包含其中具有可控移动性的金属颗粒探针偶合的支持的脂质双层的人工细胞膜及使用其分析分子间相互作用的方法

摘要

本文公开了包含含有基底和结合在基底上的移动性降低的金属颗粒的支持的脂质双层(SLB)的人工细胞膜；包括该人工细胞膜并检查分子之间相互作用的分析装置或试剂盒，其中一个分子与结合于人工细胞膜的移动性降低的金属颗粒的表面结合，而其它分子与以低化合价结合于脂质的移动性降低的金属颗粒的表面结合；使用该分析装置检查分子之间相互作用的方法；用于通过等离激元散射测量来定量或定性地分析包含该人工细胞膜的靶标材料的试剂盒；以及能够使用具有不同等离激元散射长度和/或具有在支持的脂质双层上的不同迁移性的多个金属颗粒来检测多个靶标材料的多元分析试剂盒。根据包含含有与人工细胞膜附接的金属颗粒的支持的脂质双层的人工细胞膜，在脂质上的金属颗粒的流动性可以通过调节结合于所述金属颗粒的配体的数量而得以控制。因此，将在具有不同流动性的两种类型的金属颗粒上的用于分析其间相互作用的靶标分子引入到所述人工细胞膜上，由此通过等离激元散射来监控所述金属颗粒的移动，从而分析靶标分子之间的相互作用。在此情况下，可以进行使用本发明的人工细胞膜、等离激元散射波长和具有不同流动性的多个颗粒的同时检测和量化多个靶标材料的多元分析。

说明书

技术领域

本发明涉及包含含有基底和结合在基底上的移动性降低的金属颗粒的支持的脂质双层(SLB)的人工细胞膜；包括该人工细胞膜和检查分子之间相互作用的分析装置或试剂盒，其中一个分子与结合于人工细胞膜的移动性降低的金属颗粒的表面结合，而其它分子与以低化合价结合于脂质的移动性降低的金属颗粒的表面结合；使用该分析装置检查分子之间相互作用的方法；用于通过等离激元散射测量来定量或定性地分析包含该人工细胞膜的靶标材料的试剂盒；以及能够使用具有不同等离激元散射长度和/或具有在支持的脂质双层上的不同迁移性的多个金属颗粒来检测多个靶标材料的多元分析试剂盒。

背景技术

单纳米颗粒分辨率原位测量提供了动态单纳米颗粒的时间依赖性快照，由此纳米颗粒之间的异质相互作用可以得到阐明并且与整体(ensemble)进行区分。该方法揭示了关于胶态纳米晶体生长和组装的机制和反应动力学的直接和详细的信息。然而，包括电子显微镜在内的常规高分辨率成像方法典型地提供了结构的静态信息，而没有原位信息，并且需要在苛刻条件(例如真空)下的复杂设置和程序。出于这些原因，基于荧光团的单分子水平光学成像和分析方法主要用于获得关于分子间相互作用的动态信息，但遇到荧光团的闪烁和漂白的问题。此外，识别多种组分与荧光团标记的短程分子相互作用是高度挑战的，即使利用荧光共振能量传递，可测量的距离也被限于10nm，并且对于多组分系统，阐释变得困难。这些对于分子与纳米颗粒之间的相互作用的实时研究以及获得许多分析的可重复且可靠的定量数据而言是严重的问题。这些常规高分辨率光学方法的另一重要的问题是在溶液状态不能单独且可靠地分析和研究动态移动物体，这归因于它们不受控的三维移动和光学对所有受关注的物体的轨迹的无能力性。还应注意，当这些物体被固定在用于高分辨率光学分析的表面上时，不能研究这些物体的动态行为。出于这些原因，开发出允许以单颗粒灵敏度原位成像和分析自由移动纳米颗粒之间的相互作用的方法，会是极其有益的。为了获得更加可靠的信息以及通过研究相互作用的颗粒推导出新的原理，必须还由单颗粒水平定量数据来同时追踪来自多反应位点的相互作用。

发明内容

技术问题

因此，本发明人已经研究并努力发现用于以高分辨率观察在二维平面上的颗粒之间的相互作用、同时确保颗粒的自由移动的方法。由此，他们已经发现，链霉亲和素-生物素键在支持的脂质双层(SLB)上形成的金属颗粒的流动性能够通过调节该颗粒上的生物素化合价而得以调节，以及可以在单颗粒水平下以高分辨率来追踪和分析由于在金属颗粒的表面上形成的具有互补序列的DNA链之间的相互作用而造成的颗粒之间的相互作用的反应动力学。基于这些发现，已完成本发明。

技术方案

为了实现上述目的，本发明的第一方面提供了人工细胞膜，其包括：基底；以及布置在基底上的支持的脂质双层(SLB)，其中所述支持的脂质双层包含与第一配体结合的第一脂质，在所述支持的脂质双层内一些或所有脂质能够转移位置，并且包含与所述第一配体特异性结合的第二配体的第一金属颗粒通过第一配体与第二配体之间的结合而以100个/μm²至100,000个/μm²的密度与至少两个所述第一脂质结合，从而将所述支持的脂质层中的第一金属颗粒的移动性降低到0cm²/s至0.5×10^-8cm²/s。

本发明的第二方面提供了使用人工细胞膜检查分子A与分子B之间的相互作用的分析装置，其包括：第一方面的所述人工细胞膜，其中支持的脂质双层还包含与第三配体结合的第三脂质，所述第三配体与所述第一配体相同或不同；与所述人工细胞膜中的第一金属颗粒的表面结合的分子A；包含与所述第三配体特异性结合的第四配体的第二金属颗粒，其中所述第二金属颗粒通过所述第三配体与所述第四配体之间的相互作用而与至少一个所述第三脂质结合，并且与所述第一金属颗粒相比具有更高的移动性；以及与所述人工细胞膜中的第二金属颗粒的表面结合的分子B，其中具有更高移动性的所述第二金属颗粒接近所述第一金属颗粒，随后通过所述分子A与所述分子B之间的相互作用而被限制于所述第一金属颗粒。

本发明的第三方面提供了使用第二方面所述的分析装置检查所述分子A与所述分子B之间的相互作用的方法。

本发明的第四方面提供了通过由在人工细胞膜上的与分子A结合的第一金属颗粒和与分子B结合的第二金属颗粒的等离激元散射信号测定第一金属颗粒与第二金属颗粒之间的距离来测定分子A与分子B之间的结合的分析试剂盒，其包括：人工细胞膜，其包括基底，布置在所述基底上且其内的一些或所有脂质能够转移位置的支持的脂质双层，以及作为所述支持的脂质双层的一部分的与第一配体结合的第一脂质和与同所述第一配体相同或不同的第三配体结合的第三脂质；包含与所述第一配体特异性结合的第二配体的第一金属颗粒，其中所述第一金属颗粒能够通过所述第一配体与所述第二配体之间的相互作用而与至少一个所述第一脂质结合；以及包含与所述第三配体特异性结合的第四配体的第二金属颗粒，其中所述第二金属颗粒能够通过所述第三配体与所述第四配体之间的相互作用而与至少一个所述第三脂质结合。

本发明的第五方面提供了用于定性或定量地分析能够与分子A和分子B结合的靶标材料的试剂盒，所述试剂盒通过由在人工细胞膜上的与分子A结合的第一金属颗粒和与分子B结合的第二金属颗粒的等离激元散射信号测定第一金属颗粒与第二金属颗粒之间的距离来测定分子A与分子B之间的结合，所述试剂盒包括：人工细胞膜，其包括基底，布置在所述基底上且其内的一些或所有脂质能够转移位置的支持的脂质双层，以及作为所述支持的脂质双层的一部分的与第一配体结合的第一脂质和与同所述第一配体相同或不同的第三配体结合的第三脂质；包含与所述第一配体特异性结合的第二配体的第一金属颗粒，其中所述第一金属颗粒能够通过所述第一配体与所述第二配体之间的相互作用而与至少一个所述第一脂质结合；分子A，其与所述第一金属颗粒的表面结合并且与所述靶标材料的一部分特异性结合；包含与所述第三配体特异性结合的第四配体的第二金属颗粒，其中所述第二金属颗粒能够通过所述第三配体与所述第四配体之间的相互作用而与至少一个所述第三脂质结合；以及分子B，其与所述人工细胞膜中的第二金属颗粒的表面结合并且与靶标材料的未结合分子A的另一部分特异性结合。

本发明的第六部分提供了通过等离激元散射测量来定性或定量地分析i_max×m_max的量的靶标材料的多元分析试剂盒(i_max和m_max分别是以下变量i和m的最大值，并且各自独立地为1以上的整数，但不是i_max＝m_max＝1)，其包括：人工细胞膜，其包括基底，布置在所述基底上且其内的一些或所有脂质能够转移位置的支持的脂质双层，以及与配体I_i结合的脂质I_i和与配体M_m结合的脂质M_m(此处，配体I_i和配体M_m可以彼此相同或不同)；金属颗粒I_i，其包含与配体I_i特异性结合的配体I’_i，其中所述金属颗粒I_i通过配体I_i与配体I’_i之间的相互作用而与至少一个脂质I_i结合；分子A_i，其与金属颗粒I_i的表面结合并且与靶标材料的一部分特异性结合；金属颗粒M_m，其包含与脂质M_m特异性结合的配体M’_m，其中金属颗粒M_m通过配体M_m和配体M’_m之间的相互作用而与至少一个所述脂质M_m结合；以及分子B_m，其与所述人工细胞膜中的金属颗粒M_m的表面结合并且与靶标材料的未结合分子A的另一部分特异性结合，其中所述系列的金属颗粒I_i具有彼此不同的等离激元散射波长，并且所述系列的金属颗粒M_m具有彼此不同的等离激元散射波长。

