丹酚酸A在单独或多药联合治疗肾病综合症中的应用

摘要

本发明涉及中药有效成分的用途，主要涉及丹酚酸A在单独或多药联合治疗肾病综合症的应用。本发明公开了丹酚酸A或其可药用盐在单独或多药联合治疗肾病综合症的应用，本发明的目的在于将丹酚酸A引入到肾病综合症的治疗中，采用单独或多药联合对激素抵抗型肾病综合症进行治疗，通过引入丹酚酸A，增强糖皮质激素的疗效，有助于糖皮质激素在临床的合理应用，提高其治疗的有效性，以及减少激素毒性和激素抵抗；同时，本发明还明确了丹酚酸A的作用特点及其分子机制，为丹酚酸A治疗肾病综合症提供可靠依据，为研发新的治疗药物开辟新的途径，也为同类中药的开发奠定一定的基础。

说明书

技术领域

本发明涉及中药有效成分的用途，主要涉及丹酚酸A在单独或多药联合治疗 肾病综合症的中应用。

背景技术

慢性肾病(CKD)已逐渐成为我国社会公共健康的重大问题，近年来死亡率 大幅增加。目前，我国慢性肾病患者约为1-1.2亿人，迫切需要采取有效的防治 措施。

肾病综合症(nephroticsyndrome,NS)为肾内科常见病、多发病，是一组 以大量蛋白尿、水肿、高脂血症和低蛋白血症为基本特征的临床症候群，是导致 终末期肾衰竭的重要原因之一。NS病程长，病情复杂，如何对其进行有效的治 疗是当前肾病治疗的一大难点。目前，NS尚无理想的、有针对性的疗法。而且， 同其它疾病(如心血管、肿瘤和糖尿病)治疗药物相比，肾脏疾病的新药研发明 显落后，这使得肾病专家不得不采用治疗其它疾病的药物来治疗肾小球疾病。糖 皮质激素是治疗NS的“抱脚石”，对疾病频繁复发、激素依赖或激素抵抗患者， 临床可供选择的治疗方案有：大剂量激素冲击疗法、细胞毒或新型免疫抑制剂或 生物制剂(如环磷酰胺、环孢素A、他克莫司、霉酚酸酯、利妥昔单抗)单独或 联合激素疗法。上述方法治疗NS虽有一定的疗效，但是NS病程长，长期使用其 不良反应不容忽视。长期应用激素会导致感染、高血压、骨质疏松、白内障等副 作用，新的免疫抑制剂也会带来更多、更严重的毒副反应，如严重肝肾功能损害、 严重感染、糖尿病、血液学和胃肠道毒性等【韦喆.难治性原发性肾病综合症的 治疗现状】。而且，在治疗过程中，部分患者也对新的免疫抑制药物产生抵抗。 故临床仍急需疗效显著且安全性高的NS治疗药物，寻找有效减少蛋白尿的方法 仍是当前重要的研究课题。

根据对初始标准激素疗法的反应性，可将NS分为激素敏感型NS(SSNS)、 激素依赖型NS(SDNS)和激素抵抗型NS(SRNS)。其中SRNS的诊断、预后和治 疗对肾病专家具有显著的挑战性。在原发性NS中，SRNS患病率为10％～40％，如 不采取有效的治疗，5～10年内，约有半数的SRNS患者会发展成为终末期肾衰竭， 严重威胁患者生命健康。

肾病综合症病理机制复杂，与遗传、氧化应激、免疫损伤、炎症等有关。瞬 时受体电位阳离子通道6(TRPC6)和血管生成素样蛋白4(Angptl4)相关信号 通路在NS甚至是激素抵抗型NS的发生中具有重要作用，TRPC6突变或表达升高 可导致遗传性或获得性NS，而Angptl4是受糖皮质激素敏感调节的微小病变肾 病(MCD)致病基因。因此，调节TRPC6和Angptl4相关信号通路可能会成为治 疗NS以及激素抵抗NS的重要手段。

激素依赖以及激素抵抗NS一直以来都是临床治疗的难点。在临床上，可通 过联合用药来提高疗效，减少不良反应和药物抵抗的发生。有关多药联合治疗难 治性NS已有多项研究报道，多药联合的原理是联合使用作用于不同信号级联水 平的药物，药物之间相互补充，同时抑制引起不同组织损伤的多个反应途径，从 多个方面保护肾脏，多药联合治疗可有效缓解NS，尤其是激素抵抗型NS。然而， 鉴于目前所联用的药物毒性较大，多药联合治疗SRNS的长期安全性和有效性仍 有待大型的临床试验加以验证。

