一种构建用于研究神经元自噬的活体动物模型的方法

摘要

本发明提供了一种构建用于研究神经元自噬的活体动物模型的方法，该方法用荧光蛋白标记活体果蝇的翅膀神经束，同时使用不同的萤光蛋白标记自噬相关基因，可以很快速且清晰地观察到在损伤处理翅膀或药物喂养果蝇条件下，自噬在轴突上的变化情况，实验结果表明，本发明的方法构建的动物模型能够简单、直接的研究神经元自噬。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种构建用于研究神经元自噬的活体动物模型的方法。

背景技术

自噬是一种生物体自我消化的机制，通过溶酶体在细胞内去除已损伤的细胞器和无功能的蛋白来发挥作用。根据底物运送到溶酶体的机制不同将自噬分为三类：大自噬(Macroautophagy)，小自噬(Microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA)。

大自噬是主要的自噬途径，也是目前研究最多的一种自噬。在大自噬过程中会形成双膜结构的自噬体(Autophagosome)，其中一些在进化中保守的自噬相关基因(Autophagy-related gene,Atg)的蛋白产物参与这条通路的调控。在饥饿或某些激素等因素诱导下，大自噬过程发生，首先在被降解物质的周围形成类似于杯状的膜结构被称为前自噬体(Preautophagosome)；随后前自噬体不断延伸，最后形成双层膜结构的空泡，空泡中包裹着一些坏死蛋白、细胞器和少量胞浆成分等，这个结构就是自噬体；自噬体形成后将其包裹物运输至溶酶体附近，自噬体膜与溶酶体膜融合形成一种单膜结构的自噬溶酶体(Autolysosome)，其包裹的物质进入溶酶体腔，进行大批量的物质降解，利用水解酶的作用将核酸水解成核苷酸或将蛋白质分解成氨基酸等组分供细胞再度利用。小自噬过程是一种简单的过程，不会形成自噬体，仅利用溶酶体在其表面形成凹陷，选择性地吞入胞外物质物并在溶酶体中溶解；而分子伴侣介导的自噬途径是一种很复杂且特殊的途径，在这个过程中通过hsc70复合物以及相关的分子伴侣一起形成CMA-底物/CMA-复合体，最后转运到溶酶体腔中，被其中相关的水解酶所消化。

自噬作为一种在进化中高度保守(evolutionarily conserved)的机制，广泛存在于所有真核细胞中。生物学家首先是在酵母菌中克隆了许多自噬相关基因，之后在果蝇、脊椎动物和人体细胞内也陆续找到了它们的同源基因，进而更多的人开始参与研究自噬相关基因的功能以及揭示它们在生物体内所发挥的作用。自噬相关通路的研究在细胞生物学和发育生物学等领域比较深入，在neurodegeneration也有研究。自噬在有丝分裂后期细胞如神经元细胞中，尤为重在小鼠中，CNS特异性或神经元特异性地敲除自噬基因会诱发轴突变性和神经元的死亡。此外，突变PINK1和Parkin的突变，蛋白质选择性移除受损的线粒体，会导致帕金森氏症，将缺陷性的自噬与神经退行性疾病联系在一起。但自噬与轴突变性之间的研究还不广泛。尽管已有一些证据表明自噬对于轴突以及神经元的内稳态很重要，但其准确的机制知之甚少。

因此，为了有效地、直接地研究神经元自噬，本领域迫切需要开发一种可以用来研究神经元自噬的活体动物模型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种构建用于研究神经元自噬的活体动物模型的方法。

本发明的第一方面，提供了一种构建转基因果蝇模型的方法，所述方法包括步骤：

(1)使用第一荧光蛋白标记所述果蝇模型翅膀神经轴突；

(2)使用第二荧光蛋白标记所述果蝇模型的自噬相关基因；

从而构建出所述转基因果蝇模型。

在另一优选例中，所述第一荧光蛋白选自下组：绿色荧光蛋白(如eGFP、ZsGreen)、红色荧光蛋白(如tdTomato、DsRed、mCherry)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)等。

在另一优选例中，所述第二荧光蛋白选自下组：绿色荧光蛋白(如eGFP、ZsGreen)、红色荧光蛋白(如tdTomato、DsRed、mCherry)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)等。