本发明的第七方面提供了将颗粒集中于流体通道的特定区域的方法，其包括：在所述流体通道中制备支持的脂质双层，其中所述支持的脂质双层包含与第一配体结合的第一脂质，并且一些或所有脂质能够在所述支持的脂质双层中转移位置；在所述支持的脂质双层上施用包含与所述第一配体特异性结合的第二配体的第一颗粒；以及通过在所述流体通道中施用流体流而将所述第一颗粒转移到所述流体通道的特定区域中。

有利效果

根据包含含有与人工细胞膜附接的金属颗粒的支持的脂质双层的人工细胞膜，在脂质上的金属颗粒的流动性可以通过调节与所述金属颗粒结合的配体的数量而得以控制。因此，将在两种类型的具有不同流动性的金属颗粒上的用于分析其间相互作用的靶标分子引入到所述人工细胞膜上，由此通过等离激元散射来监测所述金属颗粒的移动，从而分析靶标分子之间的相互作用。在此情况下，可以进行使用本发明的人工细胞膜、等离激元散射波长和具有不同流动性的多个颗粒的同时检测和量化多个靶标材料的多元分析。

附图说明

图1是表明随着SLB栓系序列(tethering sequence)的摩尔分数而变的生物素化DNA序列在PNP探针上的平均数量的图。所述值通过对三种不同的独立制备的样品求平均值而获得。使用0.00125至0.0625的实验值来计算线性拟合。

图2示出表明生物素化合价对SLB上的PNP探针的扩散动力学的影响的图。图2A示出随时间间隔而变的PNP的均方位移，以及图2B示出SLB上等离激元探针的平均扩散系数。

图3示出表明随着生物素化合价改变，扩散系数分布的图。在图3A至3D中，每个探针的生物素化合价在图3A中为1，在图3B中为5，在图3C中为25，并且在图3D中为128。

图4示出表明在SLB上的PNP探针的图像的照片。图4A示出在STV涂覆的SLB上生物素化合价为486的I-PNP的暗视场显微镜图像。图4B示出在I-PNP修饰的SLB上的Cy3修饰的STV的荧光显微镜图像。比例尺为10μm。

图5示出随团聚程度(clustering degree)而变的PNP的散射强度分布的图。图5A示出单体的结果，图5B示出二聚体的结果，图5C示出三聚体的结果，以及图5D示出四聚体的结果。

图6是表明动态栓系在SLB上的纳米颗粒之间的相互作用的示意图。具体地，图6示出具有两种不同类型的探针的等离激元纳米探针栓系的SLB(移动和固定的等离激元探针，左图)以及DNA杂化诱导的二维团簇形成和等离激元耦合(右图)的示意图。

图7是表明动态栓系在SLB上的纳米颗粒的单纳米颗粒分辨率原位成像和分析的示意图。图7A和7B示出使用具有单纳米颗粒分辨率的暗视场显微镜的栓系在SLB上的等离激元纳米探针的大规模并行原位观察和分析(比例尺＝10μm)，以及图7C示出单等离激元纳米探针的散射强度和色谱的基于暗视场显微镜图像的分析。

图8示出SLB上相互作用的等离激元纳米颗粒的扩散动力学控制和光学分析的结果。图8A示出纳米颗粒移动性的基于生物素化合价的控制(增加的化合价导致较低移动性)，图8B示出等离激元纳米颗粒的典型的扩散轨迹线，以及图8C示出随着生物素化合价而变的等离激元纳米颗粒的动态比。

图9示出颗粒的非特异性相互作用的分析。图9A示出在不存在靶标DNA序列的情况下固定的等离激元探针位点的散射强度的变化的时间追踪和描述图，以及图9B示出其示意图。

图10A示出靶标DNA杂化诱导的等离激元纳米颗粒团簇的暗视场显微图像。用白色实线突出在固定的探针位点(白色虚线圈)内捕获的移动探针的15步轨迹，并且红色箭头指示每一轨迹的起始位置。每一轨迹步骤的时间间隔为0.188s。图10B示出随着每个团簇的探针数量而变的探针团簇的暗视场显微图像的红绿比图(R2＝0.970)。图10C示出纳米颗粒团簇的组装(顶部)和解组装(底部)的散射强度的典型的时间追踪。

图11示出表明通过M-PNP对修饰的SLB中的PNP团簇之间的单体PNP附接和并合之组合的团簇生长的照片。图11A示出两个单体PNP彼此接近，图11B示出两个PNP单体的远端光学重叠，图11C示出DNA杂化介导的PNP二聚体形成和随之而来的等离激元偶合，图11D示出PNP二聚体和PNP三聚体彼此接近，以及图11E示出PNP二聚体与PNP三聚体之间的并合。

图12示出等离激元纳米颗粒团簇生长动力学的原位成像和分析的结果。图12A示出大的SLB表面区域中纳米颗粒探针的DNA杂化诱导的等离激元偶合的大规模并行原位监测。在30nM靶标DNA序列加成之后于330s采集左侧图像。示出靶标DNA序列加成之前(0s)和之后(330s)白色虚线区域的放大图像。图12B示出在图12A中的暗视场显微图像中示出的10个单纳米颗粒团聚反应的时间依赖性散射强度图表。散射强度被归一化成单体探针的平均强度。每隔1s记录信号，持续330s。

图13示出等离激元纳米颗粒团簇的生长动力学及其图像。图13A示出在30nM靶标DNA序列下等离激元团簇生长的反应动力学图表(空心圆)。通过监测生长的团簇的散射强度的阶梯式增长(N＝150个颗粒)来检测每一单个探针加成反应。团簇形成动力学被拟合成三步连续反应模型(实线)。图13B示出团聚的等离激元纳米探针的透射电子显微镜图像。

图14示出用于向二聚体连续加成等离激元探针以形成三聚体或向三聚体连续加成等离激元探针以形成四聚体的2D位阻因素的计算方法。灰色区域代表下一颗粒加成的可能的接近角。在四聚体形成中，位阻因素被绘制成θ的函数，由第三颗粒的相对位置而测定(插图中的黑色实线)。平均ftri为0.375(红色虚线)。

图15示出SLB上的定量的基于等离激元偶合的DNA检测检定。图15A示出随着团簇中等离激元探针数量而变的散射强度校准用基准(R²＝0.999)。图15B示出4h内与300fM靶标DNA反应的PNP修饰的图案化SLB。图15C示出随着DNA浓度而变的靶标DNA检定结果的图表(黑色点)。用红色点绘制单碱基错配的DNA序列的检定结果。

图16是示出通过使用流体调节在图案化SLB上的金属纳米颗粒的移动性而控制纳米颗粒之间的相互作用的方法的示意图。

图17示出根据流体流动在SLB上形成的纳米颗粒的移动性。图17A示出根据流体流量的纳米颗粒的移动轨迹，以及图17B示出根据流体流量的纳米颗粒的漂移速率。

图18示出在SLB上形成的纳米颗粒的移动性。图18A和18B分别示出通过流体流动在图案SLB上移动和集中的金纳米颗粒和银纳米颗粒的暗视场显微镜图像。

图19示出通过流体流动在金纳米颗粒图案化的SLB上集中的金属纳米颗粒的散射谱的变化。图19A示出在多种盐(NaCl)浓度下金属纳米颗粒的散射谱，图19B示出金属纳米颗粒的暗视场显微镜图像，以及图19C示出等离激元散射峰和ζ电势的变化。

图20示出通过流体流动在银纳米颗粒图案化的SLB上集中的金属纳米颗粒的散射谱的变化。图20A示出在多种盐(NaCl)浓度下金属纳米颗粒的散射谱，图20B示出金属纳米颗粒的暗视场显微镜图像，以及图20C示出等离激元散射峰和ζ电势的变化。

图21是表明使用基于纳米颗粒栓系的人工细胞膜的细胞界面平台的分析细胞的信号传递机制的方法的示意图。

图22示出为了展示出不同颜色而分别以不同尺寸和不同形状制造的纳米颗粒的暗视场显微镜和电子显微镜图像，及其吸收/散射谱。

图23A示出为了分别固定在支持的脂质双层上或通过调节化合价自由移动而制造的三色金属颗粒的9种组合。

图23B示出为了同时检测9种类型的miRNA而与选自固定的三色金属颗粒和自由移动的三色金属颗粒的各靶标分子非特异性结合的颗粒对。

图23C示出作为使用三色金属颗粒的多元分析的实例的三色金属颗粒在不同时间(0min和60min)的暗视场显微镜图像。

图23D是示出通过同时检测9种类型的miRNA的相对于时间的每一靶标材料的累积化合价的图。

图24A示出固定的红色纳米颗粒和与固定的红色纳米颗粒相互作用的可移动的红色纳米颗粒的暗视场显微镜图像，以及相对于时间的在固定的红色纳米颗粒的位置处三色等离激元散射谱的强度的变化。

