复合卡拉胶酶及利用该酶制备硒化卡拉胶寡糖的方法

摘要

本发明涉及复合卡拉胶酶及利用该酶制备硒化卡拉胶寡糖的方法，其中，每克所述复合卡拉胶酶含有酶活力为2.1×10

说明书

技术领域

本发明涉及复合卡拉胶酶及利用该酶制备硒化卡拉胶寡糖的方法，属于海洋生物技术领域。

背景技术

目前，对硒作为生命中必需微量元素的认识正日益加深。硒是人体必需的微量元素，被称为“抗癌之王”，补硒有助于提高机体免疫力，增强体质的功效。同时硒又是一个极毒元素，动物对硒的营养需要范围是0.1～0.3ppm，2～10ppm将引起慢性中毒，而超过10ppm时会引起急性中毒以致突然死亡。当今人类社会食物链中硒含量在减少，动物和人体缺硒病增加，缺硒趋势正在加剧。显然，寻求低毒而生物利用度好的硒化物对于进一步揭示硒的生理功能及其在人类保健事业上的应用是十分有意义的。

在自然界中的硒可分为无机硒和有机硒。无机硒毒性大，不易吸收，生物利用率低，其应用受到限制；相对而言有机硒毒性低、副作用小，更易被人体吸收，能够更好地发挥硒的生理活性。CN1121414C通过人工合成的方法使无机硒和海洋多糖结合，将无机硒转化为有机硒化合物，已成功制备出新的硒化多糖化合物。该案提供了海藻硒多糖海洋新药产品及其制备方法，该新药对肾衰、血管病和肿瘤具有显著疗效，是低毒甚至无毒的药物。其中具有抗病毒、抗HIV、抗肿瘤和提供机体免疫等广泛功能的硒化褐藻多糖，硒化壳聚糖和硒化红藻多糖，其中硒化红藻多糖卡拉胶还对淋巴细胞的分裂有显著的促进作用，具有抑制痛痒病毒复制作用。

CN1121414C制备的硒化多糖化合物作为我国唯一海洋硒营养强化剂，现已在食品和保健品领域实现工业化生产，主要产品是硒化红藻多糖，即硒化卡拉胶。虽然硒化卡拉胶具有很好的提高机体免疫力和抗肿瘤作用，且无毒副作用，但由于其分子量大，生物利用率相对较低，限制了硒化卡拉胶的应用。卡拉胶是从某些红藻的细胞壁中提取到的一种由1,3-β-D-吡喃半乳糖和1,4-α-D-吡喃半乳糖交替连接而成的线性硫酸多糖，而卡拉胶降解形成的寡糖具有多种新型生理活性，如抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节和促进植物生长等功能。与卡拉胶相比，卡拉胶寡糖的生物利用率更高，且具有更多的生理活性。因此，亟需研发生物利用率高的硒化卡拉胶寡糖。

目前国外未见硒化卡拉胶寡糖的报道，国内有一篇关于硒化卡拉胶寡糖的研究报道，2014年第9期《化学与生物工程》发表的“硒化卡拉胶寡糖的制备及其抑制血管生成作用研究”，该文章由如下方法制备硒化卡拉胶寡糖：在酸性条件下，将亚硒酸钠、硫酸与卡拉胶进行反应；反应结束后，反应液减压浓缩并通过截留分子量为500的透析袋透析48h，再经乙醇沉淀、冷冻干燥，得到硒化卡拉胶寡糖。该化学方法制备硒化卡拉胶寡糖的反应条件不易控制，污染环境，利用透析袋截留得率低，制备的硒化卡拉胶寡糖硒含量低，在工业化生产中的难以应用。因此，本领域技术人员亟待寻找新的制备硒化卡拉胶寡糖的方式。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种复合卡拉胶酶，该复合卡拉胶酶可有效的水解硒化卡拉胶，为硒化卡拉胶寡糖的制备提供了一种新的方式。