在另一优选例中，所述自噬相关基因为Atg8a基因、或LC3基因。

在另一优选例中，所述第一荧光蛋白为绿色荧光蛋白；和/或所述第二荧光蛋白为红色荧光蛋白。

在另一优选例中，所述果蝇模型的基因型为dpr-Gal4,UAS-mCD8-GFP/UAS-mCherry-Atg8a。

在另一优选例中，所述第一荧光蛋白编码基因和自噬相关基因均位于第二染色体上。

在另一优选例中，所述步骤(1)中包括步骤：

将dpr-Gal4，UAS-mCD8-GFP基因型处女蝇与UAS-mCherry-Atg8a基因型的雄性果蝇杂交，得到子I代果蝇,所述子I代果蝇的基因型为dpr-Gal4,UAS-mCD8-GFP/UAS-mCherry-Atg8a；

所述子I代果蝇中，轴突标记有mCD8-GFP荧光蛋白，Atg8a基因标记有mCherry荧光蛋白。

在另一优选例中，所述步骤(1)中包括步骤：

(1.1)将dpr-Gal4基因型果蝇与UAS-mCD8-GFP基因型果蝇杂交，然后挑选出同时含有这dpr-Gal4基因和UAS-mCD8-GFP基因的子代处女果蝇；

(1.2)将步骤(1.1)获得的子代处女果蝇与yw果蝇杂交，杂交以后选择子代中眼睛颜色较深的雄果蝇，雄果蝇基因型为dpr-Gal4,UAS-mCD8-GFP/+；

(1.3)将步骤(1.2)获得的雄果蝇单只与yw；Sco/Cyo基因型处女蝇杂交，确认杂交成功后，对亲代雄果蝇基因型进行验证，繁衍基因型正确的雄果蝇的子代，得到dpr-GaL4,UAS-mCD8-GFP/Cyo基因型的果蝇稳定系；

(1.4)随后将dpr-Gal4，UAS-mCD8-GFP/Cyo基因型处女蝇与UAS-mCherry-Atg8a基因型雄果蝇进行杂交，得到子代为dpr-Gal4，UAS-mCD8-GFP/UAS-Atg8a-mCherry基因型处女果蝇；

(1.5)步骤(1.4)获得的dpr-Gal4，UAS-mCD8-GFP/UAS-Atg8a-mCherry基因型处女果蝇与yw基因型果蝇杂交，杂交以后将子代果蝇中眼睛颜色最深的雄果蝇挑选出来单只与yw；Sco/Cyo基因型处女蝇杂交，杂交成功后，将对应的亲代雄果蝇进行基因型验证，繁衍基因型正确的雄果蝇的子代，得到dpr-GaL4,UAS-mCD8-GFP，UAS-mCherry-Atg8a/Cyo基因型的果蝇稳定系，由此完成所述转基因果蝇模型的构建。

本发明的第二方面，提供了一种研究神经元自噬的方法，所述方法包括步骤：

(1)将dpr-Gal4，UAS-mCD8-GFP基因型处女蝇与UAS-mCherry-Atg8a基因型雄性果蝇杂交，得到子I代果蝇，其中子I代果蝇的轴突被mCD8-GFP荧光蛋白所标记，子I代果蝇的Atg8a基因被mCherry荧光蛋白所标记；

(2)在子I代的雄性果蝇中，损伤果蝇一侧神经束，使用荧光显微镜追踪轴突的坏死变化趋势以及自噬在轴突上的变化情况。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，在不同损伤条件下，观察荧光蛋白变化情况，以反映轴突的坏死变化趋势以及自噬在轴突上的变化情况。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为本发明中所使用的果蝇构建流程图。

图2为自噬在果蝇翅膀模型中不同损伤时间点的变化情况。

图3为用果蝇翅膀模型来研究自噬的技术流程图。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种构建用于研究神经元自噬的活体动物模型的方法，该方法用荧光蛋白标记活体果蝇的翅膀神经束，同时使用不同的萤光蛋白标记自噬相关基因，可以很快速且清晰地观察到在损伤处理翅膀或药物喂养果蝇条件下，自噬在轴突上的变化情况，实验结果表明，本发明的方法构建的动物模型能够简单、直接的研究神经元自噬。

本发明提供了一种使用果蝇翅膀模型来研究自噬在轴突上的机制，目的是更好地研究自噬在轴突上的作用于机制研究。本发明的果蝇翅膀模型，它具有mCD8-GFP所标记的轴突，同时也表达了自噬相关的标记物mCherry-Atg8a。利用本发明的模型以及方法可以快速地研究自噬在轴突退化(degeneration)中所起的作用，从而更加深入的探讨神经轴突在急性损伤和慢性神经退行性疾病中发生变性坏死的分子机制，借此为揭示神经保护机理和寻找神经保护药物靶点提供新思路。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