图24B示出固定的绿色纳米颗粒和与固定的绿色纳米颗粒相互作用的一个或多个可移动的红色纳米颗粒的暗视场显微镜图像，以及相对于时间的在固定的绿色纳米颗粒的位置处三色等离激元散射谱的强度的变化。

图24C示出固定的蓝色纳米颗粒和与固定的蓝色纳米颗粒相互作用的一个或多个可移动的红色纳米颗粒的暗视场显微镜图像，以及相对于时间的在固定的蓝色纳米颗粒的位置处三色等离激元散射谱的强度的变化。

图25A示出固定的红色纳米颗粒和与固定的红色纳米颗粒相互作用的一个或多个可移动的绿色纳米颗粒的暗视场显微镜图像，以及相对于时间的在固定的红色纳米颗粒的位置处三色等离激元散射谱的强度的变化。

图25B示出固定的绿色纳米颗粒和与固定的绿色纳米颗粒相互作用的一个或多个可移动的绿色纳米颗粒的暗视场显微镜图像，以及相对于时间的在固定的绿色纳米颗粒的位置处三色等离激元散射谱的强度的变化。

图26A示出固定的红色纳米颗粒和与固定的红色纳米颗粒相互作用的一个或多个可移动的蓝色纳米颗粒的暗视场显微镜图像，以及相对于时间的在固定的红色纳米颗粒的位置处三色等离激元散射谱的强度的变化。

图26B示出固定的绿色纳米颗粒和与固定的绿色纳米颗粒相互作用的一个或多个可移动的蓝色纳米颗粒的暗视场显微镜图像，以及相对于时间的在固定的绿色纳米颗粒的位置处三色等离激元散射谱的强度的变化。

图26C示出固定的蓝色纳米颗粒和与固定的蓝色纳米颗粒相互作用的一个或多个可移动的蓝色纳米颗粒的暗视场显微镜图像，以及相对于时间的在固定的蓝色纳米颗粒的位置处三色等离激元散射谱的强度的变化。

图27是示出具有不同颜色(不同等离激元散射波长)和/或具有移动性的多个颗粒的行为及其使用暗视场显微镜的监测程序的示意图。

图28是示出通过互补序列识别的miRNA检测的实例(miR-21)的视图。

最佳实施方式

根据一方面，本发明提供了人工细胞膜，其包括：基底；以及布置在基底上的支持的脂质双层(SLB)，其中所述支持的脂质双层包括与第一配体结合的第一脂质，在所述支持的脂质双层内一些或所有脂质能够转移位置，以及包含与第一配体特异性结合的第二配体的第一金属颗粒通过第一配体与第二配体之间的结合而以100个/μm²至100,000个/μm²的密度与至少两个第一脂质结合，从而将支持的脂质层中的第一金属颗粒的移动性降低到0cm²/s至0.5×10^-8cm²/s。支持的脂质层中的第一金属颗粒的移动性可以被降低到0cm²/s至0.1×10^-8cm²/s，并且更优选地被降低到0cm²/s至0.01×10^-8cm²/s，其不能被显微镜检测到。当其移动性为0时，脂质是完全静止的。

如本文所用，术语“基底”是能够支持脂质双层的支持物，并且可以是具有预定形状的固体基底。优选地，基底可以是由玻璃、金、银、铂或TiO₂制成的透明固体基底，或可以是由丙烯酸聚合物如聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚醚砜(PES)、聚环烯烃(PCO)、聚氨酯或聚碳酸酯(PC)制成的透明固体基底。此外，作为基底，还可以使用涂覆有能被水合的涂饰剂如纤维素的基底，只要可以维持被引入到涂膜上的脂质双层的流动性即可。

如本文所用，术语“支持的脂质层”可以是在准细胞结构如天然细胞膜或细胞核周围体外组装的脂质双层，可以是由合成或天然的脂质制成的一类模型脂质双层，并且可以被锚固于固体基底以具有改善的稳定性。因此，支持的脂质层可以用作不能用于本体溶液的表征工具。不同于通过以闭合圆形的细胞形式来组合脂质双层而获得的囊泡或细胞膜，支持的脂质层是在固体基底上形成的平面结构。因此，仅有脂质双层的上表面被暴露于游离的溶液。这样的配置对于脂质双层的研究具有优势和劣势。支持的脂质双层的主要优势是稳定性。支持的脂质双层(SLB)即使当其被暴露于快速的流动或振动时也不会严重地受损。在支持的脂质双层(SLB)中，与作为另一种模型脂质双层的黑脂膜(BLM)不同，孔的存在不会破坏整个双层。由于这样的稳定性，可以实施SLB实验数周至数月，而BLM实验被局限于数小时。SLB还是有利的，因为其不能用于自由漂浮的样本，或可以用作用于提供低分辨率的表征工具。

这些优势的最显著的实例是可以使用需要与样本直接物理相互作用的机械探测技术。为了在没有染料标记的情况下成像脂质的相分离、产生单蛋白质分子吸收的穿膜纳米孔的形成、以及具有亚纳米精确度的蛋白质的组装，使用原子力显微镜(AFM)。最近，为了直接检测单个脂质双层的机械性质，AFM用于在单个膜蛋白上进行能量波谱法(power spectroscopy)。因为细胞或囊泡的表面是相对软的并且依时间而变，因此前述研究在不使用SLB的情况下可能是困难的或可能是不可能的。

同时，即使在多种现代荧光波谱法中，也需要牢固支持的平面表面。消散场方法，例如全内反射荧光显微镜(TIRF)和表面等离激元共振(SPR)，可以以高灵敏度测量分析物的结合以及双层的光学性质，但仅当在具有光学功能的基底上支持样本时可以操作。仅适用于支持的双层的其它方法的实例包括荧光干涉差显微镜(FLIC)和反射干涉差显微镜(RICM)。

通常，SLB不直接与基底表面接触，而是通过非常薄的水层与基底分隔开。水层的尺寸和性质取决于基底的材质和脂质的类型，但是对于在二氧化硅上支持的两性离子型脂质，其为最广泛使用的实验系统，水层的厚度通常为约1nm。因为水层非常薄，在支持的脂质双层与基底之间存在大量的流体动力学偶合，因此支持的脂质双层具有比游离的脂质双层更低的扩散系数。在SLB中的一部分脂质可以被完全固定。在SLB中固定的脂质的分数为1％至5％。

通常，“人工细胞膜”可以是用于在试管中模拟体内细胞膜系统的含脂质膜的系统，该系统是为了研究体内细胞的表面上发生的细胞膜相关性现象如细胞膜蛋白质、穿膜蛋白质及与其相关的相互作用)人工制造的。提供人工细胞膜的模型系统的实例包括黑脂膜(BLM)、支持的脂质双层(SLB)、栓系双层脂质膜(tBLM)、囊泡、胶束、bicelle和纳米盘。特别地，SLB是用于鉴定生物物理学细胞膜现象的可用的装置。SLB可以由于化学组成的变化以及诸如pH和温度的环境变量而控制移动性和活性。

第一配体和第二配体可以各自选自抗原、抗体、配体、受体、螯合物、DNA、RNA、适配体、彼此特异性结合的化学分子及其组合，但不限于此。例如，当第一配体是抗体时，第二配体可以是对该抗体特异性的抗原。此外，可以通过用于形成抗体-抗原-抗体复合物的夹心免疫反应来将第二配体与第一配体结合，所述夹心免疫反应通过组合额外地结合于该抗原的所有抗体与该抗体而形成抗体-抗原-抗体复合物。作为另一实例，第一配体和第二配体可以是具有彼此互补的序列的DNA片段，在此情况下，第一配体和第二配体可以通过这些DNA片段的杂化而彼此结合。

在本发明的示例性实施方案中，作为第一配体的生物素通过使用生物素作为第一配体和使用生物素和链霉亲和素(生物素的受体)的结合物作为第二配体而附接于不含链霉亲和素的其它结合位点。

第一金属颗粒可以通过在脂质上的第一配体与在金属颗粒表面上的第二配体之间的特异性抗原-抗体结合、配体-受体结合、DNA杂化、螯合、共价结合、静电结合或化学反应结合而与脂质结合。在此情况下，第一金属颗粒可以包含多个第二配体，并且一个金属颗粒可以根据密度而与多个脂质颗粒结合。在此情况下，脂质膜上的单个脂质分子的运动是自由的。然而，在多个脂质分子与一个金属颗粒结合的情况下，其移动是相对受限的，因为与一个金属颗粒结合的多个脂质分子应在二维平面上有组织地移动，从而使金属颗粒移动。

根据本发明的示例性实施方案，随着每单位颗粒的化合价增加，颗粒的移动显著地受限。由此，几乎不能捕获颗粒的移动，因为当化合价达到486时，颗粒是固定的(参见图2和6)。

监测第一金属颗粒的移动的方法不受特别的限制，但优选地，可以通过测量等离激元散射而进行。

优选地，第二配体包括硫醇基，并且可以通过硫醇基而与第一金属颗粒共价结合。

本发明的人工细胞膜的特征在于金属颗粒与其结合而作为探针。因为金属颗粒与由聚合物或脂质双层组成的诸如囊泡的颗粒相比是稳定的，所以它们即使在相对低或高的盐浓度或pH的条件下也不分解，从而保持它们的形态和物理性质。此外，优选地，因为金属颗粒包括等离激元金属颗粒并展现出等离激元散射，因此金属颗粒本身可以在没有额外的探针的情况下被检测到，并且不引起闪烁或消光，从而长时间进行稳定的监测。此外，因为金属颗粒可以与诸如硫醇基的官能团一起直接形成强共价键，可以使用该官能团向金属颗粒的表面提供配体。

