PCV2‑Cap特异性引物及其在PCV2‑Cap卵黄抗体制备中的应用

摘要

本发明提供一种PCV2‑Cap特异性引物及其在PCV2‑Cap卵黄抗体制备中的应用，本发明首先以NCBI登记的PCV2‑Cap蛋白基因序列为参考序列（登录号：KX253990），设计特异性引物对PCV2‑Cap‑F/PCV2‑Cap‑R并利用该引物对扩增Cap基因；并进一步应用基因工程方法表达出重组Cap蛋白，而后将重组Cap蛋白用于蛋鸡免疫，从而制备出具有高效价的PVC2‑Cap卵黄抗体。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种PCV2-Cap特异性引物及其在PCV2-Cap卵黄抗体制备中的应用。

背景技术

猪圆环病毒（Porcine circovirs，PCV）是迄今发现的一种很小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性病毒，PCV2为致病性病毒。PCV2可以引起多种疾病如断奶仔猪多系统衰竭综合征，猪皮炎肾炎综合征，繁殖障碍，先天性震颤等。我国自从2000年报道pcv2感染以来，全国各地开始陆续报道感染病例，郎洪武（2000）运用血清学的方法在我国的7个省市采集22个猪群样品，收集到的血清有559份，检测到阳性率高达42.9%，其中调查到经产母猪阳性率最高，为85.6%。周继勇（2004）等应用间接荧光技术，对浙江省的44个猪场2000-2002年的2039个样本进行检测，检测发现，浙江省44个猪场猪圆环病毒2型感染阳性率为100%，平均血清率为58.31%。该病对我国的养猪业造成的损失已不容忽视。目前对该病主要的防控措施以疫苗免疫为主，现在已经有了全病毒灭活疫苗和基因工程疫苗可以用来预防该病，但是疫苗的价格较高，许多猪场特别是小型猪场至今仍没有接种疫苗。因此，寻找低价有效的治疗方法防治该病十分重要。病毒感染治疗的最好的方法是特异性抗体，如何规模化的生产高效价的抗体是目前要解决的一个难题。卵黄抗体(yolk antibody)是禽类B淋巴细胞在抗原物质刺激下所产生并沉积在卵黄中能与特异抗原结合的一种免疫球蛋白，称为IgY。现已经证明特异性IgY对人及动物的许多疾病具有一定的预防和治疗作用，可用来预防和治疗多种没有特效药物的传染性疾病，在疾病的免疫检测和防治方面有突出的应用，还可以作为饲料的添加剂。

因此，本发明针对PCV2对我国养猪业影响巨大，治疗仍然存在无特效药的困境，利用基因工程技术获得具有产生中和抗原作用的Cap蛋白，以重组Cap蛋白作为抗原免疫非免疫蛋鸡，获得了高效价的卵黄抗体，比前人报导的效价提高了50倍左右。

发明内容

为克服现有全病毒灭活疫苗和基因工程疫苗价格高昂不利于大范围推广使用的问题，本发明提供一种PCV2-Cap特异性引物及其在PCV2-Cap抗体制备中的应用，本发明方法所制备的PCV2-Cap抗体效价高且生产制备方法简单。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种PCV2-Cap特异性引物，其核苷酸序列如下：

PCV2-Cap-F：5’-CGGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGC-3’，

PCV2-Cap-R：5’-GCGTCGACTTAGGGTTTAAGTGGGGGGT-3’。

本发明的另一目的在于提供一种PCV2-Cap特异性引物在PCV2-Cap卵黄抗体制备中的应用，其应用方法为：

（1）病毒DNA提取；

（2）PCR：以步骤（1）所提取的病毒DNA为模板，PCV2-Cap-F/ PCV2-Cap-R为引物进行PCR扩增；

（3）重组质粒的获得：步骤（2）PCR产物与pET-32a（+）连接构建重组质粒pET32a-Cap；

（4）转化及表达：将阳性克隆子pET32a-Cap转化至BL21(DE3)PlysS感受态细胞，诱导表达重组Cap蛋白；

（5）重组Cap蛋白的纯化；

（6）抗PCV2-Cap重组蛋白卵黄抗体的制备：取纯化后的重组Cap蛋白，稀释至终浓度1mg/ml，与弗氏不完全佐剂1:1混合均匀，免疫蛋鸡；四免时与弗氏完全佐剂1:1混合，四免后1周开始收取鸡蛋，化学法提取卵黄抗体并测定其效价。

本发明的优点在于：

1、采用设计的特异性引物，通过基因工程技术体外获得高纯度和高浓度的PCV2-Cap重组蛋白作为免疫源，比传统的全病毒疫苗的抗原量大大提高。

2、采用高浓度的重组PCV2-Cap重组蛋白免疫蛋鸡获得高效价的PCV2-Cap卵黄抗体，比报导的PCV2卵黄抗体效价提高了50倍左右。

附图说明

图1重组质粒的构建及鉴定结果；其中，A:PCR结果；B：重组质粒的PCR鉴定结果；C:重组质粒的酶切鉴定结果；

图2重组Cap蛋白的诱导表达及纯化结果；其中：A: 重组pET32a-Cap蛋白的诱导表达结果 B: 重组蛋白的纯化 C: Western blot结果。

具体实施方式

实施例1

以NCBI登记的PCV2-Cap蛋白基因序列为参考序列（登录号：KX253990），设计特异性引物对PCV2-Cap-F/ PCV2-Cap-R：其核苷酸序列如下：