现代研究中，有关中草药或中草药提取物治疗NS的研究并不少见，从中药 中寻找毒副作用小、疗效好的NS治疗候选药物联合治疗SRNS具有很好的开发前 景。丹酚酸A(Salvianolicacid,SAA)是我国传统活血化瘀中药丹参的主要 水溶性活性成分，多项药理学研究证明，丹酚酸A是一个多靶点的化合物，具有 多方面的药理活性，尤其是具有较强的抗氧化活性。它是丹参多种水溶性提取物 中抗氧化活性最强的物质，可有效清除超氧阴离子，抑制氧自由基引起的细胞膜 过氧化损伤，作用比抗氧剂维生素E强百倍甚至千倍【黄诒森，张均田.丹参中 三种水溶性成分的体外抗氧化作用[J].药学学报，1992，27(2)：96-100.LiuGT, etal.Protectiveactionofsevennaturalphenoliccompoundsagainst peroxidativedamagetobiomembranes[J].BiochemPharmacol,1992, 43(2):147-152.】。前期的一些研究证明，丹酚酸A体内外可有效抑制血小板粘 附、活化、聚集功能。体外实验显示，丹酚酸A能够对抗多种诱导剂引起的大鼠 或人血小板聚集，降低血小板中cAMP含量，减少ADP诱导的血小板P选择性表 达和纤维蛋白原与受体的结合。同时，丹酚酸A还能抑制PI3K表达，降低Akt 磷酸化水平【FanHY,etal.Antiplateletandantithromboticactivitiesof salvianolicacidA[J].ThrombRes,2010,126(1):17-22.HuangZS,etal. Salvianolicacidinhibitsplateletactivationandarterialthrombosisvia inhibitionofphosphoinositide3-kinase[J].JThrombHaemost,2010,8(6): 1383-1393.】。体内试验证实，丹酚酸A可有效减轻大鼠动-静脉旁路血栓质量， 抑制ADP诱导的血小板聚集，表现出良好的抗血栓作用，同时还能改善血液瘀滞 模型大鼠血液流变性【FanHY,etal.Antiplateletandantithrombotic activitiesofsalvianolicacidA[J].ThrombRes,2010,126(1):17-22.】。 这些结果提示丹酚酸A是一个很有前景的防治血栓栓塞事件的药物。此外，丹酚 酸A还具有抗炎【OhKS,etal.SalvianolicacidAsuppress lipopolysaccharide-inducedNF-κBsignalingpathwaybytargetingIKK β[J].IntImmunopharmacol,2011,11(11):1901-1906.】、心脑血管保护以 及神经保护等方面的作用【张莉，等.丹酚酸A的研究与进展[J].中国中药杂志， 2011，36(19)：2603-2609.】，作用机制与抑制炎症因子生成、调节线粒体功能、 减少细胞凋亡有关。近年来的一些研究也报道，丹酚酸A还能预防大鼠糖尿病及 糖尿病肾病的发生，降低血糖，改善糖代谢和脂质代谢紊乱【方莲花，等.丹酚 酸A对实验性糖尿病大鼠的降糖作用及其机制初探[J].中国新药杂志，2011， 20(21)：2063-2068】。丹酚酸A肾脏保护方面的作用主要表现在降低糖尿病肾病 大鼠血中肌酐、尿素氮水平，减少尿中蛋白含量，改善肾脏病理损伤【张莉，等. 丹酚酸A对高脂饮食致2型糖尿病大鼠肾病的影响[J].中国药理学通报，2009， 25：241.】。

目前国内外尚无丹酚酸A治疗肾病综合症及抑制肾小球足细胞病变方面的 报道，因此，将丹酚酸A引入到肾病综合症中(单独或多药联合治疗)，进行相 关方面的研究具有重大现实意义。

发明内容

基于上述背景，本发明的目的在于将丹酚酸A引入到肾病综合症的治疗中， 公开了丹酚酸A或其可药用盐在单独治疗或多药联合治疗肾病综合症的应用， 以及丹酚酸A单独或联合激素治疗激素抵抗型肾病综合症中的应用。通过引入丹 酚酸A，发挥对糖皮质激素协同增效的作用，提高激素治疗的有效性，减少激素 毒性和激素抵抗；同时，本发明还明确了丹酚酸A的作用特点及其分子机制，为 丹酚酸A治疗肾病综合症提供可靠依据，为研发新的治疗药物开辟新的途径，也 为同类中药的开发奠定一定的基础。

为实现上述目的，本发明公开了丹酚酸A或其可药用盐在制备抑制肾组织中 NF-κB激活、增加足细胞蛋白podocin、nephrin表达药物中的应用，进一步， 公开了丹酚酸A或其可药用盐在制备治疗肾病综合症药物中的应用。

作为本发明的另一种方案，本发明还公开了丹酚酸A或其可药用盐在多药 联合治疗肾病综合症的应用。

进一步，本发明还提供了丹酚酸A或其可药用盐与糖皮质激素协同作用在 治疗激素抵抗型肾病综合症的应用。

进一步，本发明还提供了丹酚酸A或其可药用盐与地塞米松等糖皮质激素联 合使用，对糖皮质激素治疗嘌呤霉素氨基核苷(PAN)诱导的肾病的应用。

进一步，本发明还提供了丹酚酸A或其可药用盐与糖皮质激素协同作用在 治疗激素抵抗型肾病综合症时，抑制足细胞瞬时受体电位阳离子通道6(TRPC6) 的信号通路，降低足细胞血管生成素样蛋白4(Angptl4)的表达水平，减少蛋 白尿的应用。

