用于鉴别棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的引物、试剂盒和方法

摘要

本发明提供了一种能够快速鉴别棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的多重引物，所述多重引物分别根据如SEQ ID NO:11‑12所示的序列中的至少一条以及SEQ ID NO:13‑15所示的序列中的至少一条设计。本发明还提供一种用于鉴别棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的方法以及试剂盒，其使用所述多重引物。本发明相比现有技术有具有高度的特异性和准确性，在棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒生物农药的生产中提高产品质量的监控效率具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及用于鉴别棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的多重引物、试剂盒和方法，更具体地，涉及使用多重引物PCR鉴别棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的多重引物、试剂盒和方法。

背景技术

棉铃虫(Helicoverpa armigera(Hübner))属于鳞翅目夜蛾科，是我国的一种主要经济作物害虫，它严重为害棉花、玉米、土豆、西红柿和小麦等60多种经济作物，并且长期的化学农药防治已造成了它严重的抗药性。因此，使用生物农药防治棉铃虫势在必行。能够感染棉铃虫的杆状病毒主要有棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus，HaNPV)、和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanucleopolyhedrovirus，AcNPV)，两者隶属杆状病毒科核型多角体病毒属，是棉铃虫的天然病原体，具有较强的专化性，害虫不易对其产生抗性；其后效作用明显，当环境条件适合时，患病虫体内扩增的病毒释放到棉铃虫种群中可以造成病毒病的流行。虽然两者均能感染棉铃虫，但是其防治效果具有较大差别。HaNPV，即棉铃虫核型多角体病毒，在长期的进化中对中国棉铃虫具有更强的种群和侵染优势。把HaNPV制成生物农药用于防治棉铃虫，效果非常显著。目前，HaNPV原药和制剂已取得农药登记许可，并在国内外均已得到了广泛应用。

但是，在以棉铃虫为宿主的病毒生物农药生产过程中，棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒容易产生交叉污染，因此，如何快速准确地鉴别核型多角体病毒对于产品质量监控具有重要意义。

目前，棉铃虫核型多角体病毒的常规鉴别方法，主要采用生物测定或者限制性内切酶图谱鉴定。生物测定法通常采用待测病毒饲喂棉铃虫幼虫，如果接种后统计棉铃虫的死亡率达到80％以上，而同样方法测试对照组甜菜夜蛾或斜纹夜蛾，则死亡率小于20％，以此确定测试病毒为棉铃虫核型多角体病毒。但是，生物测定的方法通常需要十天才能完成，存在周期过长、操作步骤复杂和准确性差的缺点。而限制性内切酶图谱鉴定法，可鉴别不同寄主来源或者同种寄主NPV不同地区的分离株，但仍存在周期长、操作步骤复杂和鉴定准确性不高的问题。而在生物农药产业化生产中需要大量的检测工作，因此，上述两种方法已经不能满足常规检测。目前亟需建立一种简便快捷、灵敏度高、重复性好的检测方法。

发明内容

因此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能够快速鉴别棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的试剂盒和方法，本发明的试剂盒和方法采用多重PCR法，其具有简便快捷、灵敏度高、重复性好、低成本、通量高等优点。并且本发明提供的试剂盒和方法能够一次同时检测同一宿主的多种病毒，这也为棉铃虫核型多角体病毒的鉴别提供了新的检测手段。

针对上述目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种用于鉴别棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的多重引物，其中，所述多重引物至少包括以下引物对：

根据SEQ ID NO:11-12所示的序列中的至少一条设计的引物对以及根据SEQ ID NO:13-15所示的序列中的至少一条设计的引物对。

优选地，所述多重引物中至少包括根据SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14所示的序列设计的引物对。

其中，所述SEQ ID NO:11示出为棉铃虫核型多角体病毒的蛋白质编码区(CDS序列)，其NCBI ID为AF271059.2_cds_AAG53834.1_90，该CDS序列大小为1134bp，共编码378个氨基酸。

其中，所述SEQ ID NO:12示出为棉铃虫核型多角体病毒的CDS序列，其NCBI ID为AF271059.2_cds_AAG53876.1_133，该CDS序列大小为2034bp，共编码678个氨基酸。

其中，所述SEQ ID NO:13示出为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的编码蛋白基因Ac-helicase，其NCBI ID为KM667940.1_cds_AIU56967.1_94，该基因大小为3666bp，共编码1222个氨基酸。

