肺非小细胞癌光学三模态靶向造影剂及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种基于肺非小细胞癌CT/MR/近红外光学三模态靶向造影剂及其制备方法和应用，制备方法包括：以DOTA‑NHS修饰第五代聚酰胺‑胺树状大分子的氨基末端；随后通过聚乙二醇将叶酸酸连接至树状大分子；随后用Cy5.5进一步修饰；以修饰后的树状大分子为模板，通过硼氢化钠还原制备金纳米颗粒，之后将钆离子螯合在大分子上；最后对树状大分子表面剩余的氨基进行全部乙酰化处理；将反应后的溶液进行透析，冷冻干燥处理得到终产品；对产品进行体外、体内CT/MR/近红外光学三模态造影性能进行评价。本发明方法简单易行，具有良好的体内、外肺非小细胞癌细胞靶向效果，具有潜在的靶向CT/MR/近红外光学造影应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于造影剂的制备领域，特别涉及一种基于Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA的肺非小细胞癌CT/MR/近红外光学三模态靶向造影剂的制备方法。

背景技术

在研究和临床应用中，很多成像模式已被广泛使用，例如CT、MR、近红外光学成像，PET,SPECT。在这些模式中，CT相比其他成像模式提供了更好的空间和密度分辨率，MR成像提供了优越的软组织对比，高空间分辨率和灵活的断层性能。尽管光学成像在分辨率上不及CT或MR，光学成像提供了很好的探测灵敏度。由于这些成像模式各有优点和缺点，联合应用这些模式将会得到更为理想的效果。

纳米医学为分子影像开创了一条新路，它可以在更低剂量下提供纳米颗粒的靶向传递，这些归因于分子靶向成像的特异结合和循环时间的提高。进一步讲，它将诊断成像和治疗变成同时的诊疗由可能变成现实提供了依据。

不同的成像模式对纳米颗粒造影剂有着不同的需求。例如，CT造影剂需要通过它的高原子数和电子密度提供较高质量衰减系数。纳米金微粒已被开发为CT造影剂，其优势在于这些纳米微粒会避免临床上以碘为基础的造影剂的不足，像由快速肾脏清除率和高肾毒性带来的短暂的成像时间。其他的纳米颗粒系列也已被试图用来作为有效的CT造影剂，例如铋和钨。MR造影剂通过缩短T1或T2弛豫时间来改变MR的信号强度。自从1980年代后，基于钆的T1造影剂已被广泛发展并被用于临床诊断中。铁磁氧化物的纳米微粒作为最常用的T2造影剂也被广泛的研究。由于它降低MRI信号强度，在图像上呈现黑点，因此也被称为阴性对比剂。荧光成像的原理则是：用外界光来激发荧光体，然后用敏感的电荷偶联装置相机探测其发射。这些荧光体可以是内源性分子，像血红蛋白，或者是外生合成光学探针，譬如异硫氰酸荧光素、若丹明、青蓝合成类似物(例如，Cy5，Cy5.5，Cy7，和Cy7.5)。此外，基于稀土离子的荧光半导体纳米合成晶体(例如，量子点)和转化的纳米材料也已处于光学成像探针研究中。

目前受到广泛关注的是聚酰胺-胺型(PAMAM)树状大分子。PAMAM是一种新颖的高度支化的具有精确的成分和结构的大分子，其表面具有大量的官能团，可以连接药物分子、靶向试剂、染料等，同时其内部具有大量的空腔，可以包裹纳米颗粒，从而提高纳米颗粒的稳定性。例如将PAMAM的表面氨基乙酰化之后可以明显改善树状大分子的生物相容性，将聚乙二醇修饰在树状大分子表面可以较好的延长材料在血液中的循环时间。又如Shi等人(Shi,X.Y.et al.Small.2007,3(7),1245-1252)将叶酸分子修饰在第五代聚酰酰胺树状大分子上，通过实验证明了修饰叶酸后的聚酰酰胺树状大分子具有较好的靶向性。因此树状大分子是一种优异的纳米颗粒载体。