转基因果蝇模型

果蝇具有许多发育学上以及遗传学的优势。最大的遗传学优势在于能做各种杂交，并且每一种可能的基因型都可以在子代中准确无误地分辨出来。其次是，果蝇饲养起来简便容易，繁殖快，生命周期相对较短，因此相对其它动物模型而言，具有快捷，经济，实验周期迅速的特点。许多的实验表明，从果蝇，小鼠到人，所研究的对象大部分在进化上都高度保守。

本发明使用的是果蝇翅膀模型，而它具有的一定的特殊优势，首先是果蝇翅膀是半透明的，翅膀上的神经束可以直接被mCD8-GFP的荧光蛋白进行可视化的标记；其次是果蝇翅膀上的神经束形成典型的轴突束，可以准确地进行外源损伤(axotomy)；还有就是果蝇翅膀对于果蝇来说是可有可无的，对其进行相关的操作不会影响果蝇的生长情况。

本发明中使用翅膀特异性的神经Gal4转录因子。dpr(defective proboscis extension response)，特异性地标记果蝇腿部、翅膀等部位的化学感应神经元。随后联用Gal4/UAS体系在翅膀上表达感兴趣的荧光蛋白，尤其是自噬相关的荧光蛋白(使用萤光蛋白标记自噬相关基因，自噬相关基因如Atg8a、LC3)如mCherry-Atg8a、GFP－LC3可以很快速且清晰地观察到在损伤处理翅膀或药物喂养果蝇条件下，自噬在轴突上的变化情况，以及更加深入地探讨自噬与轴突变性坏死的趋势成为一种可能。

本发明的目的是提供一种在果蝇翅膀模型中研究自噬的模型。

该模型一方面利用荧光蛋白标记活体果蝇的翅膀神经束，使用荧光显微镜检查神经损伤或进行基因调控后神经束荧光变化情况来评估神经退化变性坏死的情况。另一方面使用自噬在神经损伤条件下的变化，通过自噬相关的标记物如GFP-LC3，mCherry-Atg8a等反映自噬的变化情况，可检测自噬在神经损伤和神经退化坏死中所起的作用。

本发明的第二个目的是构建一种在dpr+神经元中研究自噬的方法。

所述的果蝇翅膀模型是将雌性的dpr-Gal4，UAS-mCD8-GFP处女蝇与雄性的UAS-mCherry-Atg8a转基因果蝇进行杂交得到子I代果蝇。该果蝇模型的基因型为dpr-Gal4,UAS-mCD8-GFP/UAS-mCherry-Atg8a。两种果蝇的基因型均位于果蝇的II号染色体上。

本发明的第三个目的是提供一种快速研究自噬在不同的损伤条件下的变化情况。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一种快速研究自噬的方法，是由雌性的dpr-Gal4，UAS-mCD8-GFP处女蝇与雄性的UAS-mCherry-Atg8a转基因果蝇进行杂交，得到具有子I代果蝇中具有mCD8-GFP荧光蛋白所标记的轴突，以及mCherry荧光蛋白所标记的Atg8a。在子I代的雄性果蝇中，每10只一组，给予果蝇一侧神经束不同的损伤时间，使用荧光显微镜来追踪轴突的坏死变化趋势以及自噬在轴突上的变化情况。对照组为另一侧未损伤的果蝇翅膀。

本发明果蝇轴突自噬模型的突出特点是，使用了果蝇翅膀模型来研究自噬的机制，它可以很快速的在翅膀上追踪轴突在损伤条件下的发展趋势以及自噬蛋白的变化情况。mCherry-Atg8a所标记的荧光蛋白可以很好地反应自噬的变化情况。这种果蝇翅膀模型不仅可以单独拿来研究损伤引起的轴突变性机制，也可以研究自噬在损伤条件下的机制。以及更加重要的一点就是可以同时研究自噬与轴突变性之间的关系，深入的探讨神经损伤所引发的神经轴突变性坏死的分子机制，借此为揭示神经保护机理和寻找神经保护药物靶点提供新思路。

dpr-Gal4基因型果蝇

dpr-gal4是一种特异表达在化学和机械类感觉神经元的转录激活因子，其准确的基因型是w[*]；P{w[+mW.hs]＝GawB}dpr1[PGaw],P{w[+*]＝UAS-GFP.U}2/CyO，该基因型果蝇(编号25083)购于美国布卢明顿果蝇品系中心(BDSC)。