本发明的另一目的在于提供应用该复合卡拉胶酶制备硒化卡拉胶寡糖的方法。

本发明的再一目的在于提供由所述方法制备得到的硒化卡拉胶寡糖及其应用。

为实现上述目的，本发明一种复合卡拉胶酶，其中，每克所述复合卡拉胶酶含有酶活力为2.1×10⁵～1.7×10⁶U的κ(Kappa)型卡拉胶酶、酶活力为6.0×10⁴～4.8×10⁵U的ι(Iota)型卡拉胶酶及酶活力为3.0×10⁴～2.4×10⁵U的λ(Lambda)型卡拉胶酶。

本发明实验研究表明复合卡拉胶酶具有协同降解硒化卡拉胶的作用，使得降解更加充分均匀，具有反应条件温和、易于控制、绿色环保和专一高效等优点，所制备的寡糖分子量更加均匀，且其收率远高于化学法和单一酶法制备的硒化卡拉胶寡糖。

优选地，根据不同类型卡拉胶酶的优化比例及其成本，本发明每克复合卡拉胶酶含有酶活力为2.1×10⁵～8.5×10⁵U的κ型卡拉胶酶、酶活力为6.0×10⁴～2.4×10⁵U的ι型卡拉胶酶及酶活力为3.0×10⁴～1.2×10⁵U的λ型卡拉胶酶。

根据本发明的具体实施方式，本发明所述复合卡拉胶酶由酶活力为2.7×10⁵～2.7×10⁶U/g的κ型卡拉胶酶原料、酶活力为2.3×10⁵～2.3×10⁶U/g的ι型卡拉胶酶原料及酶活力为2.0×10⁵～2.0×10⁶U/g的λ型卡拉胶酶原料复配得到；

优选地，所述κ型卡拉胶酶原料在20℃～45℃、pH6.0～9.0时的活性最高；

优选地，所述ι型卡拉胶酶原料在15℃～40℃、pH6.0～9.0时的活性最高；

优选地，所述λ型卡拉胶酶原料在25℃～45℃、pH6.0～10.0时的活性最高。

本发明所述κ型卡拉胶酶原料、ι型卡拉胶酶原料及λ型卡拉胶酶原料可商购或采用现有菌株按本领域常规技术手段获得。将上述量的各类酶在无菌环境下按一定的比例使用机械混配机混匀即可得到本发明所述复合卡拉胶酶。本发明的复合卡拉胶酶质量标准符合中华人民共和国国家标准GB 25594-2010对食品工业用酶制剂的卫生要求。其理化性质外观：白色粉末；细菌总数<50000个/g；大肠杆菌<30CFU/g；致病大肠杆菌未检出；沙门氏菌未检出。

根据本发明的具体实施方式，本发明所述κ型卡拉胶酶原料、所述ι型卡拉胶酶原料、所述λ型卡拉胶酶原料分别是由产κ型卡拉胶酶菌株、产ι型卡拉胶酶菌株或产λ型卡拉胶酶菌株产生并经纯化、干燥获得的。