进一步，本发明还限定了在治疗激素抵抗型肾病综合症时采用丹酚酸A或 其可药用盐与糖皮质激素的用(重)量范围比为1：1—1：10。

进一步，本发明还限定了肾病综合症为微小病变肾病、局灶性节段肾小球硬 化症、膜性肾病、肾小球肾炎以及肾病综合症的高凝状态、血栓和高脂血症致命 性合并症。

本发明所述的丹酚酸A通过以下制备方法得到：以浓度为1.0％的丹参多酚 酸盐溶液为原料，添加柠檬酸三钠调pH至6.0，于125℃、0.15MPa条件下转化 4小时，冷却至室温后盐酸调pH至2.0-3.0，得到丹酚酸A溶液；将丹酚酸A 溶液依次过HPD100树脂富集与纯化、CG161树脂分离与纯化、硅胶柱色谱精细 纯化得到所需的丹酚酸A。

本发明的有益效果：

1、本发明的目的在于将丹酚酸A引入到肾病综合症的治疗中，公开了丹酚 酸A或其可药用盐在制备治疗肾病综合症药物中的新用途，公开了丹酚酸A对阿 霉素诱导的大鼠肾病综合症的作用，包括对大鼠生化指标及血液流变性的影响， 对大鼠尿蛋白、肾组织中SOD活性、MDA含量的影响，以及对肾组织中NF-κB 信号通路、足细胞蛋白podocin、nephrin表达的影响。

2、本发明公开了丹酚酸A或其可药用盐在多药联合治疗肾病综合症的应用， 采用多药联合方式对激素抵抗型肾病综合症进行治疗，引入的丹酚酸A对糖皮质 激素具有协调增效的作用，有效抑制足细胞上的TRPC6和Angptl4表达。另外， 由于糖皮质激素能够增加血液中Angptl4水平，在降蛋白尿的同时也会有加重高 甘油三酯血症的风险，而丹酚酸A具有良好的降甘油三酯作用。因此，丹酚酸A 与激素联合应用时，在起到增效作用的同时，还能够克服激素降蛋白尿带来的副 作用，有助于提高激素临床治疗的有效性，以及减少激素毒性和激素抵抗。

3、本发明还明确了丹酚酸A的作用特点及其分子机制，明确丹酚酸A可有 效减轻肾病模型大鼠肾脏损伤严重程度，减少足细胞足突融合，并且能够稳定足 细胞结构蛋白podocin、nephrin的表达，抑制致病关键分子TRPC6和Angptl4 的表达，这些研究成果为丹酚酸A治疗肾病综合症提供可靠依据，为研发新的治 疗药物开辟新的途径，也为同类中药的开发奠定一定的基础。

附图说明

图1丹酚酸A对阿霉素肾病大鼠24h尿蛋白的影响.与正常组比较，#P<0.05， ##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；

图2丹酚酸A对大鼠肾组织中SOD活性的影响.与正常对照组比较，##P<0.01； 与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01；

图3丹酚酸A对大鼠肾组织中MDA含量的影响.与正常对照组比较，##P<0.01； 与模型对照组比较，**P<0.01；

图4丹酚酸A对大鼠肾脏病变的影响；

图5丹酚酸A对大鼠病理损伤评分的影响.与正常对照组比较，##P<0.01；与模 型对照组比较，**P<0.01；

图6丹酚酸A对大鼠肾脏足细胞病变的影响；

图7丹酚酸A对大鼠肾小球足细胞足突宽度的影响.与正常对照组比较， ##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01；

图8丹酚酸A对大鼠肾组织p-IκBα,IκBα蛋白表达的影响；

图9丹酚酸A对大鼠肾组织NF-κBp65蛋白表达的影响；

图10丹酚酸A对大鼠足细胞蛋白podocin和nephrin表达的影响；

图11为正常对照组光镜下肾组织病理改变；

图12为模型对照组光镜下肾组织病理改变；

图13为泼尼松组光镜下肾组织病理改变；

图14为丹酚酸A5mg/kg组光镜下肾组织病理改变；

图15为丹酚酸A10mg/kg组光镜下肾组织病理改变；

图16为丹酚酸A+泼尼松组光镜下肾组织病理改变；

图17为正常对照组肾组织超微结构变化；

图18为模型对照组肾组织超微结构变化；

图19为泼尼松组肾组织超微结构变化；

图20为丹酚酸A5mg/kg组肾组织超微结构变化；

图21为丹酚酸A10mg/kg组肾组织超微结构变化；

图22为丹酚酸A+泼尼松组肾组织超微结构变化；

图23为肾组织nephrin、desmin、Angptl4和TRPC6蛋白表达；

图24为足细胞TRPC6、nephrin和desmin表达情况；

图25为足细胞内钙离子浓度变化情况.*P<0.05，**P<0.01，与PAN处理组比较。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的 实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前 提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1丹酚酸A的制备