其中，所述SEQ ID NO:14示出为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的编码蛋白基因Ac-IE-1，其NCBI ID为KM667940.1_cds_AIU56990.1_142，该基因大小为1749bp，共编码583个氨基酸。

其中，所述SEQ ID NO:15示出为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的编码蛋白基因Ac-gp64，其NCBI ID为KM667940.1_cds_AIU56980.1_123，该基因大小为2073bp，共编码691个氨基酸。

优选地，所述多重引物包括根据如SEQ ID NO:11-15所示的序列设计的五对特异性引物。

优选地，所述多重引物包括如SEQ ID NO:1和2、SEQ ID NO:3和4、SEQ ID NO:5和6、SEQ ID NO:7和8以及SEQ ID NO:9和10所示的引物对中的至少两对。

优选地，所述多重引物包括如SEQ ID NO:1-10所示的五对引物。

再一方面，本发明提供一种用于鉴别棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的方法，所述方法为多重PCR方法，其使用本发明的多重引物。

具体地，本发明的方法包括以下步骤：

1)提取待测样品的DNA，作为DNA模板；

2)使用本发明的多重引物和聚合酶链式反应试剂，在PCR扩增仪上进行多重PCR；

3)对扩增得到的产物进行电泳鉴别。

优选地，本发明所述的方法可以为一步法多重PCR方法。

在一个优选的实施方案中，该PCR的反应条件如下：

在95℃预变性10min后，扩增30个循环(循环条件：95℃30秒，56℃30秒，72℃1分钟)，最后延伸5分钟。

对扩增得到的PCR产物进行浓度1％的琼脂糖凝胶电泳。

优选地，在步骤2)中，所述聚合酶链式反应试剂包括PCR缓冲液、dNTP、Taq酶和本申请的多重引物组合物。

另一方面，本发明提供一种用于鉴别棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的试剂盒，所述试剂盒包括：用于提取待测样品DNA的试剂；及用于多重PCR的试剂。

优选地，所述多重PCR试剂包括本发明的多重引物和聚合酶链式反应的常规试剂。

再一方面，本发明提供一种用于鉴别棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的试剂盒在鉴别棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒中的应用。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

1)本发明提供的PCR鉴别方法具有高度的特异性和准确性。

2)常规的病毒鉴别方法如生物测定法需要10天时间，酶切鉴定需要3-5天的时间，而本申请的PCR法只需数小时。

3)本发明采用的一步法多重PCR检测方法，将PCR缓冲液、Taq酶、dNTP、引物组合物预混成Ha&Ac one-step PCR Mix，将多种酶配比混合，使反应液配制更为简单方便，缩短操作时间，同时避免了操作污染。

4)本发明的方法操作简便、敏感性好、方便快捷。

5)本发明的用于鉴别棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒多重PCR检测试剂盒，在棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒生物农药的生产中提高产品质量的监控效率具有重要意义。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

附图说明

图1为使用本发明的多重引物进行PCR的琼脂糖凝胶电泳结果，从该结果中我们可以判断得知，待测样品中既含有铃虫核型多角体病毒(HaNPV，695bp，972bp)，又含有苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV，312bp，1126bp，1222bp)。

图2为使用传统的限制性酶切反应鉴别棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的结果。

具体实施方式

本发明所使用的棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒样品来自中国科学院动物研究所。

实施例1DNA模板制备

1)分别取经纯化的棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒试样1g，并且根据以下步骤分别制备两种病毒的DNA模板

2)在所述试样中分别加入碱解液(0.15M NaCl，0.1M Na₂CO₃，0.5MEDTA，pH8.0)750微升，在37℃，1小时；

3)加入0.1N的HCl调pH至8.0，加入SDS至终浓度为0.5％，加入蛋白酶K(20mg/ml)至终浓度0.25mg/ml，37℃2h，65℃2h；

4)加入等量氯仿异戊醇混合物(氯仿：异戊醇＝24：1)抽提1次，12000rpm/min，离心5min；

5)轻轻吸取上层水相，置于新的离心管中，加入等量氯仿，12000rpm/min，离心5min；

6)取上层水相转入新管中，加入2倍体积无水乙醇混匀后，10000rpm/min离心10min；

7)弃去上清液，沉淀用70％乙醇洗涤，10000rpm/min离心10min；

8)再次去掉上清液，让沉淀的DNA在室温下干燥；

9)加入100微升水溶解DNA，从而获得试样DNA。

实施例2引物设计合成

本申请中，分别以棉铃虫核型多角体病毒的两个蛋白编码序列(NCBIID：AF271059.2_cds_AAG53834.1_90和NCBI ID：AF271059.2_cds_AAG53876.1_133)、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒基因组中的Ac-helicase基因(NCBI ID：KM667940.1_cds_AIU56967.1_94)、Ac-IE-1基因(NCBI ID：KM667940.1_cds_AIU56990.1_142)和Ac-gp64基因(NCBIID：KM667940.1_cds_AIU56980.1_123)设计特异性引物进行PCR扩增，以实现同时对以棉铃虫为宿主的两种杆状病毒的检测。