本发明所述产κ型卡拉胶酶菌株、产ι型卡拉胶酶菌株及产λ型卡拉胶酶菌株为现有菌株，产生酶的条件，纯化以及干燥过程均为本领域常规技术，在此不另行赘述。

优选地，产所述κ型卡拉胶酶菌株为Pseudoalteromonas sp NJ62。

优选地，产所述ι型卡拉胶酶菌株为Pseudoalteromonas sp NJ64。

优选地，产所述λ型卡拉胶酶菌株为Pseudoalteromonas sp NJ276。

本发明所述菌株Pseudoalteromonas sp NJ62、菌株Pseudoalteromonas sp NJ64和菌株Pseudoalteromonas sp NJ276属于交替单胞菌目(Alteromonadales)，交替单胞菌科(Alteromonadaceae)，假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)。这些菌株均为现有菌株，菌株Pseudoalteromonas sp NJ62、Pseudoalteromonas sp NJ64及Pseudoalteromonassp NJ276可获自生物活性物质国家海洋局重点实验室，这些菌株的现有技术包括郑洲，缪锦来等，汞对南极细菌Pseudoalteromonas sp NJ62抗氧化酶活性的影响，海洋科学进展，第23卷增刊，2005年12月；高丛，缪锦来等，一株高产低温纤维素酶南极细菌的筛选、鉴定及酶学性质初步研究，化学与生物工程，第29卷第2期，2012年2月；郑洲，刘芳明等，南极石油烃降解嗜冷菌的筛选及其降解特性的研究，海洋科学进展，第25卷第3期，2007年7月。如前所述的在20℃～45℃、pH6.0～9.0时的活性最高可由Pseudoalteromonas sp NJ62菌株产生；在15℃～40℃、pH6.0～9.0时的活性最高的ι型卡拉胶酶原料可由Pseudoalteromonassp NJ64产生；在25℃～45℃、pH6.0～10.0时的活性最高的λ型卡拉胶酶原料可由Pseudoalteromonas sp NJ276产生。采用优选菌株可使酶解反应在温和的条件下进行。

另一方面，本发明提供一种硒化卡拉胶寡糖的制备方法，其中，所述方法包括使用有效催化量的本发明所述的复合卡拉胶酶来水解硒化卡拉胶。

根据本发明的具体实施方式，本发明所述方法包括将所述复合卡拉胶酶按照80～800U/ml的加入量加入到质量分数为5～20％的硒化卡拉胶水溶液中，于25～45℃反应6h～12h水解硒化卡拉胶，后处理得到所述硒化卡拉胶寡糖。优选地，所述后处理包括将水解后的反应液加热煮沸、冷却、蒸发得到硒化卡拉胶寡糖浓缩液，然后将该浓缩液通过3～9重量倍的乙醇沉淀、离心收集沉淀物，干燥得所述硒化卡拉胶寡糖。

具体地，例如用蒸馏水配制质量分数为5～20％的硒化卡拉胶溶液，然后按照80～800U/ml的加入量，加入复合卡拉胶酶溶液，于25～45℃反应6h～12h水解硒化卡拉胶，然后加热煮沸10min终止反应，冷却至室温，置于60℃旋转蒸发进行浓缩，获得硒化卡拉胶寡糖浓缩液，将获得的硒化卡拉胶寡糖浓缩液通3～9倍的乙醇沉淀，离心收集沉淀物，然后经60℃烘干后得到硒化卡拉胶寡糖。

本发明制备硒化卡拉胶寡糖的方法为的酶法，与现有技术化学制备方法有本质的不同。应用本发明所述复合卡拉胶酶水解硒化卡拉胶使得降解更加充分均匀，具有反应条件温和、易于控制、绿色环保和专一高效等优点，所制备的寡糖分子量更加均匀，且其收率远高于化学法和单一酶法制备的硒化卡拉胶寡糖。

再一方面，本发明提供一种硒化卡拉胶寡糖，其是由本发明所述方法制备得到的。优选地，所述硒化卡拉胶寡糖的分子量为900～2700Da，优选900～1500Da。

再一方面，本发明提供所述的硒化卡拉胶寡糖作为补硒剂在生产含硒水稻、茶叶或鸡蛋中的应用。

综上可知，本发明对3种不同类型的卡拉胶酶进行复配，并利用复配的卡拉胶酶复合酶降解制备硒化卡拉胶寡糖，不仅具有反应条件温和、易于控制、绿色环保和专一高效等优点，而且其收率远高于化学法和单一酶法制备的硒化卡拉胶寡糖。本发明制备的硒化卡拉胶寡糖不仅具有硒化卡拉胶多糖的全部生理活性，而且其生物利用率远高于硒化卡拉胶多糖，可作为新型的安全高效补硒剂应用于富硒鸡蛋、茶叶和大米等产业，开拓了海藻硒寡糖应用的新领域。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