丹参多酚酸盐300克加水稀释至浓度为1.0％(以丹参乙酸镁计)，用柠檬 酸三钠调pH至6.0，于125℃、0.15MPa条件下转化4小时，冷却至室温后盐酸 调pH至2.0～3.0，依法测定丹酚酸A含量；样液过HPD100树脂柱，依次用水、 25％乙醇溶液洗脱(弃去)，再用40％乙醇溶液洗脱收集丹酚酸A，依法测定丹酚 酸A含量，减压浓缩至丹酚酸A浓度约15.0～30.0mg/ml；浓缩液过CG161树脂 柱，依次用20％乙醇溶液洗脱(弃去)，再用35％乙醇溶液洗脱收集丹酚酸A，减 压浓缩至丹酚酸A浓度约50.0mg/ml；盐酸调pH至2～3，以等体积乙酸乙酯萃取 三次，合并萃取液，减压浓缩，加2.5倍量硅胶(80～120目)拌匀，干燥，湿 法上硅胶柱(200～300目，2.5倍量)，以正己烷-乙酸乙酯(6:4和5:5)洗脱， 收集正己烷-乙酸乙酯(5:5)洗脱液，减压浓缩至干，加水适量分散，再减压浓 缩，干燥，即得丹酚酸A180.2克，含量96.6％(外标法)。

实施例2丹酚酸A对阿霉素诱导的大鼠肾病综合症的保护作用

(一)方法

1.样品批号及来源

丹酚酸A，批号20130618山东靶点药物研究有限公司提供，制法如实施 1。

醋酸泼尼松片，批号130506，浙江仙琚制药股份有限公司。

氯化钠注射液(0.9％)，批号A130529E1，辽宁民康制药有限公司。

5％葡萄糖，批号B14012305，山东华鲁制药有限公司。

2.建立模型及给药

取30只大鼠，随机分为6个组，分别为：正常对照组，模型对照组，阳性 药组(醋酸泼尼松10mg/kg，0.5％CMC-Na混悬)、丹酚酸A(2.5、5、10mg/kg， iv.，溶于5％的葡萄糖)。除正常对照组外，其余各组大鼠一次性尾静脉注入阿 霉素7.5mg/kg，正常对照组大鼠给予相同体积的生理盐水，造模当天记为第1 天。注射阿霉素7天后，即第8天，各组动物开始给药，每天一次，连续给药 21天，正常对照组和模型对照组给予等体积的5％葡萄糖。

3.标本收集

分别于注射阿霉素后第3、7、14、21、28天收集24小时尿液，3000rpm离 心15min，去除沉渣，收集上清液，-20度冰箱保存。第29天后，将动物麻醉， 解剖，取大鼠双侧肾脏，将左侧肾脏分为两部分，一半用10％中性甲醛固定制作 石蜡切片，切取另一半肾脏皮质区数块(大小为1×1×2mm)，采用3％戊二醛固 定，然后放入冰箱4度保存，用作电镜观察；切取剩余的肾组织皮质区数块，存 储于-80度冰箱，用于Westernblot及组织匀浆检测。随后腹主动脉取血， 3000rpm，离心15min，取上清液，测定生化指标。

4.观察指标及测定方法

1)一般情况观察：观察各组大鼠精神状态、食量、活动情况，试验期间每 日称大鼠体重。

2)24小时尿蛋白定量测定：于阿霉素注射后第3、7、14、21、28天收集 24小时尿液，测量尿液体积并做记录，离心去除残渣，取上清液，-20℃冰箱保 存，BCA蛋白定量试剂盒检测尿蛋白含量。

3)血生化指标检测：大鼠经腹主动脉取血后，部分血液以3000rmp离心15min 制备上清液。取上清液，采用全自动血生化仪和BCA蛋白测定试剂盒检测血清白 蛋白(albumin,ALB)、总蛋白(Totalprotein,TP)、总胆固醇(totalcholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、血肌酐(serumcreatinine,SCr)，血清尿 素氮(bloodureanitrogen,BUN)含量。

4)血液流变学检查：大鼠经腹主动脉取血后，部分血液分别用肝素锂和 EDTA-K2抗凝，轻轻混匀后，送烟台毓璜顶医院检验科检验，采用MVIS-2035全 自动血液流变分析仪测血液流变学各项指标，包括：低切变率(lowshearrate， 1s^-1)、中切变率(mediumshearrate，30s-1)和高切变率(highshearrate，200s^-1) 条件下的全血粘度(wholebloodviscosity,WBV)值，血浆粘度(plasma viscosity,PV)值；EDTA-K2抗凝血采用XT-1800i全自动血细胞分析仪测红细 胞压积(hematocritvalues,Hct)。

5)肾脏组织石蜡切片：肾脏切片，HE染色，于光镜下观察肾小球上皮细胞、 小管间质和基底膜变化情况。最后，根据肾小球上皮细胞增殖、肾小管细胞肿胀、 蛋白管型和肾间质炎性细胞浸润情况进行分级评分：0分为正常；1分为轻微病 变；2分为中度病变；3分严重病变。所有项评分的总和为每个组织样本总的得 分。

6)肾脏电镜观察：取3％戊二醛固定的肾脏组织，在PBS等渗缓冲液中进行 漂洗，使样品彻底漂洗干净，并浸泡过夜。漂洗后的样品用1％锇酸(0.24MPBS pH7.4)在4度下固定2小时，PBS等渗缓冲液中漂洗15min。随后采用乙醇和丙 酮梯度脱水，Epon812包埋聚合，先进行1um半薄切片，甲苯胺兰染色后，于光 镜下定位，再进行超薄切片，用双氧铀和柠檬酸铅双重电染，透射电镜(JEM1400, JAPAN)下观察肾脏超微结构变化并测量足突宽度。