现有技术中可以将纳米金微粒用于癌细胞的CT成像，同时将钆螯合在纳米金微粒上并以此作为成像探针用于癌症的CT/MR双模式成像，这是基于金微粒(用于CT成像)和钆离子(用于T1加权MR成像)的共存。这些前面的工作突出显示了以树状大分子作为多用途纳米平台建立一种多功能纳米探针用于癌细胞的多模式靶向成像的可行性。假定将钆和Cy5.5合成在纳米金微粒形成探针用于癌细胞的CT/MRI/光学三模式靶向成像。这种新型的纳米探针具备这三种成像方法各自的优势，并可能被运用在检测早期癌症上。

在世界范围内，肺癌是最常见的癌症。在所有肺癌的病理类型中，超过80％的为非小细胞肺癌(NSCLC)，它包括：鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌，和未进一步分类的非小细胞癌。现阶段，非小细胞癌患者的5年相对生存率刚刚达到17％。非小细胞癌的高发生率和死亡率要求我们大力开发新技术来解决此种癌症的诊断和治疗。

叶酸受体(FR)是一单链糖蛋白，它过度表达在上皮恶性肿瘤上，包括肺非小细胞癌，并且参与了肿瘤的进展过程。叶酸受体因其在靶向过程有着高效、低毒、特异结合等特性被用于肿瘤的诊断或治疗，有些已被用于临床研究中，例如farletuzumab和vintafolide。我们也研发了一种叶酸受体靶向造影剂用于肺腺癌细胞的靶向CT成像。

在目前的研究中，经钆离子和Cy5.5修饰将纳米金微粒成功合成Cy5.5-Gd-AuDENPs，然后将叶酸共轭在Cy5.5-Gd-AuDENPs上使其作为特异分子用于肺非小细胞癌细胞的多模式靶向成像的研究。这些Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA用于体内、外肺非小细胞癌细胞的CT/MR/光学三模式靶向成像。

检索国内外有关金纳米颗粒用于CT/MR/光学三模式造影方面的文献和专利结果发现：在本发明完成之前，还没有发现基于Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA的肺非小细胞癌CT/MR/近红外光学三模态靶向造影剂的制备及其造影性能研究方面的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种肺非小细胞癌CT/MR/近红外光学三模态靶向造影剂的制备方法，该方法制备过程温和，简单易行，制备得到的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA具有良好的稳定性、生物相容性、体外肺非小细胞癌细胞靶向性能，以及特异的肺非小细胞癌肿瘤模型CT/MR/近红外光学三模态造影效果，具有潜在的靶向CT/MR/近红外光学三模态诊断应用前景。

本发明的一种肺非小细胞癌光学三模态靶向造影剂的制备方法，包括：

1)第五代聚酰胺-胺树状大分子(G5.NH₂)加入溶剂中，得到溶液，然后加入DOTA-NHS，搅拌反应24h，得到G5.NH2-DOTA。

2)按照之前的研究合成FA-PEG-COOH。用EDC活化FA-PEG-COOH 3h后，逐滴加入G5.NH₂-DOTA溶液中，强磁力搅拌3d，得到G5.NH₂-DOTA-(PEG-FA)。

3)mPEG-COOH被EDC活化3h后，加入G5.NH₂-DOTA-(PEG-FA)中，磁力搅拌3d，得到G5.NH₂-DOTA-(PEG-FA)-mPEG。

4)将Cy5.5加入G5.NH2-DOTA-(PEG-FA)-mPEG中，在黑暗条件下强磁力搅拌1h得到G5.NH₂-DOTA-(PEG-FA)-mPEG-Cy5.5。其中，Cy5.5和G5.NH₂-DOTA-(PEG-FA)-mPEG摩尔比为1:3.取上述制备好的G5.NH₂-DOTA-(PEG-FA)-mPEG-Cy5.5溶液，加入氯金酸水溶液，搅拌30min。随后加入硼氢化钠溶液。搅拌2h。之后，将含有G5树状大分子的Gd(NO3)₃水溶液逐滴加入上述混合液，搅拌24h得到{(Au>3)₃摩尔比为1:35.