以下实施例或对比例中的κ-卡拉胶酶原料、ι-卡拉胶酶原料、λ-卡拉胶酶原料分别由菌株Pseudoalteromonas sp NJ62、菌株Pseudoalteromonas sp NJ64和菌株Pseudoalteromonas sp NJ276(Pseudoalteromonas sp NJ62菌株、Pseudoalteromonas spNJ64及Pseudoalteromonas sp NJ276菌株均获自生物活性物质国家海洋局重点实验室)培养得到的三种卡拉胶酶，经硫酸铵沉淀、脱盐、离子交换层析等步骤纯化，具体步骤为：

分别将产κ-卡拉胶酶、ι-卡拉胶酶和λ-卡拉胶酶的Pseudoalteromonas sp NJ62菌株、Pseudoalteromonas sp NJ64及Pseudoalteromonas sp NJ276菌株南极低温菌接种到发酵培养基中，发酵培养基为2216E液体培养基，15℃震荡培养60h。发酵液9800×g离心10min，上清液为卡拉胶酶粗酶液；2216E液体培养基(g/L)：蛋白胨5，酵母粉1，陈海水配制；固体培养基是在富集培养基中加入1.5％琼脂粉。

卡拉胶酶的分离纯化：分别将获得的含有κ-卡拉胶酶、ι-卡拉胶酶和λ-卡拉胶酶的上清液，在冰浴中缓慢逐步加入硫酸铵至30％饱和度，边加边搅拌，加完后再继续搅拌1h，4℃静置5h；然后，4℃下12000×g离心20min，取上清液，继续加入硫酸铵至90％饱和度，边加边搅拌1h，置于4℃冰箱中静置过夜；4℃下12000×g离心20min，取沉淀，用pH8.0的Tris-HCl(0.05mol/L)-缓冲液溶解，透析。透析后的溶液上样于DEAE Sepharose FastFlow进行离子交换层析，层析用的缓冲液体系A液为0.05mol/L pH 7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠(PBS)缓冲液，B液为含有117g/L NaCl的0.05mol/L pH7.0的PBS，进行梯度洗脱，流速为进行梯度洗脱，分部收集洗脱液，测定个组分酶活力。将得到的活性组分超滤浓缩后进行凝胶过滤层析，填料为Superdex G75，用含有0.15mol/L NaCl的pH7.0的PBS(0.05mol/L)缓冲液平衡，以平衡液洗脱，以上操作均在4℃进行，将收集的活性部分真空冷冻干燥，获得κ-卡拉胶酶、ι-卡拉胶酶和λ-卡拉胶酶。用DNS法测定卡拉胶酶活力，其纯酶比活力分别为2742、2336及2075U/mg。酶活力定义为：每分钟催化产生1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

实施例1

硒化卡拉胶寡糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)复合卡拉胶酶的组成：κ-卡拉胶酶原料7重量份、ι-卡拉胶酶原料2重量份、λ-卡拉胶酶原料1重量份。在无菌环境下按一定的比例混匀。外观为白色粉末；细菌总数<50000个/g；大肠杆菌<30CFU/g；致病大肠杆菌未检出；沙门氏菌未检出。经DNS(二硝基水杨酸)法测试，每克所述复合卡拉胶酶含有酶活力为5.7×10⁵U的κ型卡拉胶酶、酶活力为1.4×10⁵U的ι型卡拉胶酶及酶活力为6.0×10⁴U的λ型卡拉胶酶。

(2)利用复合卡拉胶酶水解硒化卡拉胶：用蒸馏水配制质量分数为15％的硒化卡拉胶溶液，然后按照300U/ml的加入量，加入复合卡拉胶酶溶液，于35℃反应9h水解硒化卡拉胶，然后加热煮沸10min终止反应，冷却至室温，置于60℃旋转蒸发进行浓缩，获得硒化卡拉胶寡糖浓缩液。