优选地，相对于支持的脂质双层中的脂质的总量，可以以0.05mol％至0.5mol％的量包含与第一配体结合的第一脂质。第一配体处于通过与第二配体结合而布置颗粒的位点。当与第一配体结合的第一脂质的量与脂质的总量之比小于0.05mol％时，在脂质表面上的第一配体的频率变低，即，第一配体之间的距离增加，因此一个颗粒与多个第一配体结合，因而颗粒难以固定在脂质双层上。当其比例大于0.5mol％时，第一配体的密度变得过高，导致包含与第一配体特异性结合的第二配体的第一颗粒的聚集，从而抑制颗粒的移动或使得其分析变得困难。

优选地，支持的脂质双层可以还包含相对于脂质总量的1mol％至10mol％的量的与聚乙二醇(PEG)结合的第二脂质。在此情况下，聚乙二醇的平均分子量优选为500至2000，但不限于此。例如，当使用具有2000以下的相对低的分子量的PEG时，即使与PEG结合的第二脂质的含量被增加至10mol％的水平，即其是与用于使脂质双层稳定的含量相比稍微更高的含量，也不会引发屏蔽效应，脂质层被物理稳定以增加脂质双层的使用寿命和稳定性，并且纳米颗粒之间以及纳米颗粒与脂质之间的非特异性结合被有效地降低以增加流动性。然而，当PEG的分子量超过上述范围或者第二脂质的含量超过上述范围时，纳米颗粒向脂质膜的接近和/或第一配体与第二配体之间的结合可以通过引发屏蔽效应而得以抑制，从而优选的是，适当地组合及选择所用的PEG的分子量和与PEG结合的第二脂质的含量。

根据另一方面，本发明提供了使用人工细胞膜检查分子A与分子B之间的相互作用的分析装置，其包括：人工细胞膜，其中支持的脂质双层还包含与第三配体结合的第三脂质，所述第三配体与所述第一配体相同或不同；与人工细胞膜中的第一金属颗粒的表面结合的分子A；包含与第三配体特异性结合的第四配体的第二金属颗粒，其中所述第二金属颗粒通过第三配体与第四配体之间的相互作用而与至少一个第三脂质结合，并且与所述第一金属颗粒相比具有更高的移动性；以及与人工细胞膜中的第二金属颗粒的表面结合的分子B，其中具有更高移动性的第二金属颗粒接近第一金属颗粒，随后通过分子A与分子B之间的相互作用而被限制于第一金属颗粒。

第四配体可以与第二配体相同或不同。

分子A和分子B可以各自选自DNA、RNA、抗原、抗体、配体、螯合物、受体、适配体、聚合物、有机化合物、金属离子和多肽。

因此，待通过本发明的分析装置来检查的分子A与分子B之间的相互作用可以是抗原-抗体结合、配体-受体结合、蛋白质-蛋白质结合、核酸杂化、螯合、共价结合或静电结合。核酸杂化可以包括DNA、RNA、PNA及其组合的杂化，而没有限制。

第一金属颗粒通过与多个脂质结合而被固定在支持的脂质双层上，并且第二金属颗粒可以在不存在分子A与分子B之间的相互作用的情况下在支持的脂质双层上进行二维自由布朗运动。

因此，当产生由在第一金属颗粒上的分子A与在第二金属颗粒上的分子B之间的相互作用所造成的刺激，即第一金属颗粒与第二金属颗粒之间的引力或斥力时，第一金属颗粒可以是固定的，并且第二金属颗粒可以通过引力而移向第一金属颗粒或者通过斥力而远离第一金属颗粒。因此，可以通过观察第二金属颗粒相对于固定的第一金属颗粒的移动而检查分子A与分子B之间的相互作用。

根据又一方面，本发明提供了使用该分析装置检查分子A与分子B之间的相互作用的方法。

如上所述，在分析装置中，第一金属颗粒被固定在支持的脂质双层的平面上，并且第二金属颗粒进行自由布朗运动，只要未施加额外的刺激即可。

因此，可以监测第一金属颗粒的位置以及由第一金属颗粒造成的散射强度或波长的变化。

此外，可以监测第二金属颗粒的实时移动轨迹或速率，或者由第二金属颗粒造成的信号强度或波长的变化。

优选地，通过测量第一金属颗粒和/或第二金属颗粒的等离激元散射来进行所述监测。引发等离激元散射的纳米颗粒当其间距离减少时可以通过等离激元偶合而增强散射信号，并且当其间距离在预定距离即等离激元偶合距离内进一步减小时，散射波长转移向长波长。因此，当颗粒彼此远离时，可以从颗粒的轨迹测量颗粒之间的距离，并且当颗粒在预定距离内彼此靠近时，从所测量的散射信号的强度和波长来评估颗粒之间的距离。

在本发明的示例性实施方案中，使用由互补序列DNA标记的金纳米颗粒，并且两个或更多个DNA与一个金纳米颗粒结合，由此多个金纳米颗粒通过DNA杂化而彼此靠近。由此，彼此结合的金纳米颗粒的数量增加，因此金纳米颗粒以二聚体、三聚体和四聚体的顺序生长，以使散射强度阶梯式增加，并且散射信号持续长时间。相反，通过瞬态非特异性相互作用来观察信号的增加，但是相对应的信号甚至不能持续数秒。因此，确定的是，通过非特异性相互作用的信号的增加和通过特异性相互作用的信号的增加是彼此区分的(参见图6)。此外，确定的是，由于颗粒的聚集，信号强度增加，并且散射波长转变为长波长。

该方法的特征在于通过在预定方向施加额外的力来增加颗粒的密度和颗粒的碰撞频率，由此改善分析灵敏度和缩短检测时间。在此情况下，施加的力可以是磁场、电场或流体流，但不限于此。

根据又一方面，本发明提供了通过由在人工细胞膜上的与分子A结合的第一金属颗粒和与分子B结合的第二金属颗粒的等离激元散射信号测定第一金属颗粒与第二金属颗粒之间的距离来测定分子A与分子B之间的结合的分析试剂盒，其包括：人工细胞膜，其包括基底，布置在基底上且其内的一些或所有脂质能够转移位置的支持的脂质双层，以及作为支持的脂质双层的一部分的与第一配体结合的第一脂质和与同第一配体相同或不同的第三配体结合的第三脂质；包含与第一配体特异性结合的第二配体的第一金属颗粒，其中第一金属颗粒能够通过第一配体与第二配体之间的相互作用而与至少一个第一脂质结合；以及包含与第三配体特异性结合的第四配体的第二金属颗粒，其中第二金属颗粒能够通过第三配体与第四配体之间的相互作用而与至少一个第三脂质结合。

如上所述，为了检查两个分子之间的相互作用，对于检测便利性而言优选的是，使用这样的分析装置，其经配置以使与待分析的两个分子中的一个分子结合的金属颗粒被固定在人工细胞膜上，并且另一分子与具有相对高的移动性的金属颗粒结合。然而，根据当前的光学检测技术，因为可以监测在脂质双层上自由移动的颗粒，因此即使这些颗粒能够在脂质双层上自由移动，也可以监测单个颗粒，因为分子A和分子B二者均与具有高移动性的金属颗粒结合。因此，该系统还用作用于检验分子A与分子B之间的相互作用的分析试剂盒。该分析试剂盒还可以应用于公知的等离激元散射检测系统。

根据又一方面，本发明提供了用于定性或定量地分析能够结合于分子A和分子B的靶标材料的试剂盒，所述试剂盒通过由在人工细胞膜上的与分子A结合的第一金属颗粒和与分子B结合的第二金属颗粒的等离激元散射信号测定第一金属颗粒与第二金属颗粒之间的距离来测定分子A与分子B之间的结合，所述试剂盒包括：人工细胞膜，其包括基底，布置在基底上且其内的一些或所有脂质能够转移位置的支持的脂质双层，以及作为支持脂质双层的一部分的与第一配体结合的第一脂质和与同第一配体相同或不同的第三配体结合的第三脂质；包含与第一配体特异性结合的第二配体的第一金属颗粒，其中第一金属颗粒能够通过第一配体与第二配体之间的相互作用而与至少一个第一脂质结合；分子A，其与第一金属颗粒的表面结合并且与靶标材料的一部分特异性结合；包含与第三配体特异性结合的第四配体的第二金属颗粒，其中第二金属颗粒能够通过第三配体与第四配体之间的相互作用而与至少一个第三脂质结合；以及分子B，其与人工细胞膜中的第二金属颗粒的表面结合并且与靶标材料的未结合分子A的另一部分特异性结合。

如上所述，靶标材料、分子A、分子B、第一配体和第二配体中的每一个可以选自抗原、抗体、配体、受体、螯合物、DNA、RNA、适配体、彼此特异性结合的化学分子及其组合。

尽管不限于此，但当调节化合价以使第一金属颗粒被固定在支持的脂质双层上并且第二金属颗粒可以在不存在分子A与分子B之间的相互作用时通过靶标材料进行在支持的脂质双层上的二维自由布朗运动时，可以追踪第二金属颗粒对于固定的第一金属颗粒的相对移动，从而促进监测。