5)上述步骤反应完后，加入三乙胺，磁力搅拌30min，然后，加入乙酸酐，搅拌反应24h，透析，冷冻干燥即得到终产品Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA。

所述步骤1)中第五代聚酰胺-胺树状大分子的浓度为3-5mg/mL.

所述步骤1)中溶剂为二甲基亚砜DMSO。

所述步骤2)中聚乙二醇(PEG)两末端分别为氨基和羧基，Mw＝2000。

所述步骤2)中EDC的溶剂为二甲基亚砜DMSO，EDC的浓度为3-5mg/mL。

所述步骤2)中FA-PEG-COOH的浓度为5-10mg/mL。

所述步骤3)中mPEG-COOH的浓度为5-15mg/mL。

所述步骤4)中氯金酸水溶液浓度为30mg/mL，硼氢化钠溶液浓度为5-10mg/mL。

所述步骤4)Gd(NO₃)水溶液的浓度为30-35mg/mL。

所述步骤5)中透析分别为PBS缓冲液和水透析。

所述步骤5)中所得Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA为靶向造影剂，应用于裸鼠肺非小细胞肺癌肿瘤模型CT/MR/近红外光学三模态靶向造影成像。

使用NMR(核磁共振)、UV-Vis(紫外可见光谱)、TEM(透射电子显微镜)、DLS、MTT、CT/MR/近红外光学成像设备、ICP-AES、光镜表征本发明获得的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA的结果分别如下：

(1)NMR测试结果

¹H>2树状大分子的表面上，通过相应的NMR峰的融合计算出每个G5.NH₂树状大分子表面上mPEG-COOH的平均数量7.3。

(2)UV-Vis测试结果

UV-Vis测试结果表明：本发明中制备得到的纳米颗粒在280nm和650nm左右出现了明显的吸收峰，这是修饰在树状大分子表面的FA和Cy5.5的特征吸收峰。

(3)TEM测试结果

TEM测试结果显示了金纳米颗粒的尺寸及尺寸分布。参照说明书附图4。金纳米颗粒的平均尺寸为4.0nm，表现出良好的单分散性。

TEM也同样用来显示金纳米颗粒在亚细胞分室中的分布。参照说明书附图10。图10b清楚地说明在用浓度为1mg/mL的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA培养后，在细胞的细胞质中可以发现较多的电子染色颗粒。而图10a中显示未经Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA培养的SPC-A1细胞质中没有发现电子染色颗粒，与图10b形成强烈对比。TEM证实了Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA内化在细胞内而非粘附于细胞表面。内化过程可能与下列3种不同的机制有关：受体介导的内吞作用，吞噬作用以及通过细胞壁的扩散。

(4)DLS测试结果

DLS结果显示Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA的水合粒径的尺寸分布，参照说明书附图5，水合粒径平均值在126.0nm左右，表明Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA具有较好的水溶性。

(5)细胞毒性试验结果

细胞毒性试验结果表明在0-1.5mg/mL范围内，该纳米颗粒没有对NCI-H460细胞活力造成影响，没有表现出明显的细胞毒性。

(6)体外、内细胞CT/MR/近红外光学靶向成像结果

体外细胞CT/MR/近红外光学靶向成像结果见附图6、7、8。分别对培养在不同的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA浓度中(0、0.25、0.5、1和2mg/mL)的HCI-H460细胞悬浮液进行CT，TIW MR和近红外成像.。结果显示培育在高浓度Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA的NCI-H460肿瘤细胞的CT/MR/近红外的图像亮度及信号强度(CT的信号强度为CT值)高于未培养或培养在低浓度Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA的细胞。

