用于逆转肿瘤对铂类抗癌药多药耐药性的两亲性药‑药纳米颗粒药物及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种用于逆转肿瘤对铂类抗癌药多药耐药性的两亲性药‑药纳米颗粒药物，为包括由组蛋白去乙酰化酶抑制剂与铂类抗肿瘤药物配位，且在水中自组装形成的纳米颗粒；进入肿瘤细胞后水解释放出上述两种药物。本发明的两亲性配合物在水中可自组装形成纳米颗粒，无需任何药物输送载体，该配合物自身就能实现药物输送，可有效地进入肿瘤细胞，降低血液中含硫配体对顺铂的阻滞作用，并减少对正常细胞的毒副作用；并可水解释放出组蛋白去乙酰化酶抑制剂和铂类抗肿瘤活性药物，达到两种药物协同逆转肿瘤对铂类药物多药耐药性和治疗癌症的目的。

说明书

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物技术领域，特别涉及一种用于逆转肿瘤对铂类抗癌药多药耐药性的两亲性药-药纳米颗粒药物及其制备方法与应用。

背景技术

恶性肿瘤(癌症)一直是导致世界各国死亡率上升的主要疾病。因此，如何有效治疗恶性肿瘤已成为全世界亟待解决的难题之一。目前，恶性肿瘤的治疗方法主要有以下几种：手术切除、化疗、放射及消融治疗、免疫及生物治疗。在诸多方法之中，化疗是最方便也是应用最广泛的有效治疗手段之一，而其中应用最广泛的一类就是铂类抗癌药物。

但是，大多数铂类抗肿瘤药物都存在如下缺点，如溶解性差、无选择性、对正常组织毒副作用大、血液易清除，施药一段时间后很容易产生多药耐药性，甚至有些肿瘤(例如结肠癌和非小细胞肺癌)本身对顺铂就具有耐药性等等。现有技术中，为解决溶解性和血液滞留时间短的问题，大量文献报道了采用纳米尺寸的物质作为抗肿瘤药物的输送载体，将药物送到癌细胞内，以达到杀死癌细胞的目的，具体包括水溶性聚合物(Advanced Drug Delivery Reviews 2009，61(13)，1214-1219)、脂质体(Anticancer Research 2006，26(2B)，1489-1493)、囊泡(Journal of the American Chemical Society 2005，127(23)，8236-8237)、聚合物纳米粒子(Bioconjugate Chemistry 2010，21(2)，328-337)和无机材料(ACS Nano 2008，2(10)，2057-2064；Journal of the American Chemical Society 2008，130(34)，11467-11476)等。然而，这些纳米尺寸的物质将药物送到癌细胞内后，不能高效克服癌细胞对铂类抗癌药物的多药耐药性，而且载体自身需要通过肾脏等器官排出体外，有可能引起肾脏等器官炎症或引起一些其它病症。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种用于逆转肿瘤对铂类抗癌药多药耐药性的两亲性药-药纳米颗粒药物，以解决现有技术中肿瘤对铂类抗癌药物的多药耐药性，以及纳米载体完成药物输送后其自身需要通过肾脏等器官排出体外，有可能引起肾脏等器官发生炎症或引起一些其它病症的问题。

本发明的第二目的是提供上述两亲性药-药纳米颗粒药物的制备方法，以解决现有技术中肿瘤对铂类抗癌药物的多药耐药性，以及纳米载体完成药物输送后其自身需要通过肾脏等器官排出体外，有可能引起肾脏等器官发生炎症或引起一些其它病症的问题。

本发明的第三目的是提供上述两亲性药-药纳米颗粒药物在制备抗肿瘤或耐药肿瘤药物中的应用，以解决现有技术中肿瘤对铂类抗癌药物的多药耐药性，以及纳米载体完成药物输送后其自身需要通过肾脏等器官排出体外，有可能引起肾脏等器官发生炎症或引起一些其它病症的问题。

本发明的技术方案如下：

一种用于逆转肿瘤对铂类抗癌药多药耐药性的两亲性药-药纳米颗粒药物，所述的两亲性药-药纳米颗粒药物为包括由组蛋白去乙酰化酶抑制剂与铂类抗肿瘤药物配位，且在水中自组装形成的纳米颗粒；所述的两亲性药-药纳米颗粒药物进入肿瘤细胞后，水解释放出所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂和所述的铂类抗肿瘤活性药物。