(3)利用乙醇分级沉淀制备不同分子量的硒化卡拉胶寡糖：将获得的硒化卡拉胶寡糖浓缩液通过5重量倍的乙醇沉淀，离心收集沉淀物，然后经60℃烘干后得到硒化卡拉胶寡糖；制备的硒化卡拉胶寡糖收率为81％，分子量为900～1500Da。

实施例2

硒化卡拉胶寡糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)复合卡拉胶酶的组成：κ-卡拉胶酶原料8重量份、ι-卡拉胶酶原料1重量份、λ-卡拉胶酶原料1重量份。在无菌环境下按一定的比例混匀。外观为白色粉末；细菌总数<50000个/g；大肠杆菌<30CFU/g；致病大肠杆菌未检出；沙门氏菌未检出。经DNS法测试，每克所述复合卡拉胶酶含有酶活力为6.5×10⁵U的κ型卡拉胶酶、酶活力为6.9×10⁴U的ι型卡拉胶酶及酶活力为6.0×10⁴U的λ型卡拉胶酶。

(2)利用复合卡拉胶酶水解硒化卡拉胶：用蒸馏水配制质量分数为5％的硒化卡拉胶溶液，然后按照300U/ml的加入量，加入适量的复合卡拉胶酶溶液，于30℃反应9h水解硒化卡拉胶，然后加热煮沸10min终止反应，冷却至室温，置于60℃旋转蒸发进行浓缩，获得硒化卡拉胶寡糖浓缩液。

(3)利用乙醇分级沉淀制备不同分子量的硒化卡拉胶寡糖：将获得的硒化卡拉胶寡糖浓缩液通过5重量倍的乙醇沉淀，离心收集沉淀物，然后经60℃烘干后得到硒化卡拉胶寡糖；制备的硒化卡拉胶寡糖收率为76％，分子量为900～1800Da。

实施例3

硒化卡拉胶寡糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)复合卡拉胶酶的组成：κ-卡拉胶酶原料6重量份、ι-卡拉胶酶原料2重量份、λ-卡拉胶酶原料2重量份。在无菌环境下按一定的比例混匀。外观为白色粉末；细菌总数<50000个/g；大肠杆菌<30CFU/g；致病大肠杆菌未检出；沙门氏菌未检出。经DNS法测试，每克所述复合卡拉胶酶含有酶活力为4.9×10⁵U的κ型卡拉胶酶、酶活力为1.4×10⁵U的ι型卡拉胶酶及酶活力为1.2×10⁵U的λ型卡拉胶酶。

(2)利用复合卡拉胶酶水解硒化卡拉胶：用蒸馏水配制质量分数为5％的硒化卡拉胶溶液，然后按照300U/ml的加入量，加入适量的复合卡拉胶酶溶液，于30℃反应9h水解硒化卡拉胶，然后加热煮沸10min终止反应，冷却至室温，置于60℃旋转蒸发进行浓缩，获得硒化卡拉胶寡糖浓缩液。

(3)利用乙醇分级沉淀制备不同分子量的硒化卡拉胶寡糖：将获得的硒化卡拉胶寡糖浓缩液通过5重量倍的乙醇沉淀，离心收集沉淀物，然后经60℃烘干后得到硒化卡拉胶寡糖；制备的硒化卡拉胶寡糖收率为73％，分子量为900～2100Da。

实施例4

硒化卡拉胶寡糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)复合卡拉胶酶的组成：κ型卡拉胶酶原料3重量份、ι型卡拉胶酶原料4重量份、λ型卡拉胶酶原料3重量份。在无菌环境下按一定的比例混匀。外观为白色粉末；细菌总数<50000个/g；大肠杆菌<30CFU/g；致病大肠杆菌未检出；沙门氏菌未检出。经DNS法测试，每克所述复合卡拉胶酶含有酶活力为2.4×10⁵U的κ型卡拉胶酶、酶活力为2.8×10⁵U的ι型卡拉胶酶及酶活力为1.8×10⁵U的λ型卡拉胶酶。