体内细胞CT/MR/近红外光学靶向成像结果参照说明书附图12、13、14。图12和13分别显示了静脉注射前后Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA肿瘤的CT和T1W MR图像，以及CT)和MR信号强度。相比于注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA前(P<0.05)，注射后2h的肿瘤部位显示了明显的增强，体现在更高的CT值和MR信号强度。另外，发现从注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA 2小时至4小时这段时间肿瘤的CT值或MR信号强度仍旧保持着较高的水平。图14显示注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA前后肿瘤近红外光学成像的图像(图14a)及光学信号强度(图14b)。相比于注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA前(P<0.05)，皮下注射后肿瘤部位出现了明显的可见增强，并体现在明显的光学信号强度。另外，注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA后，肿瘤部位的高信号强度可以持续6小时之久(P<0.05)。这些均清晰地说明研发的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA可被用于体内细胞CT/MR/光学三模态靶向成像。

(7)ICP-AES测试结果

用ICP-AES计算体内细胞摄取纳米颗粒的数量。参照说明书附图9。培育0.25或0.5mg/mL纳米探针的细胞摄取金元素的量远高于那些阴性对照组(0.43±0.28or 0.64±0.28pg/cell versus 0.04±0.01pg/cell,P<0.05).尤其是培育1和2mg/mL纳米探针的细胞摄取金元素的量更加高于那些阴性对照组(1.09±0.32and 1.31±0.52pg/cell,P<0.01vs negative control cells)。然而在浓度0.25和0.5之间，差别不是很大，同样地，在浓度1和2之间亦如此。测试结果提示了图像和信号强度的增强是因为细胞摄取了一定数量的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA。

ICP-AES也用来测量纳米颗粒在体内的生物分布。参照说明书附图16，纳米颗粒主要分布在心、肝、脾、肺、肾等主要器官和肿瘤中。可以发现大量的纳米金颗粒除了存在于肿瘤内，还存在于脾、肝和肾中。这提示Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA的清除可能通过网状内皮系统(RES)和肾/尿路途径来完成。此外，在注射纳米金颗粒后，直到6小时纳米颗粒的生物分布仍旧保持着相对高的水平。这和体内细胞CT/MR/光学靶向成像的图像及信号强度的结果是相一致的。这也进一步证实了肿瘤CT/MR/光学成像增强和信号强度的增加皆因肿瘤对纳米颗粒的摄取和累积所致。

(8)体内细胞对纳米颗粒的摄取测试结果

光镜下观察经银染色增强体内细胞。参照说明书附图15，可以发现大量的固定在肿瘤的细胞质中的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA颗粒呈现出明显的黑点(图15b)。而对照组(图15a)中未出现黑点。这些结果提示肿瘤CT、MR及近红外光学成像的增强是因静脉注射后肿瘤细胞摄取Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA所致。

本发明以靶向配体叶酸修饰的树状大分子为模板，通过原位化学合成法制备金纳米颗粒，所得产品具有良好的稳定性和靶向肿瘤CT/MR/红外线光学诊断效果。

本发明涉及了两个基本原理：

(1)表面修饰合适数目的叶酸，在不影响纳米颗粒稳定性的前提下，提供良好的肺小细胞癌靶向性能。

(2)聚乙二醇的修饰可以增加树状大分子模板的外围尺寸，提高包金量，提供良好的稳定性，以及减少纳米颗粒被网状内皮系统吞噬，利于纳米颗粒靶向肿瘤部位。

有益效果

(1)本发明的制备过程温和，简单易行；

(2)本发明方法制备的金纳米颗粒具有良好的稳定性和生物相容性；

(3)本发明制备得到的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA颗粒具有特异性靶向肿瘤CT/MR/近红外光学诊断效果，为新型靶向造影剂的开发打下了良好的实验基础。

附图说明

图1为本发明制备的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA的制备方法的原理图；

图2为本发明制备的G5.NH2-DOTA-(PEG-FA)-mPEG的¹H>

图3为本发明制备的G5.NH₂-DOTA-(PEG-FA)-mPEG和G5.NH₂-DOTA-(PEG-FA)-mPEG-Cy5.5在pH＝6和温度为25℃条件下的UV-Vis图谱；

图4为本发明制备的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA的TEM图片(a)，以及相应的尺寸分布直方图(b)；

图5为本发明制备的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA溶解于水中水合粒径的尺寸分布；

图6为本发明制备的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA在不同浓度下(0、0.25、0.5、1和2mg/mL)与NCI-H460细胞共培养后的CT图片(a)和CT值图(b)；