7)氧化指标：肾皮质组织匀浆，用试剂盒测组织中MDA含量和SOD活性， 根据试剂盒说明书进行操作，MDA结果表示为μmol/mg蛋白，SOD计算公式：

SOD活力(U/mg蛋白)＝SOD抑制率÷50％×反应体系稀释倍数(0.24/0.02) ÷待测样品蛋白浓度。

8)Westernblot试验：提取肾组织总蛋白和核蛋白，检测组织中NF-κBp65、 IκBα、p-IκBα、裂孔膜蛋白podocin和nephrin表达情况。

(二)结果

1丹酚酸A对阿霉素肾病大鼠24h尿蛋白的影响

结果如附图1所示，静脉注射阿霉素后，大鼠尿蛋白排泄量逐渐增加。第7 天时，模型对照组大鼠尿蛋白含量显著高于正常对照组；第14天开始，模型对 照组大鼠尿蛋白含量快速升高。醋酸泼尼松治疗显著降低大鼠第2、3和4周尿 蛋白含量；丹酚酸A也能够降低大鼠尿蛋白含量。丹酚酸A5mg/kg和10mg/kg 给药剂量组大鼠于第3周和第4周时尿蛋白含量显著低于模型对照组。丹酚酸A 2.5mg/kg组仅于第三周时显著降低尿蛋白排泄量，其它时间段无明显作用。

2丹酚酸A对大鼠生化指标的影响

结果如表1和表2所示，静脉注射阿霉素降低大鼠血清白蛋白和总蛋白含量， 同时升高胆固醇、甘油三酯、尿素氮和血肌酐水平。丹酚酸A治疗后减轻白蛋白 和总蛋白含量降低程度，降低胆固醇，甘油三酯，尿素氮和血肌酐水平，其中 10mg/kg给药剂量效果相对较好。泼尼松也显示较好的作用，但是它对脂质代谢 的影响没有丹酚酸A好。

表1丹酚酸A对大鼠血生化指标的影响

与正常对照组比较，^#P<0.05,^##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01

表2丹酚酸A对大鼠BUN和SCr含量的影响

与正常对照组比较，#P<0.05,##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01

3丹酚酸A对大鼠肾组织中SOD活性和MDA含量的影响

结果如附图2和3所示，与正常对照组比较，模型对照组肾组织SOD活性显 著降低，MDA含量明显升高。与模型对照组比较，丹酚酸A10mg/kg显著升高SOD 活性，降低MDA含量；丹酚酸A5mg/kg也能显著升高SOD活性，但是对MDA含 量没有显著影响。丹酚酸A2.5mg/kg也有一定作用，但是没有统计学差异。

4丹酚酸A对大鼠血液流变性的影响

结果如表3所示，与正常对照组比较，模型组大鼠全血粘度、血浆粘度和红 细胞压积显著升高。丹酚酸A不同剂量显著降低大鼠全血粘度、血浆粘度和红细 胞压积。

表3丹酚酸A对大鼠血液流变性的影响

与正常对照组比较，^#P<0.05,^##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01

5丹酚酸A对大鼠肾脏病变的影响

正常对照组大鼠肾脏没有明显的组织病理学变化。模型组大鼠肾组织病变明 显，可见肾小球上皮细胞增殖、肾小管细胞肿胀、肾小管管腔大量蛋白渗出、肾 间质灶性炎性细胞浸润。组织病理损伤评分相应升高。经泼尼松和不同剂量的丹 酚酸A治疗后，大鼠肾脏病变有所减轻，但程度不一，其中以泼尼松和丹酚酸A 高剂量组(10mg/kg)效果最为明显，炎性细胞浸润和蛋白管型减少，少见或几乎 没有上皮增殖或肾小管细胞肿胀的情况。丹酚酸A5mg/kg组大鼠肾组织炎性细 胞浸润和蛋白渗出较模型组减少，可见肾小球上皮细胞增殖、肾小管细胞轻微肿 胀。丹酚酸A2.5mg/kg组可见肾间质炎性细胞浸润减少，但肾小管管腔蛋白渗 出较多，肾小球上皮细胞增殖、肾小管细胞轻微肿胀，但与模型组比较病变仍有 所减轻。各药物治疗组大鼠肾组织病理损伤评分相应降低，与模型组比较，丹酚 酸A(5、10mg/kg)和泼尼松治疗组有统计学显著性差异(附图4和5)。

6丹酚酸A对大鼠足细胞病变的影响

采用透射电子显微镜分析肾脏超微结构的变化，并采用随机垂直截距长度法 测算足突宽度。如附图6和7所示，正常组大鼠的肾小球和肾小管结构完整，未 见明显损伤。足突清晰可见，无肿胀和萎缩。模型组大鼠的肾小球严重损伤，可 见肾小球基础结构被破坏，足细胞足突大面积融合成板片状、裂孔间隙消失，足 突宽度明显增加，肾小球基底膜轻微增厚。药物治疗后足突融合范围减小，仅局 部融合，足突宽度明显减小，其中以泼尼松和丹酚酸A10mg/kg的作用较为明显， 各治疗组未见肾小球基底膜增厚的情况。表明丹酚酸A能够阻止阿霉素诱导的足 细胞损伤。

