅤ800μL，充分混匀；室温，8000rpm离心10分钟；弃上清；加SolutionⅤ20μL，震荡，充分混匀；100℃，加热10分钟；室温，15000×g，离心10秒钟；吸取15(10)μL上清液做模板，进行PCR(包括荧光定量PCR)反应。

实施例4使用上述试剂和方法的少量样本的PCR检测结果

血清、血细胞样本从2016年12月8日-2017年1月5日间通辽市地方病防治站门诊患者收集。两种样本分别按本发明血清样本检测、血细胞样本检测操作步骤，并用本发明的配套试剂盒提取布鲁菌基因组DNA作PCR模板进行PCR反应。

以BCSP31作为目的基因，引物序列为：B4TGGCTCGGTTGCCAATATC，B5CGCTTGCCTTTCAGGTCTG。

PCR反应体系：B4(20μmol/L)，0.5μL；B5(20μmol/L)，0.5μL；dNTP Mixture(各2.5mmol/L)，2μL；10×Buffer(Mg²⁺plus)，2.5μL；Taq>

PCR反应条件：DNA 90℃预变性5分钟；90℃变性1分钟，53℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，40个循环；72℃10分钟；4℃冷却。

图1显示了布鲁菌感染患者血清及血细胞PCR检测核酸电泳图。从PCR检测核酸电泳图可以看出，5位就诊者都是布鲁菌感染患者。患者1血清检测为阴性，血细胞检测为阳性，而且为强阳性；患者2血清和血细胞检测均为阳性，都为强阳性；患者3血清阳性，而且为强阳性，血细胞阴性；患者4血清血细胞均阳性，但血清为极弱阳性，可以判定该患者血清中含有微量的布鲁菌，即血清细菌载量很低，而血细胞为强阳性，可以判定该患者血细胞细菌载量高，结合该患者的其他临床表现可以诊断可能为慢性布病患者，正处在治疗阶段；患者5结论同患者4，但从右侧箭头所指的DNA条带位置可以看出，患者5血细胞布鲁菌载量可能更高，也有可能感染的菌型区别于其他患者，需要进一步基因鉴定。

实施例5使用上述试剂和方法的300例布病患者血清血细胞同步检测与虎红平板凝集和试管凝集试验检测结果分析

1、样本来源2016年12月8日至2017年5月26日，到通辽市各医院就诊的疑似病例和有布鲁菌接触史自愿到通辽市地方病防治站进行布病抗体检测以及体检的人员，共计300人次。

2、检测试剂布病虎红平板凝集抗原试剂、布病试管凝集抗原试剂、布病的阳性血清和阴性血清均购自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，检测时试剂均在有效期内。

3、收集样本用带有分离胶促凝剂的采血管，坐位抽取检查对象全血5mL，30分钟后离心分离血清，于4℃保存备用。

4、血清血细胞同步检测所需材料与方法同实施例4。

5、SAT检测按照日常标准操作规程，用0.5％的石碳酸生理盐水对待检血清进行倍比稀释，每个管里留取液体0.5mL，再加入10倍稀释后的布病试管凝集抗原试剂0.5mL，最后形成的血清稀释度为1:25、1:50、1:100、1:200。以同样的方法做阴、阳性对照管和比浊管。充分震荡后置37℃恒温培养箱中培养20至22小时，取出室温放置2小时后观察结果。

6、RBPT检测按照日常标准操作规程，用移液器吸取30μL待检血清于干净的玻片上，弃掉吸头，换上新的吸头吸取30μL虎红平板凝集抗原试剂与血清充分混合，5分钟内观察结果。

7、结果判定按照中华人民共和国卫生部发布的2007版《WS269-2007布鲁氏菌病诊断标准》执行。SAT以(-)、1:25(+)、1:25(++)……1:200(++++)的形式记录血清稀释度和透明度；RBPT以(-)、(+-)、(+)、(++)、(+++)和(++++)的形式记录凝集度。对照分析结果如表1所示，300例检测结果如表2所示。

表1 300例对照分析结果

结论：

血清血细胞同步检测法布病确诊率279/300＝93％，布病排除率21/300＝7％。

抗体检测布病确诊率174/300＝58％。

表2 300例检测结果