图7为本发明制备的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA在不同浓度下(0、0.25、0.5、1和2mg/mL)与NCI-H460细胞共培养后的MR图片(a)和MR信号强度图(b)；

图8为本发明制备的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA在不同浓度下(0、0.25、0.5、1和2mg/mL)与NCI-H460细胞共培养后的近红外光学图片(a)和光学信号强度图(b)；

图9为本发明制备的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA在不同浓度下(0、0.25、0.5、1和2mg/mL)与NCI-H460细胞共培养后细胞对金颗粒的摄取量；

图10为本发明制备的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA未与细胞共培养(a)和在1mg/mL浓度下(0、0.25、0.5、1和2mg/mL与细胞共培养12h的TEM图片，箭头显示的是共培养细胞中细胞质的高电子染色纳米颗粒，白色箭头指示的为细胞核；

图11为本发明制备的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA在不同浓度下与SPC-A1细胞共培养4小时后MTT对细胞活性的测试。

图12为本发明制备的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA(15mgCy5.5-Gd-Au DENPs-FA溶于100-μLPBS悬浮液)皮下静脉注射接种有NCI-H460细胞的裸鼠前及注射后1、2、4和6h的CT图片(a)和CT值(b)，白色箭头指示的是肿瘤部位。

图13为本发明制备的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA(15mgCy5.5-Gd-Au DENPs-FA溶于100-μLPBS悬浮液)皮下静脉注射接种有NCI-H460细胞的裸鼠前及注射后1、2、4和6h的T1W MR图片(a)和MR信号强度(b)，白色箭头指示的是肿瘤部位。

图14为本发明制备的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA(15mgCy5.5-Gd-Au DENPs-FA溶于100-μLPBS悬浮液)皮下静脉注射接种有NCI-H460细胞的裸鼠前及注射后1、2、4和6h的近红外光学图片(a)和光学信号强度(b)，白色箭头指示的是肿瘤部位。

图15为本发明制备的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA(15mg Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA溶于100-μL PBS悬浮液)皮下静脉注射接种有NCI-H460细胞的裸鼠前(a)及注射后(b)肿瘤组织的银染色增强的光镜图片；

图16为本发明制备的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA(15mgCy5.5-Gd-Au DENPs-FA溶于100-μLPBS悬浮液)皮下静脉注射后不同时间点裸鼠心、肝、脾、肺、肾和肿瘤部位金颗粒的生物分布。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

首先，按照之前研究合成FA-PEG-COOH。

取第五代聚酰胺-胺树状大分子(G5.NH₂)81.47mg，溶于20mL>2-DOTA溶液中，随后强磁力搅拌3d,得到的G5.NH2-DOTA-(PEG-FA)已经被EDC活化好3小时的mPEG-COOH(93.96mg)进一步修饰，在磁力搅拌反应3d后得到G5.NH₂-DOTA-(PEG-FA)-mPEG树状大分子。

如图2所示，¹H>2树状大分子的表面上，通过相应的NMR峰的融合计算出每个G5.NH₂树状大分子表面上mPEG-COOH的平均数量为7.3。紫外图谱中280nm的吸收峰为FA的吸收峰，证明了FA的成功修饰，如图3所示。

实施例2

将实施例1中的G5.NH₂-DOTA-(PEG-FA)-mPEG树状大分子用3摩尔当量的Cy5.5(6.73mg)进一步修饰，在黑暗条件下强磁力搅拌1h得到G5.NH₂-DOTA-(PEG-FA)-mPEG-Cy5.5。