在此情况下，在存在靶标分子的情况下的分子A与靶标分子之间以及分子B与靶标分子之间的相互作用可以通过测量以下而检查：在第一金属颗粒的位置处的等离激元散射信号的强度和/或波长的变化；当具有高移动性的第二金属颗粒接近第一金属颗粒时，分子A与靶标分子之间以及分子B与靶标分子之间的结合所引发的变化。

根据又一方面，本发明提供了通过等离激元散射测量来定性或定量地分析i_max×m_max的量的靶标材料的多元分析试剂盒(i_max和m_max分别是以下变量i和m的最大值，并且各自独立地为1以上的整数，但不是i_max＝m_max＝1)，其包括：人工细胞膜，其包括基底，布置在所述基底上且其内的一些或所有脂质能够转移位置的支持的脂质双层，以及与配体I_i结合的脂质I_i和与配体M_m结合的脂质M_m(此处，配体I_i和配体M_m可以彼此相同或不同)；金属颗粒I_i，其包含与配体I_i特异性结合的配体I’_i，其中所述金属颗粒I_i通过配体I_i与配体I’_i之间的相互作用而与至少一个脂质I_i结合；分子A_i，其与金属颗粒I_i的表面结合并且与靶标材料的一部分特异性结合；金属颗粒M_m，其包括与脂质M_m特异性结合的配体M’_m，其中金属颗粒M_m通过配体M_m和配体M’_m之间的相互作用而与至少一个所述脂质M_m结合；以及分子B_m，其与所述人工细胞膜中的金属颗粒M_m的表面结合并且与靶标材料的未结合分子A的另一部分特异性结合，其中所述系列的金属颗粒I_i具有彼此不同的等离激元散射波长，并且所述系列的金属颗粒M_m具有彼此不同的等离激元散射波长。

在本发明的示例性实施方案中，制备具有不同颜色即红色、绿色和蓝色的金/银纳米颗粒，并且以预定比向金/银纳米颗粒的表面提供具有捕获序列和互补序列并且在脂质双层上结合的DNA，以控制与脂质双层的化合价，由此提供6种类型的不同金属颗粒，即，固定在脂质双层上的金属颗粒和在脂质双层上自由移动的金属颗粒。此外，向金/银纳米颗粒的表面提供能够与用作靶标材料的9种类型的miRNAa中的一些结合的互补序列DNA(参见图23B、图28和表3)。在此情况下，为了监测的便利性，将DNA序列组合，以使每一靶标材料与在脂质双层上固定的一个金属颗粒和在脂质双层上自由移动的另一金属颗粒结合。例如，监测在脂质双层上固定的红色金属颗粒的等离激元散射、接近该红色金属颗粒的另一金属颗粒依时间的轨迹、和在三种颜色波长下等离激元散射的强度，以鉴定在三种颜色波长中的波长，其强度根据另一金属颗粒的接近而增加，从而鉴定另一金属颗粒的类型，并且通过测量增加的强度来测定与一个固定的红色金属颗粒结合的其它金属颗粒的数量。即，可以确定的是，固定的红色金属颗粒的等离激元散射图案不同于能够在脂质双层上自由移动的3种类型的金属颗粒的等离激元散射图案，所述脂质双层能够通过监测固定的红色金属颗粒的位置而与红色金属颗粒结合(参见图24A、25A和26A)。以类似于使用固定的绿色金属颗粒和固定的蓝色金属颗粒(参见图24至26B和26C)的情况的方式获得该结果，并且通过所述金属颗粒的组合来引发不同的等离激元散射变化(参见图23D)。因此，可以确定的是，可以通过使用具有不同移动性和/或等离激元散射波长的多个金属颗粒来同时定性和定量地分析多个靶标材料。

根据又一方面，本发明提供了将离子集中于流体通道的特定区域的方法，其包括：在流体通道中制备支持的脂质双层，其中支持的脂质双层包含与第一配体结合的第一脂质，并且一些或所有脂质能够在支持的脂质双层中转移位置；在支持的脂质双层上施用包含与第一配体特异性结合的第二配体的第一颗粒；以及通过在所述流体通道中施用流体流而将第一颗粒转移到流体通道的特定区域中。

若需要，作为第一颗粒，可以使用与基因或蛋白质结合的颗粒。

当向包括含有通过配体结合而结合在脂质上的颗粒的支持的脂质双层的流体通道施用流体流时，颗粒可以在支持的脂质双层上进行自由布朗运动，因此颗粒沿着流体的流动方向移动，以在特定部分处集中。惯常，作为将在脂质双层上布置的颗粒集中的方法，已经使用施加诸如电磁场的刺激的方法。然而，当施加电磁场时，随着暴露时间增加，可能使与颗粒结合的蛋白质或基因变性，或可能破坏脂质双层本身，由此可能改变诸如pH、温度和气泡产生的实验条件。然而，当使用本发明的流体流时，可以克服上述劣势。

在本发明的示例性实施方案中，在基底上提供流动通道，并且在上载玻片的两侧中形成孔，从而允许流体在预定方向流动。在流动通道中形成本发明的与金或银纳米颗粒结合的脂质双层，并且监测金属纳米颗粒的移动，同时调节流体的流量。在施加流体流之前，金属纳米颗粒自由移动和扩散，但是在施加流体流时，这些金属纳米颗粒开始在与流体流相同的方向上移动，并且通过流体流的增加来加速金属纳米颗粒的移动。此外，随着金属纳米颗粒在一个方向移动，在特定区域中金属纳米颗粒的密度增加，并且通过等离激元偶合来使散射波长漂移(参见图11和12)。

具体实施方式

在下文中，参考下列实施例来更详细地描述本发明。阐述这些实施例以例示本发明，并且本发明的范围不限于此。

实施例1：材料

1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(DOPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(6-氨基己酸生物素基)钠盐(生物素化DOPE)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-1000]铵盐(PEG-DOPE)购自Avanti Polar Lipids(Alabaster,AL,USA)。Cy3修饰的链霉亲和素(STV)购自Molecular Probes(Eugene,OR,USA)。羧甲基聚乙二醇(M.W.5000)购自Laysan Bio Inc.(Arab,AL,USA)。牛血清白蛋白(BSA)、月桂基硫酸钠(SDS)和二硫苏糖醇(DTT)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。通过将NaH₂PO₄、Na₂HPO₄和NaCl(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)溶解在去离子水(DI水)中，产生具有150mM>2)₆-PEG₆-CTTTGAGCACATCCTTATCAATATT-3’，并且I-PNP的SLB栓系序列为5’-HS-(CH₂)₆-PEG₆-CTTTGAGCACTGTTAGCGTGTGTGGAATTTTAAT-生物素-3’。M-PNP(移动PNP)的靶标捕获序列为5’-TAACAATAATCCCTCCACGAGTTTC-PEG₆-(CH₂)₃-SH-3’，并且M-PNP(移动PNP)的SLB栓系序列为5’-生物素-TAATTTTAAGGTGTGTGCGATTGTCACGAGTTTC-PEG₆-(CH₂)₃-SH-3’。靶标序列为5’-GAGGGATTATTGTTAAATATTGATAAGGAT-3’。靶标序列的下划线部分与靶标DNA序列杂化。作为单碱基对错配DNA序列，使用其中A被T替代的靶标DNA序列。非互补DNS序列为5'-CTGATTACTATTGCATCTTCCGTTACAACT-3'。

实施例2：小单层囊泡(SUV)的制备

通过包含97.4mol％的DOPC、0.1mol％的生物素化DOPE和2.5mol％的PEG-DOPE的SIV的扩散，在盖玻片上形成支持的脂质双层(SLB)。通过将适量的脂质溶解在氯仿中来制备SUV溶液。使用旋转蒸发器在50ml圆底烧瓶中蒸发脂质溶液。在N₂流下彻底干燥脂质膜。将经干燥的混合物再悬浮于DI水中，并经历三次重复的冷冻-解冻循环。总脂质浓度为2mg/ml。在25℃下，通过孔直径为100nm的PC膜，将溶液挤出多于21次。将所得的SUV溶液保持于4℃，直至使用。

实施例3：使用DNA的金等离激元纳米探针的功能化和生物素化合价的量化

通过使用100mM PB(pH 8.0)孵育2小时来还原硫醇化寡核苷酸，并且通过NAP-5柱(GE Healthcare,Buckinghamshire,UK)而分离。对于DNA功能化，将刚还原的4μM寡核苷酸与50nm的50pM AuNP混合，并且在室温下孵育过夜。对于I-PNP，SLB栓系序列与靶标捕获序列的摩尔比为200:600(SLB栓系序列的摩尔分数：0.25)。对于M-PNP，摩尔比为1:799(SLB栓系序列的摩尔分数：0.00125)。然后，调节溶液以产生10mM的磷酸盐缓冲液和0.1％(wt/vol)SDS。将经调节的溶液在定轨振荡器中进一步孵育30min，并且通过0.05M增量添加6等份的2M NaCl以获得0.3M的最终NaCl浓度。在每次添加2M NaCl之后，将溶液在55℃加热10min并且在室温下孵育30min。使DNA-AuNP混合物在室温下静置过夜，然后将溶液离心(4500rpm,10min)。去除上清液，并且将沉淀物再分散于DI水(该程序重复三次)。将DNA功能化AuNP溶液保持于4℃，直至使用。为了量化每个AuNP的SLB栓系序列的数量，使用30mM KCN溶液溶解Cy3标记的寡核苷酸修饰的AuNP。此外，在Xe灯(500W)作为激发源的Acton光谱仪(Spectra Pro,MA,USA)上进行Cy3的荧光发射强度的测量。