(2)利用复合卡拉胶酶水解硒化卡拉胶：用蒸馏水配制质量分数为15％的硒化卡拉胶溶液，然后按照300U/ml的加入量，加入适量的复合卡拉胶酶溶液，于35℃反应9h水解硒化卡拉胶，然后加热煮沸10min终止反应，冷却至室温，置于60℃旋转蒸发进行浓缩，获得硒化卡拉胶寡糖浓缩液。

(3)利用乙醇分级沉淀制备不同分子量的硒化卡拉胶寡糖：将获得的硒化卡拉胶寡糖浓缩液通过5重量倍的乙醇沉淀，离心收集沉淀物，然后经60℃烘干后得到硒化卡拉胶寡糖；制备的硒化卡拉胶寡糖收率为71％，分子量为900～2700Da。

对比例1

本对比例以本发明的复合卡拉胶酶以及单一卡拉胶酶对比研究其效果，具体地：

本对比例采用复合卡拉胶酶制备硒化卡拉胶寡糖的方法包括以下步骤：

(1)复合卡拉胶酶的组成：κ-卡拉胶酶原料7重量份、ι-卡拉胶酶原料2重量份、λ-卡拉胶酶原料1重量份。在无菌环境下按一定的比例混匀。外观为白色粉末；细菌总数<50000个/g；大肠杆菌<30CFU/g；致病大肠杆菌未检出；沙门氏菌未检出。经DNS法测试，每克所述复合卡拉胶酶含有酶活力为5.7×10⁵U的κ型卡拉胶酶、酶活力为1.4×10⁵U的ι型卡拉胶酶及酶活力为6.0×10⁴U的λ型卡拉胶酶。

(2)利用复合卡拉胶酶水解硒化卡拉胶：用蒸馏水配制质量分数为15％的硒化卡拉胶溶液，然后按照300U/ml的加入量，加入适量的复合卡拉胶酶溶液，于35℃反应9h水解硒化卡拉胶，然后加热煮沸10min终止反应，冷却至室温，置于60℃旋转蒸发进行浓缩，获得硒化卡拉胶寡糖浓缩液。

(3)利用乙醇分级沉淀制备不同分子量的硒化卡拉胶寡糖：将获得的硒化卡拉胶寡糖浓缩液通过5重量倍的乙醇沉淀，离心收集沉淀物，然后经60℃烘干后得到硒化卡拉胶寡糖；制备的硒化卡拉胶寡糖收率为81％，分子量为900～1500Da。

本对比例分别采用单一卡拉胶酶的制备硒化卡拉胶寡糖的方法与前述采用复合卡拉胶酶制备硒化卡拉胶寡糖的方法相同，唯一不同之处在于分别以κ-卡拉胶酶、ι-卡拉胶酶及λ-卡拉胶酶替代复合卡拉胶酶，酶添加量也相同；反应条件及结果如下表1所示：

表1

实施例5

硒化卡拉胶寡糖的应用，包括以下内容：

(1)制备富硒大米，将制备的硒化卡拉胶寡糖作为一种安全高效补硒剂添加到水稻中，生产富硒大米。将制备的硒化卡拉胶寡糖配成0.5％的水溶液，叶面喷施在水稻，从而生产出富硒大米；或将硒化卡拉胶寡糖作为肥料施于稻田中，生产出富硒大米。

(2)制备富硒茶叶，将制备的硒化卡拉胶寡糖作为一种安全高效补硒剂添加到茶树中，生产富硒茶叶。将制备的硒化卡拉胶寡糖配成0.1％的水溶液，叶面喷施在茶树上，从而生产出富硒茶叶；或将硒化卡拉胶寡糖作为肥料施于茶园中，生产出富硒茶叶。

(3)制备富硒鸡蛋，将制备的硒化卡拉胶寡糖作为一种安全高效补硒剂添加到蛋鸡饲料中，生产富硒鸡蛋。将制备的硒化卡拉胶寡糖按照0.5wt％添加到蛋鸡饲料中，从而使蛋鸡生产出富硒鸡蛋。

最后说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的保护范围当中。