7丹酚酸A对肾组织p-IκBα,IκBαandNF-κBp65蛋白表达的影响

结果如附图8和9所示，与正常对照组比较，模型组大鼠肾组织p-IκBα和 NF-κBp65蛋白表达水平升高，IκBα蛋白表达降低，提示大鼠肾组织中NF-κB 信号通路激活。丹酚酸A治疗后下调p-IκBα和NF-κBp65蛋白表达，上调IκBα 蛋白表达。

8丹酚酸A对足细胞蛋白podocin,nephrin表达的影响

如附图10所示，模型组大鼠肾组织podocin、nephrin蛋白表达明显降低。 Podocin和nephrin是足细胞重要的分子蛋白，它们的表达水平降低与肾脏病变 有关。而丹酚酸A治疗后显著增加podocin和nephrin的表达水平。

实施例3丹酚酸A对嘌呤霉素氨基核苷(PAN)诱导的肾病的影响

(一)方法

取SD大鼠，单次尾静脉注射嘌呤霉素氨基核苷(PAN)15mg/100g诱导大鼠 肾病模型。注射PAN7天后，动物分组给药，分别为：正常对照组、模型对照组、 泼尼松10mg/kg(用0.5％CMC-Na混悬，ig.)、丹酚酸A(5、10mg/kg，溶于5％ 葡萄糖注射液，iv.)、丹酚酸A5mg/kg+泼尼松10mg/kg，每天给药1次，连续 7天，正常对照组和模型对照组给予等体积的葡萄糖溶液。试验期间，观察动物 一般临床体征、称体重，收集大鼠第3、7、14天24h尿液，3000rpm离心15min， 去除沉渣，收集上清液，-20度冰箱保存。试验结束，收集样本，测定如下指标：

(1)测定尿蛋白含量：采用BCA蛋白定量试剂盒检测尿蛋白含量。

(2)采用全自动生化仪和BCA蛋白定量试剂盒测定动物血生化指标：血肌酐 (SCr)、尿素氮(BUN)、血清白蛋白(ABL)、总蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、胆 固醇(TC)含量。

(3)部分血液分别用肝素锂和EDTA-K2抗凝，轻轻混匀后，采用MVIS-2035全 自动血液流变分析仪测全血粘度(WBV)和血浆粘度(PV)值；EDTA-K2抗凝血 采用XT-1800i全自动血细胞分析仪测红细胞压积(Hct)。

(4)取肾脏，分别用10％中性甲醛和戊二醛固定，10％中性甲醛固定的组织做常 规石蜡切片，HE染色，光镜下观察肾脏病理变化；戊二醛固定组织用于电镜检 查，观察肾小球超微结构变化。

(5)westernblot法测定肾组织desmin、nephrin、Angptl4和TRPC6表达情 况。

(二)结果

124h尿蛋白排泄量

静脉注射PAN7天后，模型对照组大鼠尿蛋白含量显著升高，第14天时急 剧升高。醋酸泼尼松显著降低大鼠尿蛋白含量，丹酚酸A(5、10mg/kg)也能够 降低大鼠尿蛋白含量，其中10mg/kg与模型组比较有显著性区别；丹酚酸A联合 泼尼松进一步降低大鼠尿蛋白含量，并且与泼尼松单独用药组比较，有统计学差 异(表4)。

表4大鼠24h尿蛋白含量

与正常组比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与泼尼松组比较，^&P<0.05

2血生化指标

静脉注射PAN后大鼠血清白蛋白和总蛋白含量显著降低，胆固醇、甘油三酯 水平明显升高。丹酚酸A各剂量不同程度减轻白蛋白和总蛋白含量降低程度，降 低胆固醇、甘油三酯水平，其中10mg/kg给药剂量效果相对较好。泼尼松也能够 减轻血清蛋白降低程度，降低胆固醇水平，但是不能降低甘油三酯含量。丹酚酸 A联合泼尼松进一步减轻血清蛋白降低程度，甘油三酯和胆固醇含量也明显降低， 从整体上来看，联合用药作用比二者单独用药稍好(表5)。

表5血生化指标

与正常组比较，^##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

3肾脏功能

结果如表6所示，模型组大鼠血中尿素氮和肌酐含量显著升高，提示肾脏功 能损伤。给药后，各组动物尿素氮和血肌酐不同程度降低，表明药物有一定程度 的改善肾功能的作用。丹酚酸A联合泼尼松显著降低尿素氮和血肌酐水平，对尿 素氮的影响比二者单独用药时明显。

表6尿素氮和血肌酐含量

与正常组比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05

4血液流变学指标

与正常对照组比较，模型组大鼠全血粘度、血浆粘度和红细胞压积显著升高。 不同剂量的丹酚酸A有效改善大鼠血液流变学参数，表现为显著降低大鼠全血粘 度、血浆粘度，高剂量还能降低红细胞压积。泼尼松能明显降低大鼠低切变率全 血粘度和血浆粘度，对其它参数没有明显影响，整体上来说，泼尼松对血液流变 性的改善作用不如丹酚酸A，这可能与泼尼松本身对血液流变性没有直接作用有 关，而是通过减轻肾损伤而减少血液中蛋白流失、改善脂质代谢，从而对血液粘 度产生了一定的影响。丹酚酸A联合泼尼松也能显著降低大鼠全血粘度和血浆粘 度(表7)。