PCV2-Cap-F：5’-CGGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGC-3’，

PCV2-Cap-R：5’-GCGTCGACTTAGGGTTTAAGTGGGGGGT-3’。

实施例2

PCV2-Cap特异性引物PCV2-Cap-F/ PCV2-Cap-R在PCV2-Cap抗体制备中的应用，其步骤为：

（1）病毒DNA提取：取-80℃储存的PCV2，使用病毒DNA提取试剂盒提取病毒DNA；

（2）PCR：以步骤（1）所提取的病毒DNA为模板，PCV2-Cap-F/ PCV2-Cap-R为引物进行PCR扩增；

（3）重组质粒的获得：步骤（2）PCR产物与pET-32a（+）连接构建重组质粒pET32a-Cap；

（4）转化及表达：经PCR鉴定、酶切鉴定以及测序鉴定确定阳性克隆子，将阳性克隆子pET32a-Cap转化至BL21(DE3)PlysS感受态细胞，诱导表达重组Cap蛋白；表达条件为将重组细胞于37℃、200rpm条件下过夜培养；

（5）重组Cap蛋白的纯化；诱导培养后的菌液12000 rpm离心1min，将沉淀用菌体100μLPBS重悬，利用超声进行破碎，5×SDS-loading buffer 95℃热变性10min后，SDS-PAGE 检测；

采用Ni层析柱方法纯化目的蛋白：利用ProteinlsoTM Ni-NTA Resin对带有His标签的pET32a-Cap重组蛋白进行分离纯化，分别用不同浓度的咪唑稀释液进行洗涤纯化，收集洗脱液；SDS-PAGE电泳对洗脱的蛋白纯度进行鉴定；用PCV2抗体进行Western blot鉴定；

（6）抗PCV2-Cap重组蛋白卵黄抗体的制备：

取纯化后的重组Cap蛋白，稀释至终浓度1mg/ml，与弗氏不完全佐剂1:1混合均匀，按以下免疫程序免疫蛋鸡：首免，皮下多点注射1mL；2周后二免，皮下多点注射1mL；再过2周后进行第3次免疫，皮下多点注射1mL ；7d后取重组Cap蛋白（终浓度1mg/ml）与弗氏完全佐剂1:1混合均匀，加强免疫；四免后7d-21 d后收取鸡蛋，化学法提取卵黄抗体，间接ELISA法检测抗体效价。

上述实验所得重组质粒的验证见图1重组质粒的构建及鉴定结果。从图1PCR扩增结果可知，PCR得到一条大小约为730bp的特异性条带(如图1A)，与预期的大小相符。PCR产物与PET-32a(+)连接，转化BL21过夜，挑选阳性单克隆菌落进行PCR鉴定，结果表明，阳性单克隆菌落可分别被目的基因引物，T7引物扩增出目的条带(如图1B)。同时，单酶切和双酶切均表明，重组质粒的构建被成功构建(如图1C)。

重组Cap蛋白的诱导表达及纯化结果见图2。其中，如图2A所示，经37℃, 8h , 1.0mmol/L IPTG诱导后，清晰可见大小约为43ku左右的特异性条带，空白菌诱导组和pET-32a空载体菌诱导组均未见该特异性条带，且诱导的pET32a-Cap重组质粒菌诱导组条带亮度明显大于未诱导的pET32a-Cap重组质粒菌组。诱导菌液超声破碎后，通过Ni-NTA亲和层析柱纯化结果如图2B所示,表明200mM的咪唑浓度的洗脱液纯化效率最高，得到的纯度与浓度均达到最佳的纯化效果。图2C则显示以PCV-2阳性血清作为一抗的Western blot分析表明，重组蛋白在大小约为44Ku处出现了一条特异性的条带，而pET-32a空载体菌组并未出现相应的特异性条带，由此表明，重组蛋白即为预期的蛋白。

实施例3

卵黄抗体的效价检测结果

取四免后蛋鸡所下的鸡蛋，提取卵黄抗体，间接ELISA法检测结果表明，重组蛋白免疫蛋鸡后7天，14天和21天的抗体效价分别为1:8000，1:16000，1:64000。可见，用PCV2重组Cap蛋白可制备高效价的卵黄抗体。

表1卵黄抗体的效价检测结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> PCV2-Cap特异性引物及其在PCV2-Cap卵黄抗体制备中的应用

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> PCV2-Cap-F

<400> 1

cgggatccat gacgtatcca aggaggc 27

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> PCV2-Cap-R

<400> 2

gcgtcgactt agggtttaag tggggggt 28