UAS-mCD8-GFP基因型果蝇

UAS-mCD8-GFP是一种可以表达细胞膜定位绿色荧光蛋白GFP的转基因果蝇，该转基因果蝇的基因型为yw；UAS-mCD8-GFP/Cyo,表现为红眼，黄体，翘翅，构建该转基因果蝇的方法可参考文献Fang et al.Current Biology 22,590–595,April 10,2012。

yw基因型果蝇

yw果蝇的基因型为y1w67c23，编号为6599，果蝇表型为黄体，白眼；该基因型的果蝇订购于美国布卢明顿果蝇品系中心(BDSC)。

Sco/Cyo基因型果蝇

Sco/Cyo是一种类型的二号染色体平衡子果蝇，主要用于平衡致死基因以及抑制同源重组的发生，其显著特点是翅膀为卷翅，该基因型果蝇(编号为2555)购于美国布卢明顿果蝇品系中心。

UAS-mCherry-Atg8a基因型果蝇

该果蝇的完整基因型为yw；UAS-mCherry-Atg8a,表型为红眼，黄体，金翅。该基因型果蝇构建方法可以参考文献：Yu et al.Molecular Biology of the Cell Vol.20,2004–2014,April 1,2009。

本发明的主要优点在于：

(1)使用本发明方法构建的果蝇转基因模型能够简单、方便地用于研究神经元自噬。

(2)使用本发明的方法构建的转基因果蝇模型，能够满足现神经元自噬研究所要求的高通量、经济性强和时间短的要求。

(3)使用本发明的研究神经元自噬的方法，能够实现高通量筛选研究，且成本低，周期短。

(4)使用本发明的方法构建的果蝇转基因模型可以在成体果蝇中研究神经元。

(5)使用该果蝇模型时，即使对果蝇翅膀进行处理，也不会影响整体果蝇的生长情况。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1、关于神经元自噬的动物模型的构建

首先将基因型为dpr-Gal4(II号染色体)(来源于Bloomington stock)与基因型UAS-mCD8-GFP(II号染色体)(来源于Bloomington stock)进行杂交，然后挑选出子I代同时含有这两个转基因的dpr-Gal4/UAS-mCD8-GFP的的处女果蝇，并且将这种处女果蝇与yw(I号染色体)(来源于Bloomington stock)果蝇进行杂交，杂交以后将子代果蝇中眼睛颜色最深的雄果蝇挑选出来(若子代中有白眼的果蝇，则说明发生了同源重组)，然后选择眼睛颜色较深的雄果蝇单只与雌果蝇基因型为yw；Sco/Cyo(来源于A.Sehgal)的处女蝇进行杂交，直到有子III代的幼虫出现时，将其对应的子II代的雄果蝇进行翅膀的荧光检测以及PCR验证，获得重组的表型，将这样果蝇的子代选择相应的处女蝇的雌雄果蝇进行繁衍，得到dpr-GaL4,UAS-mCD8-GFP/Cyo的果蝇稳定系，进行扩增与保种。随后将雌性的dpr-Gal4，UAS-mCD8-GFP/Cyo处女蝇与雄性的UAS-mCherry-Atg8a(来源于T.P.Neufeld)转基因果蝇进行杂交，得到子代具有基因型为dpr-Gal4，UAS-mCD8-GFP/UAS-Atg8a-mCherry的处女雌果蝇，并且将这种处女果蝇与yw果蝇进行杂交，杂交以后将子代果蝇中眼睛颜色最深的雄果蝇挑选出来单只与处女雌果蝇基因型为yw；Sco/Cyo的处女蝇进行杂交，直到有子代的幼虫出现时，将其对应的亲代的雄果蝇进行翅膀的荧光检测以及PCR验证，获得重组的表型，将这样果蝇的子代选择相应的处女蝇的雌雄果蝇进行繁衍，得到dpr-GaL4,UAS-mCD8-GFP，UAS-mCherry-Atg8a/Cyo的果蝇稳定系，进行扩增与保种,由此完成神经元自噬的动物模型的构建。该模型的相关杂交见图1。

实施例2、研究自噬在轴突损伤不同条件下的变化

该果蝇翅膀模型用于研究自噬在不同损伤时间点的变化情况具体的实施方案如图2所示：第一纵行为对照组，即果蝇翅膀没有损伤的状态；第二与第三纵行为实验组，神经束损伤时间点不同的情况。在对照组中，果蝇翅膀在没有损伤的情况下，mcherry荧光信号比较弱，零散地分布在mCD8-GFP所标记的轴突上。而在轴突损伤0.5小时后(如图2所示)，mcherry-Atg8a在轴突上的荧光信号与没有损伤的神经轴突相比，也比较低，此时的mCD8-GFP所标记的轴突比较完好；损伤6小时之后，有着明显的自噬水平的增加，而此时轴突相对比较完好(如图2所示)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。