进一步优选，所述的两亲性药-药纳米颗粒药物的粒径小于100nm。

进一步优选，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂具有疏水性，可选伏立诺他(Vorinostat)、曲古柳菌素A(Trichostatin A)、N-羟基-N′-3-吡啶基辛二酰胺(Pyroxamide)、达诺司他(2-Propenamide)、3，4-二羟基苯甲羟肟酸(Dido)、苯丁酸(4-Phenylbutyric acid)、丙戊酸(2-Propylpentanoic acid)、正丁酸(N-Butanoic acid)、苯丁酸钠(Sodium Phenylbutyrate)、丙戊酸钠(Sodium 2-propylpentanoate)或正丁酸钠(Sodium butanoate)中的一种。

进一步优选，所述的铂类抗肿瘤药物相对亲水性，可选顺铂(Cisplatin)、反铂、反式二氯二吡啶合铂(trans-[PtCl₂(py)₂])或吡铂(Picoplatin)中的一种。

本发明还公开了上述的用于逆转肿瘤对铂类抗癌药多药耐药性的两亲性药-药纳米颗粒药物的制备方法，包括以下步骤：

(1)所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂与所述的铂类抗肿瘤药物配位，得到两亲性药-药配合物；

(2)所述的两亲性药-药配合物溶解在有机溶剂中，室温下将其滴入水中，除去有机溶剂，得到两亲性药-药纳米颗粒药物水溶液，再经后续处理，即得所述的两亲性药-药纳米颗粒药物。

进一步优选，步骤(1)的配位反应选自以下两种方法中的一种：

方法一：将所述的铂类抗肿瘤药物与硝酸银溶解在有机溶剂中，反应后去除氯化银沉淀，得到上清液为溶液一；将所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂与碱混合分散在有机溶剂中，反应后去除不溶物，得到上清液为溶液二；将所述的溶液一和溶液二混合反应后，去除有机溶剂，萃取得两亲性药-药配合物。

方法二：将所述的铂类抗肿瘤药物与硝酸银溶解在水中，反应后去除氯化银沉淀，得到上清液为溶液三；将所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂加入溶液三中反应，去除水，在乙醚中沉降得两亲性药-药配合物。

进一步优选，方法一中，所述的铂类抗肿瘤药物、所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂、硝酸银的摩尔比为1∶0.25～0.5∶0.95～1.05。

进一步优选，方法二中，所述的铂类抗肿瘤药物、所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂、硝酸银的摩尔比为1∶2～3∶0.95～1.05。

进一步优选，所述的有机溶剂为N，N′-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或甲醇中的一种；所述的碱为氢氧化钠或碳酸钠中的一种。

本发明还公开了上述的用于逆转肿瘤对铂类抗癌药多药耐药性的两亲性药-药纳米颗粒药物在制备抗肿瘤或耐药肿瘤药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

一、本发明的一种用于逆转肿瘤对铂类抗癌药多药耐药性的两亲性药-药纳米颗粒药物，通过配位键将组蛋白去乙酰化酶抑制剂和铂类抗肿瘤药物连接起来，实现两种药物在抗肿瘤上的协同作用，具有制备方法简单、产率高和效果明显等优点；

二、本发明的一种用于逆转肿瘤对铂类抗癌药多药耐药性的两亲性药-药纳米颗粒药物，在水中可以自组装形成粒径小于100nm的纳米颗粒，无需任何药物输送载体，该药物自身就能实现药物输送，通过肿瘤组织的通透性增强与滞留效应，该纳米颗粒药物可在肿瘤组织富集，更有效地进入肿瘤细胞，降低血液中含硫配体对顺铂的阻滞作用，并减少对正常细胞的毒副作用；在配合物纳米颗粒进入肿瘤细胞后，由于肿瘤细胞呈弱酸性，该配合物即可水解释放出组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)和铂类抗肿瘤药物，达到两种药物协同逆转肿瘤对铂类药物的多药耐药性，以达到治疗癌症的目的。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

图1为实施例1的两亲性药-药配合物的¹H-NMR核磁谱图；

图2为实施例1的两亲性药-药配合物的质谱图；

图3为实施例1的两亲性药-药配合物的红外光谱图；

图4为实施例1的两亲性药-药纳米颗粒药物的水合半径和透射电镜照片；

图5为实施例1的两亲性药-药纳米颗粒药物对肿瘤细胞生长抑制作用的示意图；

图6为实施例1的两亲性药-药纳米颗粒药物对耐药肿瘤生长抑制作用的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1：本实施例1的一种用于逆转肿瘤对铂类抗癌药多药耐药性的两亲性药-药纳米颗粒药物的制备，具体包括以下步骤：