引物对(由北京天一辉远生物科技有限公司合成)，PAGE级纯化，详细序列见表1。

表1PCR引物序列

序列名称引物名称序列(5'to3')碱基数SEQ ID NO:1SEQ ID NO:11的正向引物TGCGTCGAAACCATAAAGAACAA23SEQ ID NO:2SEQ ID NO:11的反向引物GGTGCCGCGTCCAAATAGTGA21SEQ ID NO:3SEQ ID NO:12的正向引物AGCGCCAAATACAATCGTCTCAGT24SEQ ID NO:4SEQ ID NO:12的反向引物CCAACCGCTAAACCATCCAACA22SEQ ID NO:5SEQ ID NO:13的正向引物CGGCGAGCAGCGAAAATG18SEQ ID NO:6SEQ ID NO:13的反向引物GATCCCGATACCGTTGACCGACAC24SEQ ID NO:7SEQ ID NO:14的正向引物TGCGGCAGCTTCAAACTT18SEQ ID NO:8SEQ ID NO:14的反向引物CATGCTGCCGTCCTCCTTC19SEQ ID NO:9SEQ ID NO:15的正向引物AGAATGTGCCAGAATCAGAAGC22SEQ ID NO:10SEQ ID NO:15的反向引物CCTAATGGTAAAATGACGGGAG22

实施例3棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的鉴别

3.1一步法PCR预混体系(Ha&Ac>)

PCR预混体系为50μl，含:

＊：北京全式金生物技术有限公司

3.2PCR反应程序：

在95℃预变性10min后，扩增30个循环(循环条件：95℃30s，56℃30s，72℃1min)，最后延伸5min。

3.3PCR产物的电泳检测：

将PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳，100V，40min，在紫外光下检测。

3.4病毒鉴别

由于棉铃虫核型多角体病毒DNA经PCR会扩增出两条带，片段大小为695bp和972bp(表2)。

而苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒DNA经PCR会扩增出三条带，片段大小分别为303bp，1126bp和1222bp(表2)。并且使用琼脂糖凝胶电泳时可见两者有明显区别(如图1所示)。

因此，在实际操作中：

1)如果待测样品的电泳图谱中出现了五种大小不同的扩增条带，证明样品中同时包括棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒；

2)如果待测样品的电泳图谱中出现了312bp，1126bp，1222bp三种扩增条带，证明待测样品为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒；

3)如果待测样品的电泳图谱中出现了695bp，972bp二种扩增条带，证明待测样品为棉铃虫核型多角体病毒。

表2用于鉴定棉铃虫病毒和苜蓿银纹夜蛾病毒的序列

HaNPV G4^＊1，Heliocoverpa>

AcNPV E2^＊2，Autographa>

对比例1使用限制性酶切反应鉴别棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒

采用本领域技术人员已知的方法，使用限制性酶EcoRV酶切，鉴别棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，得到的结果如图2所示，由此可知采用传统的限制性酶切反应鉴别病毒，反应步骤繁琐，条带多，给鉴定工作带来麻烦。

综合分析：

以上结果证明了该多重引物PCR鉴别检测方法的特异性和准确性。常规的病毒鉴别方法如生物测定法需要10天时间，酶切鉴定需要3-5天的时间，而多重PCR法只需数小时，而且其具有良好的特异性和敏感性。

本发明采用的一步法多重PCR检测方法，将PCR buffer，Taq酶，dNTP，引物组合物预混成Ha&Ac one-step PCR Mix，将多种酶配比混合，使反应液配制更为简单方便，缩短操作时间，同时避免了操作污染。

因此本方法建立了针对棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的快速检测方法。该方法操作简便、敏感性好、方便快捷，适合用于开发鉴别棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒多重PCR检测试剂盒，在棉铃虫核型多角体病毒和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒生物农药的生产中提高产品质量的监控效率具有重要意义。