实施例4：SLB和栓系于SLB的金等离激元纳米颗粒的制备

在玻璃流动室中进行SLB和与SLB栓系的Au PNP的制备。玻璃流动室由通过100μm厚热塑性垫片彼此分隔开的顶部和底部玻璃基底组成。在顶部玻璃基底的两端上钻出进入孔和排出孔。用在0.15M BPS中的10mg/ml BSA预处理顶部载玻片1小时，以使其对SLB沉积呈惰性。在氯仿、丙酮和乙醇中通过超声处理10min来清洗底部盖玻片。在超声处理之后，将盖玻片用DI水冲洗并通过N₂流干燥。接下来，将底部盖玻片用1M>

4.1.每个金纳米颗粒的生物素化合价的控制和量化

首先，本发明人通过改变脂质栓系的等离激元纳米颗粒(PNP)的生物素化合价来控制PNP的扩散。由此，确定的是，每个颗粒的配体数量具有对脂质膜上的纳米颗粒的侧向移动性的显著作用。本发明人通过改变靶标捕获DNA序列与SLB栓系DNA序列之间的摩尔比来调节在DNA功能化步骤期间AuNP上的生物素分子的化合价。该化学计量控制方法产生高度可重复的结果。通过测量Cy3分子的荧光发射强度来评估每个PNP的SLB栓系序列的数量，所述Cy3分子在用KCN溶液溶解AuNP之后被修饰于SLB栓系序列。随着SLB栓系DNA连接物的加成量增加，平均生物素化合价从0.57线性增加至128(参见图1和表1)。通过生物素-链霉亲和素相互作用，将制备的PNP探针栓系于SLB表面。生物素化合价为0.57的在SLB上的PNP探针被认为具有一个生物素，因为不含生物素的PNP不会结合于SLB并且会从表面被彻底洗出。

[表1]

4.2.生物素化合价对SLB上PNP探针的扩散动力学的作用

使用暗视场显微镜以单纳米颗粒分辨率观察SLB栓系的PNP探针的侧向移动性，并且通过成像分析程序(ImageJ软件；详细的实验和分析方法将稍后描述)分析它们的单个轨迹。在图2中示出随着具有不同生物素化合价的SLB栓系的PNP探针的时间而变的均方位移(MSD)值。多价PNP显示出与寡价PNP(paucivalent PNP)相比更加慢地扩散并且行进更短的距离。具有486个生物素的PNP是几乎固定的，并且停留在几乎相同的位置。这些轨迹的MSD图表，除了包括486个生物素的情况之外，明确地展现出MSD与时间间隔之间的线性关系，表明这些纳米颗粒处于SLB表面上的随机二维布朗运动。为了计算PNP探针的扩散系数，本发明人分析了每一生物素化合价的100个颗粒轨迹，并且将相对应的MSD图表拟合于以下方程：<r²>＝4Dt，其中<r²>是MSD，D是扩散系数，并且t是时间间隔。对于1、5、28和128的生物素化合价，扩散系数的平均值分别估算为1.79±0.87×10^-8、0.72±0.35×10^-8、0.38±0.29×10^-8和0.18±0.14×10^-8cm²/s(图2B)。计算的D值的分布绘制在图3中，并且这些值符合其中为了脂质移动的可视化而用30nm至50nm的AuNP修饰SLB的其它文献结果。随着PNP变成更多价，更加降低移动分数，并且当生物素化合价达到486时大部分颗粒是几乎固定的。本发明人观察到并且关联了多价PNP的暗视场显微镜图像和SLB上Cy3修饰的STV的荧光显微镜图像，以证实PNP的位置与局部聚集的STV的位置相匹配。结果显示两个图像完全彼此匹配，表明在多价PNP下STV的局部集中是颗粒移动性损失的成因(图4)。

4.3.金纳米颗粒的光学稳定性测试

金属纳米颗粒的共振光散射具有与有机染料的荧光不同的物理起源。局部化表面等离激元的辐射阻尼产生散射的光子，并且该过程没有闪烁和光漂白。为了评价PNP的光稳定性，SLB上的50nm AuNP连续暴露于暗视场显微镜照明30min，并且每隔6s记录散射强度(图5)。颗粒连续发亮，而在整个实验时间内没有强度的变化。这表明与即使当多种染料用于单颗粒追踪时在数分钟内基本损失其信号的荧光染料相比，AuNP对于实时光学研究而言是更加稳健的光学标记。

4.4.SLB上栓系的纳米颗粒的单纳米颗粒分辨率原位成像和分析

PNP动态地栓系于流体SLB，并且通过控制颗粒的化合价来调节PNP的动态行为。然后，以单颗粒水平分辨率分析原位DNA杂化诱导的颗粒团簇生长动力学，并且使用相互作用的PNP之间的实时等离激元偶合来进行在该平台上的定量分析(图6和7)。同时监测和分析来自多颗粒反应位点的相互作用，进行用于二聚的、三聚的和四聚的纳米颗粒团簇的形成的动力学研究，并且基于多并行单颗粒分析的DNA检测检定被示出为该方法的应用。PNP用于该方法，因为它们有效地散射共振光，并且不受光漂白和闪烁的影响，这能够在长时段内以良好的空时分辨率进行单纳米颗粒追踪(在1小时内，具有约1.5nm和约10μs的分辨率)。重要地，单个金或银纳米颗粒(AuNP或AgNP)的等离激元以距离依赖性方式彼此相互作用，并且这形成下述的基本原理，其是在没有进一步标记的情况下通过监测散射强度或频谱响应的变化来测量数十纳米内分子相互作用的基础。SLB是非常强大的平台，因为其允许合成和控制固体基底上的二维流体表面，并且并入多种具有侧向移动性的膜物质。通过将纳米颗粒栓系于SLB，可以将纳米颗粒限制于光学显微镜的二维焦平面中，以有效地成像和追踪所有受关注的纳米颗粒，同时由于SLB的流体性质而保留纳米颗粒的自由移动。因为栓系的PNP共振散射入射光并通常在平面脂质双层表面上行进，因此可以使用暗视场显微机构(Axiovert 200M,Carl Zeiss,Germany)以单颗粒分辨率来原位记录二维扩散轨迹和光学信号(参见图7)。暗视场结果证实栓系的PNP均匀地分散在整个二维膜表面内，并且表现出在膜表面上具有自由扩散的优异侧向移动性。颗粒的这种动态二维限制和PNP标记的使用允许促进颗粒之间的有效碰撞以及在纳米颗粒上的分子之间的几乎所有反应的原位观察和分析。

实施例5：图案化SLB的制备

为了DNA检定，在玻璃基底上的图案化金膜中形成120×120μm²的SLB。通过常规光刻法和常规剥离法来形成金图案。SLB会选择性沉积到通过SUV溶液的引入而暴露的玻璃表面上，因为金的表面对于SLB的形成呈惰性。在SLB形成之后，使用溶解在PBS中的2mg/ml>

实施例6：PNP探针的基于暗视场显微镜的原位观察及其光学分析

通过装备有40×物镜(NA 0.6)的暗视场显微镜(Axiovert 200M,Carl Zeiss,Germany)来观察SLB栓系的PNP探针的移动和等离激元偶合。使用ImageJ软件(http://rsb.info.nih.gov/ij/)进行所有的图像分析程序。为了单个SLB栓系的PNP探针的追踪和轨迹分析，使用MOSAIC插件(http://www.mosaic.ethz.ch/Downloads/ParticleTracker)。通过ImageJ软件的基本强度测量和RGB颜色强度分裂函数分别测量散射强度和RGB颜色谱。通过装备有60×透镜(NA 1.49)的落射荧光显微镜(TE-2000,Nikon,Tokyo,Japan)在532nm激光激发下观察Cy3修饰的STV。

6.1.相互作用的颗粒的高分辨率成像检定

高分辨率成像检定的另一重要方面是相互作用的颗粒的稳定且可靠的观察方法。为了有助于此情形，在侧向移动性方面具有显著差异的2种类型的DNA修饰的等离激元纳米颗粒(DNA-PNP)经设计、制备和栓系于SLB表面，即，分别为高移动和几乎固定的PNP(M-PNP和I-PNP)探针(参见图6)。稳定地监测和分析来自固定的I-PNP位点的散射信号，并且M-PNP扩散到I-PNP位点中以诱导基于等离激元偶合的散射信号的变化。分别用5’-硫醇-修饰的DNA和3’-硫醇-修饰的DNA各自制备I-PNP和M-PNP探针。两种不同的硫醇化DNA序列(靶标捕获序列和SLB栓系序列)用于每一PNP探针的功能化。SLB栓系序列具有在与硫醇相对的末端上的生物素基团，并且形成与链霉亲和素修饰的SLB的稳定结合。在DNA修饰操作中，通过具有不同摩尔分数的SLB栓系序列的探针的生物素化合价来控制PNP探针的移动性。随着PNP变成更多价，进一步降低扩散系数和移动分数，并且当生物素化合价达到486时，其使用0.15625摩尔分数的SLB栓系序列而获得，所有颗粒是几乎固定的(参见图8)。此处，对于M-PNP探针，加成0.00125摩尔分数的SLB栓系序列以产生1生物素化合价。M-PNP探针是寡价的，并且可以经由随机二维布朗运动而更加自由地扩散。另一方面，多价I-PNP探针被几乎完全固定在膜表面上。使用ImageJ软件，通过求半径为500nm的I-PNP位点中心的圆形区域(其相近于用于该研究的显微镜设置的光学分辨率d(d＝λ/2NA；λ是50nm AuNP的共振散射波长，即530nm；NA是40×物镜的数值孔径，即0.6))的平均值来分析散射强度。