(1)将300mg顺铂与169.87mg硝酸银溶解在10mL DMF中，反应24h后去除氯化银沉淀，得上清液为溶液一；将88.1mg伏立诺他与13.3mg氢氧化钠混合分散在5mL甲醇中，反应后去除不溶物，得上清液为溶液二；将溶液一和溶液二混合反应48h后，去除有机溶剂，用甲醇溶解去除过量的顺铂，重结晶得到两亲性药-药配合物，其结构式(一)如下；

结构式(一)的¹H-NMR核磁谱图、质谱图和红外光谱图分别如图1、图2和图3所示，测试溶剂为DMSO，分别对各个吸收峰进行了归属，并在谱图中标明，谱图1中各质子峰的归属如下：δ(ppm>max/cm^-11660vs(amide>

(2)将上述制得的两亲性药-药配合物溶解在二甲基亚砜中，在室温下将其滴入水中，除去二甲亚砜，得到两亲性药-药配合物的纳米颗粒水溶液，再经后续处理，得到两亲性药-药配合物的纳米颗粒药物。本实施例制备的基于伏立诺他-顺铂配合物的纳米颗粒药物的水合半径和透射电镜照片如图4所示，纳米颗粒粒径的平均尺寸在50纳米左右。

实施例2：本实施例2的一种用于逆转肿瘤对铂类抗癌药多药耐药性的两亲性药-药纳米颗粒药物的制备，具体包括以下步骤：

(1)将391mg吡铂与169.87mg硝酸银溶解在10mL DMF中，反应24h后去除氯化银沉淀，得上清液为溶液一；将100.7mg曲古柳菌素A与35.3mg碳酸钠混合分散在5mL甲醇中，反应后去除不溶物，得上清液为溶液二；将溶液一和溶液二混合反应48h后，去除有机溶剂，用甲醇溶解去除过量的吡铂，重结晶得到两亲性药-药配合物，其结构式(二)如下；

(2)将上述制得的两亲性药-药配合物溶解在甲醇中，在室温下将其滴入水中，除去甲醇，得到两亲性药-药配合物的纳米颗粒水溶液，再经后续处理，得到两亲性药-药配合物的纳米颗粒药物。本实施例制备的基于曲古柳菌素A-吡铂配合物的纳米颗粒药物的粒径平均尺寸在80纳米左右。

实施例3：本实施例3的一种用于逆转肿瘤对铂类抗癌药多药耐药性的两亲性药-药纳米颗粒药物的制备，具体包括以下步骤：

(1)将300mg顺铂与169.87mg硝酸银溶解在10mL DMF中，反应24h后去除氯化银沉淀，得上清液为溶液一；将42.3mg 3，4-二羟基苯甲羟肟酸与35.3mg碳酸钠混合分散在5mL DMF中，反应后去除不溶物，得上清液为溶液二；将溶液一和溶液二混合反应48h后，去除有机溶剂，用甲醇溶解去除过量的顺铂，重结晶得到两亲性药-药配合物，其结构式(三)如下；

(2)将上述制得的两亲性药-药配合物溶解在二甲亚砜中，在室温下将其滴入水中，除去二甲亚砜，得到两亲性配合物的纳米颗粒水溶液，再经后续处理，得到两亲性药-药配合物的纳米颗粒药物。本实施例制备的基于3，4-二羟基苯甲羟肟酸-顺铂配合物的纳米颗粒药物的粒径平均尺寸在40纳米左右。

实施例4：本实施例4的一种用于逆转肿瘤对铂类抗癌药多药耐药性的两亲性药-药纳米颗粒药物的制备，具体包括以下步骤：

(1)将300mg顺铂与169.87mg硝酸银溶解在20mL水中，反应24h后去除氯化银沉淀，得上清液为溶液三；将332mg丙戊酸钠加入到溶液三中反应48h后，去除水，在乙醚中沉降得到两亲性药-药配合物，其结构式(四)如下：

(2)将上述制得的两亲性药-药配合物溶解在二甲基亚砜中，在室温下将其滴入水中，除去二甲基亚砜，得到两亲性药-药配合物的纳米颗粒水溶液，再经后续处理，得到两亲性药-药配合物的纳米颗粒药物。本实施例制备的基于丙戊酸钠-顺铂配合物的纳米颗粒药物的粒径平均尺寸在45纳米左右。