如图3所示，紫外图谱中650nm的吸收峰为Cy5.5的吸收峰，证明了Cy5.5成功共轭在了树状大分子的表面上。

实施例3

取实施例2制备好的G5.NH₂-DOTA-(PEG-FA)-mPEG-Cy5.5树状大分子溶液，加入氯金酸溶液5.72mL(30mg/mL)，搅拌30分钟。随后加入冰冻的载有超过5倍摩尔金微粒的硼氢化钠溶液(78.98mg，10mL)，搅拌数分钟至反应混合液颜色变至酒红色时，提示纳米金颗粒已经合成在大分子上。搅拌反应混合液2h完成此反应。之后，将Gd(NO₃)₃水溶液(32.80mg，1mL)和35摩尔当量的G5树状大分子逐滴加入上述混合液，搅拌24h得到{(Au°)200-G5.NH₂-DOTA(Gd)-(PEG-FA)-mPEG-Cy5.5}DENPs。

反应后，加入三乙胺160.0uL，磁力搅拌30min，然后，加入乙酸酐130.3uL，搅拌反应24h。反应结束后，用PBS缓冲液(3次，2L/次)和蒸馏水(3次，2L/次)对反应混合液进行透析3d。然后进行冷冻干燥处理得到终产品Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA。

如图4所示，TEM的测试结果表明，制备的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA的颗粒尺寸分布为4.0±1.3nm，显示出Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA具有良好的单分散性，未出现团聚现象。DLS结果显示Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA的水合粒径大约在126.0nm，如图5所示，表明Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA具有较好的水溶性。

实施例4

将NCI-H460细胞与浓度分别0、0.25、0.5、1、和2mg/mL的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA在37℃下共培养4h。之后用PBS冲洗3次，将细胞胰蛋白酶化，离心，并再悬浮在100mL的eppendorf试管中。用于MR成像的细胞被分散固定在0.5％的琼脂糖上。然后把每个试管中的细胞悬浮液放置在自行设计的扫描架上分别成像，所用条件为：(1)CT：80kv，20mA，层厚0.6mm；(2)3.0T MRI：手腕接收线圈，T1W要求用SE/2D序列并以下参数:TR＝400ms,TE＝12.2ms,NEX＝4.00,matrix＝256X256,层厚＝2mm，层间距＝0.8mm，FOV＝12cm；(3)近红外光学成像系统，675nm激发光和730nm接收光。CT值，T1W MR信号强度和光学成像信号强度根据商家提供的软件测定。每组实验重复三次。

分别对培养在不同的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA浓度中(0、0.25、0.5、1和2mg/mL)的HCI-H460细胞悬浮液进行CT成像，如图6所示，TIW MR，如图7所示，和近红外成像如图8所示。图6a、图7a、图8a中显示培育Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA和未培育Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA的NCI-H460细胞的断层CT图像、T1W MR断层图像、近红外光学成像。图6b、图7b、图8b皆对上述图像进行量化分析。结果显示培育在高浓度Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA的NCI-H460肿瘤细胞的CT/MR/近红外的图像亮度及信号强度(CT的信号强度为CT值)高于未培养或培养在低浓度Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA的细胞。

实施例5

将培养好的NCI-H460细胞种于6孔板中24h，按照30万细胞/孔的密度接种。然后加入浓度分别为0、0.25、0.5、1和2mg/mL的Gd-AuDENPs-Cy5.5，与细胞共培养4小时。经PBS冲洗3次后，将细胞胰蛋白酶化，离心收集，再经王水分解。每组实验重复三次。

用ICP-AES量化细胞对纳米探针的摄取，如图9所示。结果表明共培养0.25或0.5mg/mL纳米探针的细胞摄取金元素的量远高于那些阴性对照组(0.43±0.28or 0.64±0.28pg/cell对0.04±0.01pg/cell,P<0.05).尤其是共培养1和2mg/mL纳米探针的细胞摄取金元素的量更加高于那些阴性对照组(1.09±0.32and 1.31±0.52pg/cell,P<0.01对阴性对照组)。然而在浓度0.25mg/mL和0.5mg/mL之间，细胞摄取的金元素差别无统计学意义，同样地，在浓度1mg/mL和2mg/mL之间差别亦无统计学意义。