表7血液流变学指标

与正常组比较，^##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

5光镜下肾组织病理变化

正常对照组大鼠肾脏没有明显的组织病理学变化。模型组大鼠肾组织病变明 显，可见肾小管细胞肿胀、肾小管管腔大量蛋白渗出、肾间质灶性炎性细胞浸润， 光镜下肾小球未见明显改变。经泼尼松和不同剂量的丹酚酸A治疗后，大鼠肾脏 病变有所减轻，炎性细胞浸润和蛋白管型减少，少见或几乎没有肾小管细胞肿胀 的情况，其中以泼尼松联合丹酚酸A效果最为明显(图11-16)。

6肾组织超微结构变化

采用透射电子显微镜观察肾脏超微结构的变化。如图17-22所示，正常组大 鼠的肾小球和肾小管结构完整，未见明显损伤，足突清晰可见，无肿胀和萎缩。 模型组大鼠的肾小球严重损伤，可见肾小球基础结构被破坏，足突大面积融合、 裂孔间隙消失，肾小球基底膜轻微增厚。药物治疗后足突融合范围减小，仅局部 融合，未见肾小球基底膜增厚的情况，丹酚酸A联合泼尼松进一步减轻足突融合 程度。

7肾组织nephrin、desmin、Angptl4和TRPC6蛋白表达情况

Nephrin为裂孔膜的组成蛋白，在维持肾小球滤过功能中具有重要作用，足 细胞损伤后，nephrin的表达和分布会发生变化。Desmin为足细胞损伤的标志性 蛋白。如前文所述，TRPC6蛋白表达量升高可引起足细胞结构蛋白降解或重排， 导致足细胞的损伤进而产生蛋白尿。足细胞Angptl4表达升高是微小病变肾病 (MCD)的致病原因。结果如图23所示，与正常对照组比较，模型对照组大鼠肾 组织nephrin表达水平下降，desmin、Angptl4和TRPC6表达升高，丹酚酸A和 泼尼松能够上调nephrin蛋白表达，抑制desmin、Angptl4和TRPC6蛋白表达， 丹酚酸A联合泼尼松进一步加强这种作用。提示丹酚酸A的肾脏保护作用机制可 能与抑制Angptl4和TRPC6蛋白表达有关。

(三)结论

丹酚酸A能够减轻肾足细胞损伤，改善脂质代谢和血液流变性，表明丹酚酸 A能够抑制嘌呤霉素氨基核苷诱导的肾病，其作用机制可能与维持nephrin的表 达量，抑制Angptl4和TRPC6表达有关。同时，丹酚酸A联合泼尼松对肾脏的保 护作用进一步加强，表明丹酚酸A对泼尼松的肾脏保护具有增效作用。

实施例4丹酚酸A对嘌呤霉素氨基核苷(PAN)损伤足细胞TRPC6表达的影响

细胞培养：未分化足细胞用含10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素 的RPMI1640培养液，在33℃，5％CO₂孵育箱内培养。自液氨罐取出足细胞后， 立即投入37℃温水中摇动1～2min，使其融化，用吸管吸出细胞悬液，注入已加 入新鲜培养液5m1的离心管，转速为1000r/min，离心4min，弃上清液，加入新 鲜培养液吹散细胞，继而接种至涂有I型胶原的75cm²培养瓶，于33℃、含 10-100U/ml重组小鼠γ-IFN许可条件下诱导增殖。增殖期间，每2天更换一次培 养液，待其长至约85％，进行传代或分化培养。将传代细胞按1：10稀释接种到 涂布I型胶原的培养瓶中，置于37℃无γ-IFN的非许可条件下培养10-14d诱导分 化，细胞密度约5000-10000个/cm²，每2-4d更换一次培养液。通过间接免疫荧光 确定细胞表达足细胞分化成熟特异性分子nephrin、podocin、Synatopodin。细 胞分化10-14d成熟后使用。

足细胞存活率：实验前1天采用无血清RPMI-1640培养基使细胞同步，将细胞 分为5组：对照组、PAN处理组、地塞米松干预组(1μM)、丹酚酸A干预组(16nM)、 地塞米松+丹酚酸A干预组，同时加入PAN(50μg/ml)和干预药物。于37℃培养 24h后每孔添加5mg/ml的MTT溶液(终浓度0.5mg/ml)，置于5％二氧化碳培养 箱中继续培养4h后，弃去上清，甩干残留液体，加入DMSO100μl，振荡器上 震荡，使充分溶解后立即在570nm和630nm下测定吸光值。最后计算细胞存活率。

PAN损伤足细胞TRPC6、desmin和nephrin蛋白表达情况：实验前1天采用 无血清RPMI-1640培养基使细胞同步，将细胞分为5组：对照组、PAN处理组、 地塞米松干预组(1μM)、丹酚酸A干预组(16nM)、地塞米松+丹酚酸A干预组， 同时加入PAN(50μg/ml)和干预药物，处理24h后收集细胞，提取各组细胞总 蛋白后采用westernblot法测细胞中TRPC6、nephrin和desmin表达。