随着M-PNP和I-PNP探针经由链霉亲和素连接物而栓系于SLB中的生物素化的脂质，可以在暗视场显微镜中由共振光散射信号来容易地追踪PNP结合的脂质的局部位置和移动。在不存在颗粒-连接靶标DNA的情况下，M-PNP探针可以接近固定的I-PNP位点，并且这些探针在暗视场显微镜中可以是暂时重叠的。因此，I-PNP位点的散射强度是最初恒定的，但随着M-PNP进入而在光学衍射限度内波动(参见图9)。有趣的是，观察到在信号中的两种类型的瞬态激增。在此更加频繁的一种情况下，散射强度比初始值高约2倍。这可以归因于远端光学重叠，其中两个PNP存在于光学分辨率内，但彼此不足够靠近以导致等离激元偶合(图9B-i)。在其它情况下，观察到散射强度的约3.5倍的上升，并且这种增加起源于两种等离激元偶合的PNP之间的近场相互作用(图9B-ii)。应注意，这些信号变化中的大部分持续少于0.5s，这是因为不存在颗粒之间的特异性相互作用。通过等离激元偶合在亚衍射长度范围下辨别脂质之间的暂时分子间接近。我们的策略和结果表明可以监测导致PNP探针之间的对接和等离激元偶合的分子间相互作用。在接下来的一组实验中，我们观察到触发SLB上DNA修饰的PNP探针的组装和解组装的原位DNA杂化和去杂化事件，并且实时地以单纳米颗粒分辨率记录了散射强度的相对应的变化。在存在靶标DNA序列的情况下，寡价M-PNP被多价I-PNP捕获，并且形成多颗粒团簇，其中I-PNP被固定并且作为追踪中心而被监测。在暗视场显微图像中，成功地分辨组装过程，以观察单纳米颗粒加成事件。观察到从单体至四聚体的颗粒间PNP团簇生长，并且用白色实线来突出已经被捕获的M-PNP探针的轨迹(参见图10A)。随着团簇进化，我们观察到向I-PNP位点的每个单M-PNP加成步骤中散射强度和颜色二者的突然变化。散射效率和共振波长的变化起因于团聚的AuNP中等离激元偶合。在3nM靶标DNA浓度下，在15min内完成反应，并且消耗许多单体M-PNP探针以形成团簇。团簇生长通常被限制于四聚体内，并且几乎观察不到超过四聚体的进一步生长，因为存在有限数量的M-PNP，并且在此情况下用于在二维平面上单位点中的多于4个的颗粒的组装的在颗粒上的DNA链之间还存在大的位阻。固定的I-PNP的利用通过有效地消除小团簇之间的并合(其产生不规则的二维聚集体并且损害量化)来约束单体附接的团簇生长途径(请参见用于在M-PNP对修饰的SLB中观察到的并合过程的补充的图11)。PNP探针之间的等离激元偶合引发共振波长的红移，由此在暗视场显微图像中的等离激元偶合的绿色AuNP变红。通过分裂RGB通道来分析等离激元颜色变化(图7)。随着团簇生长，绿色和红色信号增加，而蓝色信号保持恒定。基于这些结果，我们绘制绿红比图，并且随着团聚的颗粒的数量增加，观察到该比例的线性增加(图10B)。颜色校准用基准应该在实际上可用于精确限定和量化颗粒间相互作用的状态并且将基于特异性相互作用的等离激元偶合与非特异性光学重叠区分开。重要的是，示出M-PNP探针经由靶标DNA识别和杂化而向I-PNP位点的颗粒间加成，并且以散射强度的时间追踪而量化(图10C中的顶部图)。结果表明当向I-PNP探针加成每一M-PNP以依次形成二聚体、三聚体和四聚体时，以阶梯式方式增加散射信号强度。当用包含更加少的盐(17mM>+)的低盐PB溶液替换高盐PBS溶液(167mM>+)时，靶标DNA被去杂化，并且M-PNP从I-PNP探针离解并在SLB表面上再次自由地扩散，这产生散射强度的一系列阶梯式降低(图10C中的底部图)。应注意，对于每一探针加成步骤，散射信号强度经历多个阶梯式改变，并且保持恒定，直至接下来的颗粒被加成或释放。

6.2.团簇生长动力学的分析

通过假设M-PNP与I-PNP相比过量地存在，将从单体至四聚体的团簇生长动力学拟合成三步一阶连续反应：

每一物质的改变速率的微分形式如下。

解析这些微分方程得出解，以描述每一物质的时间依赖性浓度：

其中初始I-PNP单体浓度[M]₀为150，其为此处分析的颗粒的数量。通过使用这些方程拟合动力学数据来评价k₁、k₂和k₃的速率常数值。

通过同时分析在大表面区域(典型地为约30,000μm²；图12A)上的PNP探针的单个等离激元偶合来实现多个相互作用的高度并行的原位观察。本发明的330s观察时间(80ms暴露时间和1s时间间隔)的原位并行颗粒团簇生长分析结果表明，尽管典型地观察了连续的颗粒间团簇生长(图12B-i和iv)，还以不同的团聚动力学观察了许多不同的团聚模型。一些探针仅形成二聚体，并且没有进一步生长(图12B-ii和iii)。还存在其中探针团簇生长以形成三聚体而未进一步生长以形成四聚体的情况。有趣的是，还观察并分辨了两个探针向I-PNP探针的同时加成(图12B-iii和vi)和在非常短的时间框架内两个或三个探针向I-PNP探针的背对背加成(图12B-vii、ix和x；请参见这些情况的插图)。在本发明中，基于这种原位并行单颗粒分辨率分析能力，研究DNA杂化诱导的形成团簇的反应动力学。出于该目的，同时监测150个单个I-PNP位点的散射强度。通过假设M-PNP相对于I-PNP单体过量地存在，将从单体至四聚体(单体→二聚体→三聚体→四聚体)的生长动力学拟合成三步连续反应。二聚体、三聚体和四聚体形成的速率常数被分别估算为k1＝0.0165，k2＝0.0116和k3＝0.0061s^-1。该模型解释了在180s内的纳米颗粒团簇生长动力学。该结果是下述假设的直接证据，即，从二聚体形成三聚体与从单体形成二聚体相比是更加困难且缓慢的过程，并且四聚体形成由于DNA修饰的PNP探针之间的位阻而是最困难且耗时的过程。当考虑位阻因子(f)时，三聚体和四聚体形成的速率常数可以分别表示为k₂＝f_dimk₁和k₃＝f_trik₁。从拟合的速率常数来计算空间因子(对于f_dim为0.7030并且对于f_tri为0.3697)。透射电子显微镜测量表明PNP团簇形成为不同的几何构型(图13)。基于该观察，本发明人在几何学上计算了向二维二聚体和二维三聚体加成接下来的PNP的空间因子(在几何学上计算的位阻因子：f_dim＝0.6667和f_tri＝0.3750；图14)。这些结果符合从拟合的速率常数获得的空间因子，表明三步连续反应模型描述和解释了DNA修饰的PNP探针的二维团簇生长。

最后，本发明人起草了用于团簇中反应的颗粒数量的光学校准用标准，并且基于该标准曲线，他们进行了靶标DNA检测并且评价了PNP栓系的SLB平台的检测灵敏度。校准用标准线图通过同时分析30个单个团簇而获得，并且通过分辨和记录全部颗粒加成事件来确定团簇中的颗粒数量。为了在单次框架获取内同时加成多个PNP探针，在此情形下以5.3个框架/秒来提高框架速率。本发明人绘制了平均散射强度并发现与团聚的颗粒数量的线性关系(R²值为0.999，图15A)。相对应的分布示于图5中。显著地，该结果展现出窄的标准偏差，并且本发明人可以明确地区分团聚的状态。

6.3.使用与栓系于SLB的互补DNA修饰的PNP的相互作用的靶标DNA检测限度

在量化团簇形成程度的情况下，通过靶标DNA及其互补序列的相互用作形成的金纳颗粒团簇可以用作用于检测DNA的生物传感器，因为金纳米颗粒团簇的散射信号的强度得以显著地增加，并且可以以单纳米颗粒水平观察该金纳米颗粒团簇。因此，由于根据靶标DNA浓度而形成金纳米颗粒团簇，由此通过分析暗视场显微镜图像的亮度来测定靶标DNA的可检测的浓度范围。在嵌于金膜中的120×120μm²SLB图案上进行DNA检测(图15B)。使用从300aM至300fM的不同浓度的靶标DNA，使PNP修饰的SLB反应4小时。包括对照样品在内的所有样品包含300fM的非互补DNA序列以验证本发明的检定选择性。在用于本发明的靶标DNA的浓度范围，PNP仅形成二聚体而不进一步生长成三聚体和四聚体。代表偶合的二聚体散射强度的I-PNP位点(>3.5倍的增加；参见图15A)仅被计数为靶标DNA序列的光学信号(图15B)。检定结果表明在没有优化过程的情况下30fM的检测限度(图15C)。显著地，还明确地辨别基于单碱基对错配的DNA序列(图15C)。