实施例6

将培养好的NCI-H460细胞种于6孔板中，按照30万细胞/孔的密度接种在RPMI1640培养液里，加入10％FBS，放入湿化的保温箱(37℃,5％CO₂)24h以生长到80％汇合。把浓度为1mg/mL的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA放入每个孔中培养12h。然后丢弃培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞，将细胞胰蛋白酶化，离心，然后再用PBS缓冲液冲洗3次。最后在4℃下用在0.2M的磷酸盐缓冲液(PH7.2)的2.5％戊二醛固定12h。在用缓冲液外加冲洗后，用30％、50％、70％、95％和100％的乙醇溶液对细胞脱水。细胞样本嵌在Epon812上，接下来聚合。然后，通过使用超薄切片机将嵌入的细胞切片，厚度为75nm。把细胞切片安装在200网眼的铜网格上，然后用乙酸双氧铀和柠檬酸铅对比染色5分钟后进行TEM显像。在60kv工作电压下，网格可在H600TEM下被直观显示。

用TEM显示纳米颗粒在亚细胞器中的分布，如图10所示，图10b清楚地说明与浓度为1mg/mL的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA共培养后，细胞的亚细胞器中可以发现很多的电子染色颗粒。而图10a中显示未与Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA共培养的SPC-A1细胞的亚细胞器中没有发现电子染色颗粒。TEM证实了Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA内化在细胞内而非粘附于细胞表面。内化过程可能与下列3种不同的机制有关：受体介导的内吞作用，吞噬作用以及通过细胞壁的扩散。

实施例7

将培养好的NCI-H460细胞种于96孔板中(一式四份)24h，按照1万细胞/孔的密度接种。用PBS冲洗两次，各一分钟，然后加入不同浓度的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA(0,0.25,0.5,0.75,1.0,1.25,1.5,1.75和2mg/mL)，与细胞在37℃和5％CO2条件下共培养4小时。随后，丢弃培养基，用PBS冲洗细胞3次，并把200mL新鲜的RPMI1640培养基和20mL MTT(5mg/mL，溶于PBS缓冲液)加入每个孔中，在37℃下和细胞共培养4h。然后，再次丢弃培养基，用PBS冲洗后，将200mL的DMSO加到每个孔的细胞中。最后，在每个孔中用酶标仪(Bio-tek)检测490nm处的吸光度值。

MTT测试结果显示，在实验浓度范围内(0-1.5mg/mL)，Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA对NCI-H460细胞不表现出细胞毒性，显示良好的细胞相容性。

实施例8

取裸鼠24只，建立NCI-H460肿瘤模型。对裸鼠皮下接种培养好的NCI-H460细胞，每只接种约100万个NCI-H460细胞。大约3周后，肿瘤结节体积达到1.0±0.15cm³。其中5只裸鼠用于体内CT/MR/光学三模式成像的实验，18只用于体内纳米探针分布的研究，最后一只用对FR进行免疫组织化学染色的方法做肿瘤的病理。

首先将用于体内CT/MR/光学三模式成像实验的裸鼠腹腔内注射水合氯醛(10wt％)后麻醉，然后运用近红外，CT，MRI对其成像。在静脉注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA(100-μL PBS悬浮液包含15mg Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA)前和注射后1、2、4和6时间点上，应用每种成像模式对其成像。种植肿瘤的裸鼠的多模态成像分别对以下应用要求：(1)CT：80kv，50mA，层厚0.6mm；(2)MR：3.0T MRI带有定制的啮齿动物接收线圈，T1W要求SE/2D序列含以下参数：TR＝2000ms，TE＝81.2ms，NEX＝4.00，matrix＝256X160，层厚＝2mm，层间距＝0.8mm，FOV＝6cm；(3)近红外光学成像系统，675nm激发光和730nm接收光。CT值，T1W MR信号强度和光学成像信号强度根据软件测定。

分别对静脉注射前后Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA肿瘤进行CT、MR、和近红外光学成像(附图12、图13、图14)。图12及图13说明相比于注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA前(P<0.05)，注射后2h的肿瘤部位显示了明显的增强，体现在更高的CT值和MR信号强度。图14说明相比于注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA前(P<0.05)，皮下注射1h后肿瘤部位出现了明显增强的光学信号强度。