(二)结果

1足细胞存活率

采用MTT法对细胞活力进行检测。PAN处理足细胞后，足细胞存活率下降为 41％，丹酚酸A和地塞米松处理组细胞存活率分别为60％和68％，丹酚酸A联合地 塞米松处理组为80％。可见丹酚酸A能够抑制PAN诱导的足细胞损伤，同时丹酚 酸A能够增强地塞米松的保护作用。

2足细胞TRPC6、nephrin和desmin表达情况

结果如图24所示，在PAN作用于足细胞致其损伤后，足细胞损伤标志性蛋 白desmin、TRPC6表达明显升高，nephrin表达降低，加入丹酚酸A和地塞米松 干预后，能够抑制desmin和TRPC6表达，上调nephrin表达，地塞米松联合丹 酚酸A进一步加强这种作用。

(三)结论

丹酚酸A能够抑制PAN诱导的小鼠足细胞损伤，并能够增强地塞米松的作用， 其作用机制可能与抑制TRPC6表达，稳定nephrin表达有关。

实施例5丹酚酸A对TRPC6高表达的足细胞钙离子内流的影响

(一)方法

细胞培养：未分化足细胞用含10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素 的RPMI1640培养液，在33℃，5％CO₂孵育箱内培养。自液氨罐取出足细胞后， 立即投入37℃温水中摇动1～2min，使其融化，用吸管吸出细胞悬液，注入已加 入新鲜培养液5m1的离心管，转速为1000r/min，离心4min，弃上清液，加入新 鲜培养液吹散细胞，继而接种至涂有I型胶原的75cm²培养瓶，于33℃、含 10-100U/ml重组小鼠γ-IFN许可条件下诱导增殖。增殖期间，每2天更换一次培养 液，待其长至约85％，进行传代或分化培养。将传代细胞按1：10稀释接种到涂 布I型胶原的培养瓶中，置于37℃无γ-IFN的非许可条件下培养10-14d诱导分化， 细胞密度约5000-10000个/cm²，每2-4d更换一次培养液。通过间接免疫荧光确定 细胞表达足细胞分化成熟特异性分子nephrin、podocin、synatopodin。细胞分化 10-14d成熟后使用。

细胞转染：实验前一天将细胞接种于6孔板，接种浓度5×10⁵个细胞，添加 2mlRPMI-1640培养基，培养细胞至70％融合。按照说明书分别将 pEGFP-N1-mTRPC质粒、pEGFP-N1空载体与脂质体Lipofectamine2000混合，静 止20分钟后加入6孔板，以无血清的Opti-MEM培养液孵育6小时后改用含 10％FBS的RPMI-1640培养基继续培养。48小时后通过荧光倒置显微镜观察足细 胞中增强荧光蛋白的表达，随机取5个高倍视野，计算每个视野下GFP阳性细胞 数占总细胞数的百分比，取其平均值作为转染效率，用Westernblot法检测TRPC6 蛋白的表达，以验证转染效果。结果证明转染细胞TRPC6蛋白表达升高。

TRPC6高表达足细胞内钙离子浓度：分组：空白对照组、PAN处理组、地 塞米松1μM、丹酚酸A16nM、地塞米松+丹酚酸A。按上述方法转染细胞48小 时后，用D-Hanks溶液冲洗细胞3次，加入含Fluo3-AM(3μM)Hanks溶液1ml， 37℃避光孵育25min。D-Hanks溶液冲洗3次后，按分组加入含药的培养液孵育 10min后开始检测。以488nm为激发波长，于共聚焦显微镜下观察胞内Ca²⁺荧 光强度变化10min，第3min末加入AngⅡ刺激，采集图像，间隔时间1.2s，胞 内钙离子浓度以相对荧光强度(实际荧光强度/基础荧光强度)表示。

(二)结果

足细胞内钙离子浓度变化情况

结果如图25所示，PAN刺激足细胞后，可引起足细胞内Ca²⁺浓度短时间内 一过性升高，与空白对照组比较，有显著性差异(P<0.01)。加入丹酚酸A和地 塞米松处理后Ca²⁺上升幅度降低，有显著性差异(P<0.05)，丹酚酸A联合地塞 米松组Ca²⁺上升幅度降低更为明显(P<0.01或P<0.05)。提示丹酚酸A可能通 过抑制TRPC6功能从而抑制PAN刺激诱发的Ca²⁺内流。

(三)结论

丹酚酸A能够抑制PAN刺激诱发的TRPC6高表达足细胞内钙离子内流， 与地塞米松联合使用作用进一步增强。

本发明的目的在于将丹酚酸A引入到肾病综合症的治疗中，公开了丹酚酸 A或其可药用盐在多药联合治疗肾病综合症的应用，采用多药联合方式对激素 抵抗型肾病综合症进行治疗，通过引入丹酚酸A，增强糖皮质激素协疗效，减少 不良反应和药物抵抗的发生，有助于糖皮质激素在临床的合理应用，提高其治疗 的有效性，减少激素毒性和激素抵抗；同时，本发明还明确了丹酚酸A的作用 特点及其分子机制，为丹酚酸A治疗肾病综合症提供可靠依据，为研发新的治 疗药物开辟新的途径，也为同类中药的开发奠定一定的基础。

最终，以上实施例和附图仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述 实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形 式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范 围。