实施例5：本实施例1的一种用于逆转肿瘤对铂类抗癌药多药耐药性的两亲性药-药纳米颗粒药物的制备，具体包括以下步骤：

(1)将391mg吡铂与169.87mg硝酸银溶解在10毫升DMF中，反应24h后去除氯化银沉淀，得上清液为溶液一；将42.3mg 3，4-二羟基苯甲羟肟酸与80mg氢氧化钠混合，反应后去除不溶物，得上清液为溶液二；将溶液一和溶液二混合反应48h后，去除有机溶剂，用甲醇溶解去除过量的吡铂，重结晶得到两亲性药-药配合物；其结构式(五)如下：

(2)将上述制得的两亲性药-药配合物溶解在甲醇中，在室温下将其滴入水中，除去甲醇，得到两亲性药-药配合物的纳米颗粒水溶液，再经后续处理，得到两亲性药-药配合物的纳米颗粒药物。本实施例制备的基于3，4-二羟基苯甲羟肟酸-吡铂配合物的纳米颗粒药物的粒径平均尺寸在60纳米左右。

本发明的一种用于逆转肿瘤对铂类抗癌药多药耐药性的两亲性药-药纳米颗粒药物对非小细胞肺癌细胞的影响实验。

实施例6

将实施例1制备得到的两亲性药-药配合物(顺铂与伏立诺他的摩尔量比值为2)的纳米颗粒药物和顺铂分别用细胞培养液配制成浓度分别为0、2.5、5、10、20、40、80μmol/L顺铂的量的溶液，对应的伏立诺他的浓度分别为0、1.25、2.5、5、10、20、40μmol/L，然后分别在A549细胞(非小细胞肺癌)和A549/CDDP细胞(耐顺铂的非小细胞肺癌)培养72小时后，采用MTT方法进行细胞活性测试，结果如图5所示。在普通的癌细胞上，相比于单药而言，两亲性药-药配合物纳米颗粒药物表现出极高的细胞毒性，而且针对于耐顺铂的非小细胞肺癌耐药细胞，单药基本没有效果，但两亲性药-药配合物纳米颗粒药物显示了很好的杀死癌细胞的能力。因此，本发明的两亲性药-药配合物纳米颗粒药物在逆转肿瘤对铂类抗癌药多药耐药性方面具有潜在的应用价值。

本发明的一种用于逆转肿瘤对铂类抗癌药多药耐药性的两亲性药-药纳米颗粒药物对对A549/CDDP肿瘤生长的影响实验。

实施例7

将接种了A549/CDDP和A549的荷瘤小鼠的瘤块剥离检测Ctr1蛋白的表达量，发现A549/CDDP荷瘤小鼠的表达量比A549荷瘤小鼠的低很多，说明耐顺铂的非小细胞肺癌模型肿瘤接种成功。由于药-药配合物纳米颗粒药物中的顺铂与伏立诺他的摩尔比为2，于是将荷瘤小鼠分为七组：生理盐水、顺铂(4mg/kg)、伏立诺他(1.8mg/kg)、顺铂和伏立诺他混合物(4mg/kg顺铂+1.8mg/kg伏立诺他)、药-药配合物纳米颗粒药物(5mg/kg，相当于4mg/kg顺铂和1.8mg/kg伏立诺他)、药-药配合物纳米颗粒药物(7.5mg/kg，相当于6mg/kg顺铂和2.7mg/kg伏立诺他)、药-药配合物纳米颗粒药物(10mg/kg，相当于8mg/kg顺铂和3.6mg/kg伏立诺他)。每3天注射一次，每次两百微升，同时对小鼠进行称重并对瘤块进行测量，结果如图6所示，从绘制出来的肿瘤体积曲线(图6a，d)可以发现：游离的顺铂对于耐药瘤没有抑制作用，而纳米粒子组随着浓度的增高肿瘤抑制效果越来越明显，并且对小鼠体重影响微乎其微(图6b)。值得一提的是，当注射浓度达到10mg/kg的药-药配合物纳米纳米颗粒药物时，到第30天，五只老鼠中有两只已经治愈，其他三只瘤块最终也很小。对治疗结束的瘤块进行剥离称重(图6c)，注射浓度为10mg/kg两亲性药-药配合物纳米颗粒药物的一组，肿瘤重量最轻。以上结果说明，该两亲性药-药配合物纳米颗粒药物在逆转肿瘤对铂类抗癌药多药耐药性方面具有极高的应用价值。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。