这样的高灵敏度表明在SLB上移动的M-PNP和在SLB上固定的I-PNP在二维平面上移动并反应，由此碰撞可能性增加，从而引发迅速的反应。实际上，观察到当在不引入支持的脂质双层(SLB)并且不与在SLB上固定的I-PNP反应的情况下，M-PNP被分散在溶液中时，引发非常缓慢且低效的反应。

6.4.通过外部刺激的栓系于SLB的纳米颗粒的分布的调节以及等离激元偶合的诱导

当适当地调节在SLB上栓系的金属纳米颗粒的生物素化合价时，金属纳米颗粒在SLB上具有流动性。流体金属纳米颗粒进行自由的二维扩散移动，并且可以通过外部刺激(例如电场和流体流)而调节以使它们在SLB上以期望的方向移动。在此情况下，还可以通过改变电场强度或流量来调节金属纳米颗粒的移动速度。如在图16中所示，当在图案化SLB中调节纳米颗粒的空间分布时，可以增加特定部分中的纳米颗粒的密度，并且可以大幅改善纳米颗粒之间的碰撞频率。因此，当在SLB上增加纳米颗粒之间的相互作用时，反应速率增加，由此改善生物传感器的灵敏度以缩短检测时间。此外，调节纳米颗粒之间的距离以形成用于调节等离激元偶合的平台。

具体地，为了调节在SLM平台中引入的金属纳米颗粒的移动，在玻璃基底上提供流动通道。在上载玻片的两侧中形成孔以引入用于形成流体流的缓冲液。当以此方式在流动通道中引入流体流时，金属颗粒在自由的二维扩散移动期间以特定方向移动，同时逐渐改变移动路径。随着流量增加，明显观察到这样的移动趋势(图17A和17B)。在其中用铬(Cr)图案化SLB的情况下，金属纳米颗粒被限制在Cr屏障中，而不从Cr屏障出来(图16的右下图)。在此情况下，当通过流体流在一个方向调节金属纳米颗粒的移动方向时，可以观察到其中金属纳米颗粒在与流体流相同的方向上移动以被集中的现象(图18A和18B)。发现金纳米颗粒和银纳米颗粒二者在一个方向累积以展现出特定表面等离激元共振波长的颜色。此外，观察到，当流体流在相反方向上改变时，累积的金属纳米颗粒在相反的方向移动以被集中。

当将SLB图案制造成数平方毫米(mm²)的大尺寸时，可以在一个位置处累积大量的金属纳米颗粒。为了累积大量的金属纳米颗粒，制造梯形图案，并且在6ml/h的流量下将金属纳米颗粒集中约30min。发现集中的金属纳米颗粒在梯形图案的末端处具有特定的等离激元散射颜色。在此情况下，通过流体液动力、DNA修饰的纳米颗粒之间的范德华相互作用、DNA分子之间的空间排斥以及静电排斥，从而将金属纳米颗粒保持平衡。为了降低金属纳米颗粒之间的距离，在该研究中，增加在流体中包含的NaCl的浓度。发现，通过NaCl浓度的增加，金属纳米颗粒之间的静电排斥降低，由此金属纳米颗粒之间的距离变得更近，以诱导等离激元偶合。测量和分析此时的散射谱(图19A、19B、20A和20B)。散射谱的最大峰代表随着盐浓度增加的红移。从金属纳米颗粒的ζ电势的测量结果，发现金属纳米颗粒的表面电荷随着盐浓度增加而降低，由此金属纳米颗粒之间的静电排斥降低，从而降低其间的距离(图19C和20C)。

6.5.仿生人工膜平台的开发

细胞膜，其为分离细胞内部和外部的结构，是由磷脂和蛋白质分子组成的薄的磷脂双层。细胞膜具有选择渗透性，并且具有通过多种蛋白质来维持细胞功能和细胞组织的功能。与此相同，用于维持细胞的体内平衡和必要功能的多种生物学现象发生在细胞膜中。因此，细胞膜的生物学和细胞学理解是非常重要的。

由此观点，可以通过使用在实施例6.4中公开的SLB平台(其为电力或流体力学调节的人工细胞膜结构)来观察细胞的行为。包含生物材料的诸如金属纳米颗粒的标记材料通过使用化学或生物学方法而被引入SLB，其为人工膜，并且检测标记材料的光学性质，由此监测细胞的行为。被引入SLB的生物材料可以细胞内诱导信号传递，或可以细胞外诱导表型调节反应。这样的观察可以有助于鉴定还未被公开的新的生物学机制，因为其类似于在真实的细胞膜中发生的生物学反应。

具有光学性质例如等离激元共振的金属纳米颗粒可以根据金属纳米颗粒与邻近的金属颗粒之间的距离而杂化。由于这样的特性，这些金属纳米颗粒根据金属纳米颗粒与邻近的金属颗粒之间的距离以及在用暗视场显微镜观察时金属纳米颗粒的团聚程度而展现出不同的颜色。此外，可以在一时间段内以高信噪比(S/N比)观察金属纳米颗粒，这归因于强的等离激元散射。可以通过将产生多元可检测的表面增强拉曼散射信号以及等离激元散射信号的细胞监测探针引入细胞膜中，从而观察细胞应答。

因此，将包含生物材料的金属纳米颗粒引入SLM表面，培养细胞，然后可以光学分析由于细胞造成的金属纳米颗粒的移动。因此，可以更精确地分析细胞信号传递机制，因为可以实时观察细胞的行为，并且可以实时以纳米尺度监测细胞与生物材料之间的相互作用(图21)。

实施例7：使用三色(红/绿/蓝(RGB))纳米探针的多元检测

诸如银纳米颗粒和金纳米颗粒的贵金属纳米颗粒的特征在于，它们根据其形状和/或尺寸而展现出多种颜色，因为它们引发等离激元共振。由于这些特性，可以通过改变纳米颗粒的组成、形状和/或尺寸来提供发射红光、蓝光或绿光的纳米颗粒。因为这些纳米颗粒展现出彼此不同的颜色，因此它们可以通过暗视场显微镜而彼此区分。因此，通过使不同组合之间的区别成为可能，从而发现这些不同的三色纳米颗粒对于miRNA多元检测的适用性。同时，因为已知miRNA(其为控制体内功能的短RNA链)在患有诸如癌症的疾病的患者中错误地表达，因此其可以用作诊断诸如癌症的疾病的生物标记。在以下表2中示出在多种癌症中发现的错误表达的miRNA的实例。

[表2]

7.1.三色(RGB)纳米颗粒的制备

通过用银壳涂覆尺寸为15nm×15nm×45nm的金纳米棒，直至约5nm的厚度，从而制备红色纳米颗粒。作为绿色纳米颗粒，使用直径为50nm的球形金纳米颗粒。通过用银壳涂覆直径为20nm的球形金纳米颗粒，直至约10nm的厚度，从而制备蓝色纳米颗粒。通过使用暗视场显微镜和电子显微镜观察所制备的纳米颗粒中的每一种的颜色和形状，并且其结果示于图22中。此外，测量所述纳米颗粒中每一种的吸收/散射谱，并且其结果也示于图22中(右图)。

7.2.通过组合三色纳米探针的微RNA的多元检测

以与实施例3相同的方式将DNA引入从实施例7.1获得的每一纳米颗粒中，并且使这些纳米颗粒功能化以合成三色纳米探针。以与实施例4相同的方式调节三色纳米探针的移动性，由此将总计6种类型的I-PNP纳米探针(在下文，表示为IR、IG和IB)和M-PNP纳米探针(在下文，表示为MR、MG和MB)引入到SLB上。如在实施例6.1中所述，引发等离激元共振散射的金属纳米颗粒根据与金属纳米颗粒结合的互补序列DNA的杂化而彼此接近，以形成两个或更多个金属纳米颗粒的团簇，由此改变等离激元散射强度以及等离激元颜色(图5至7)。因此，当施用展现出不同颜色的三种金属纳米颗粒时，可以预期由其组合导致的总计9种类型的变化(图23A)，并且这些变化得到示例性实施方案的确认(图23B至23D)。具体地，确认的是，纳米探针被组合，并且经互补DNA修饰，以与9种类型的miRNA偶合(图23B)，由此可以实时分析每一偶合，并且可以定量地分析9种类型的miRNA。在结合之前(0min)和60min反应之后于相同框架中测量的暗视场显微镜图像示于图23C中，并且相对于反应时间的累积化合价的变化示于图23D中。相对于时间的通过与固定的单个颗粒(IR、IG和IB)中的相同或不同的颗粒偶合所导致的等离激元散射谱的变化示于图24至26中，并且具有不同颜色(不同等离激元散射波长)和移动性的多个颗粒的行为及其使用暗视场显微镜的监测程序示于图27中。因此，由于本发明的多元检测方法可以同时定性和/或定量地分析9种或更多种类型的miRNA，因此该多元检测方法可以用于分类和诊断6种或更多种类型的不同癌症。

通过互补序列识别的miRNA检测的实例示于图28中。在以下表3中给出用于确认上述多元检测适用性的9种类型的miRNA的序列以及为了检测miRNA序列而引入各颗粒中的DNA序列。

[表3]