实施例9

接种NCI-H460细胞的裸鼠完成实验后，将肿瘤摘除，然后固定在10％的福尔马林缓冲液，脱水并包埋于石蜡。用常规超薄切片机将石蜡包埋的样品切成3mm的薄片。这些薄片然后脱蜡，用PBS彻底冲洗，接下来用银增强装置染色。薄片然后用PBS冲洗并用1％核固红对比染色。再用PBS冲洗3次后，对薄片进行风干，脱水处理，安装在载玻片上用于光镜观察。

此外，银增强染色和FR免疫组织化学染色被用在相同的肿瘤组织切片以局部联合FR和纳米探针。简要地讲，在37℃下肿瘤切片经3％的过氧化氢处理15min，目的在于灭活内源性过氧化物酶，并用PBS冲洗三遍5分钟。在37℃下用1％的山羊血清封闭肿瘤切片10min，并用初级多克隆抗-FR抗体(兔抗-人，1:100)培养1h37℃。在用PBS彻底冲洗9min后，肿瘤切片用二级生物素化的抗体(鼠抗-兔，1:200)在37℃下培养15min。然后，彻底冲洗肿瘤切片，最后用ABC复合试剂在37℃下培养15min。用DAB染色。用PBS冲洗样本9min后，用苏木精对肿瘤切片对比染色5min，然后用自来水冲洗。肿瘤切片经风干，脱水处理后，安在盖玻片上用光镜观察图像。

对接种NCI-H460细胞的裸鼠的肿瘤组织进行银染色增强，如图15所示。发现大量的固定在肿瘤的细胞质中的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA探针呈现出明显的黑点，如图15b所示。作为对照，图15a对照组中未出现黑点。这些结果提示我们肿瘤CT,MR及光学成像的增强是因静脉注射后肿瘤细胞摄取Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA所致。

为了进一步证实摄取Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA是由探针上FA和肿瘤上的FR结合引起，在NCI-H460肿瘤组织注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA后，银增强染色和FR免疫组织化学染色被用在相同的肿瘤切片以局部联合FR和纳米颗粒。结果显示在相同的NCI-H460细胞中Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA被染成黑点，表达的FR被染成棕色。这些结果进一步证实细胞在摄取Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA的过程中，FA起到了关键作用。

实施例10

在静脉注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA(100-μL PBS悬浮液包含15mg Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA)完成成像实验后，对15只接种NCI-H460细胞的裸鼠处以安乐死。然后，将心、肝、脾、肺、肾等脏器和肿瘤在不同的时间点(分别在注射后1、2、4、6和24h)提取和称重。在注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA后的每个时间点，有3只裸鼠被处以安乐死以获取器官和肿瘤。对于阴性对照组，没有注入Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA的3只接种NCI-H460细胞的裸鼠被亦被处以安乐死来获取器官和肿瘤，当晚所有的器官和肿瘤组织用王水分解。

用ICP-AES(电感耦合等离子体原子发射光谱法)量化不同器官和肿瘤组织中的金含量，如附图16所示。Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA主要分布在、心、肝、脾、肺、肾等主要器官和肿瘤中，我们发现除了肿瘤，大量的金颗粒存在于脾、肝和肾。这提示Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA的清除可能通过网状内皮系统(RES)和肾/尿路途径来完成。此外，在注射纳米金颗粒后，直到6小时纳米颗粒的生物分布仍旧保持着相对高的水平。这和体内细胞CT/MR/光学靶向成像的图像及信号强度的结果是相一致的。这也进一步证实了肿瘤CT/MR/光学成像增强和信号强度的增加皆因肿瘤对纳米颗粒的摄取和累积所致。

本发明的CT/MR/近红外光学三模态成像，可以弥补单一模式成像的不足，提供更加丰富的诊断信息，因此比更加能满足临床需要。由于树状大分子上修饰了用于螯合钆离子的试剂DOTA、-PEG-FA，导致树状大分子表面空间位阻的增加，使荧光分子Cy5.5并不容易修饰到树状大分子上，且由于Cy5.5的存在，会影响造影剂的MR成像性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。