中药在制备用于消除抗肿瘤药的心脏毒性副作用药物或与阿霉素协同抗肿瘤作用药物中应用

摘要

本发明公开了一种中药组合物在制备具有消除抗肿瘤药阿霉素的心脏毒性副作用药物中的用途，本发明也公开了该中药组合物在制备具有与阿霉素协同抗肿瘤作用药物中的应用，其中所述的中药组合物是由下列用量的中药原料组成：黄芪36重量份、麦冬18重量份、人参9重量份、茯苓18重量份、地黄13重量份、龟板9重量份、紫石英26重量份、桂枝13重量份、淫羊藿18重量份、金银花18重量份、丹参13重量份、郁金9重量份和枳壳9重量份。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，更具体地，本发明涉及一种中药组合物提取液在制备用于消除抗肿瘤药的心脏毒性副作用药物或具有与阿霉素协同抗肿瘤作用的药物中的应用。

背景技术

阿霉素是蒽环类抗生素，自20世纪60年代发现并应用于多种癌症的治疗，现在仍然是最有效的抗癌药物之一，适用于恶性淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、骨及软组织肉瘤等多种肿瘤。但由于严重的心脏毒性，其临床应用受到一定影响。近年来，对阿霉素心脏毒性的研究较多，阿霉素中毒分为急性毒性、亚急性毒性和慢性毒性。急性中毒发生于单次使用或一个疗程后，常见症状有低血压、心律失常、心脏功能不全等，偶尔可发生心肌梗死，常伴有肝、肾功能损伤。因此评估阿霉素心脏毒性程度及寻找可以有效解除其心脏毒性的物质就成为目前亟待解决的问题，但目前尚缺乏有效预防和治疗方法。

有文献报道几种中药单体成分如丹参（丹参酮IIA）、人参（人参皂苷Rb1，Rg1，Rg3）、麦冬（麦冬皂苷D）、黄芪（黄芪甲苷）等均在一定程度上减轻阿霉素诱导的心肌损伤，但疗效不佳。目前临床上主要使用国家级新药芪冬颐心口服液用于治疗病毒性心肌炎（国家级新药，2015版药典一部920页记载，商品名称：芪冬颐心口服液。），它的活性成分是由黄芪36重量份、麦冬18重量份、人参9重量份、茯苓18重量份、地黄13重量份、龟板9重量份、紫石英26重量份、桂枝13重量份、淫羊藿18重量份、金银花18重量份、丹参13重量份、郁金9重量份和枳壳9重量份制成的，它具有明显改善心悸、胸闷、胸痛及气短乏力的作用，临床具有补中益气，增强患儿免疫力，降低心肌耗氧量，改善心肌缺血缺氧，具有较强的心肌保护作用，特别对病毒性心肌炎效果显著。但是从未报道过该药物具有治疗抗肿瘤药的心脏毒性副作用的功效，为此，本发明人经过大量系统研究发现本发明中药组合物制成提取液对阿霉素诱导的正常BALB/c小鼠心肌毒性的保护作用，该中药组合物提取液与阿霉素联合用药能够显著减轻阿霉素诱导的心脏毒性，提高小鼠心肌收缩功能，从而发现本发明中药组合物对抗肿瘤药阿霉素诱导的心脏毒性副作用具有显著治疗作用完成本发明。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种中药组合物在制备用于消除抗肿瘤药心脏毒性副作用药物中的应用。

本发明的另外一个目的是提供一种中药组合物在制备具有与阿霉素协同抗肿瘤药物中的应用。降低了阿霉素心脏毒性副作用，同时协同增效。

技术方案：中药组合物在制备具有消除抗肿瘤药心脏毒性副作用药物中的应用，其中所述的中药组合物是由下列用量的中药原料组成：黄芪35-40重量份、麦冬15-20重量份、人参5-10重量份、茯苓15-20重量份、地黄10-15重量份、龟板5-10重量份、紫石英25-30重量份、桂枝10-15重量份、淫羊藿15-20重量份、金银花15-20重量份、丹参10-15重量份、郁金5-10重量份和枳壳5-10重量份。

为了获得更好的疗效，其中所述的中药组合物优选是由下列用量的中药原料组成：黄芪36重量份、麦冬18重量份、人参9重量份、茯苓18重量份、地黄13重量份、龟板9重量份、紫石英26重量份、桂枝13重量份、淫羊藿18重量份、金银花18重量份、丹参13重量份、郁金9重量份和枳壳9重量份。

本发明所述的中药组合物可以采用常规的中成药水提醇沉或醇提水沉法制备成提取液直接用作药物；也可以将提取液与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂制成药物剂型优选口服剂型。本发明剂型可使用药物制剂工艺学本领域熟练技术人员所公知的惯常使用的任何方法产生并且对此没有特别限制。所述的药学上可接受的载体或赋形剂可选自适用于口服制剂的药用赋形剂，包括填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、表面活性剂、吸附载体等。所述的口服剂型为片剂、胶囊、软胶囊、口服液、糖浆、颗粒、滴丸、口崩片、缓释片、缓释胶囊、控释片或控释胶囊等常规剂型。

本发明优点是：实验表明，采用本中药组合物提取液与阿霉素结合使用，降低阿霉素毒性，提高阿霉素抗肿瘤疗效。

附图说明

图1中药组合物提取液与阿霉素联合用药对荷瘤小鼠心脏功能的影响；肿瘤对照组、模型组、中药组合物提取液10ml/kg、25ml/kg、50ml/kg剂量组、右丙亚胺阳性药组小鼠给药结束后分别进行小动物心动超声。

图2中药组合物提取液和阿霉素联合用药对荷瘤小鼠心电图变化的影响；肿瘤对照组、模型组、中药组合物提取液10ml/kg、25ml/kg、50ml/kg剂量组、右丙亚胺阳性药组小鼠给药结束后分别进行II导联电图检测。比较小鼠的心率和ST段。

图3中药组合物提取液和阿霉素联合用药对荷瘤小鼠心肌三酶的影响；肿瘤对照组、模型组、中药组合物提取液10ml/kg、25ml/kg、50ml/kg剂量组、右丙亚胺阳性药组小鼠给药结束后分别取血，采用分光光度计法比较血清中LDH、CK、AST的活力。

图4:中药组合物提取液和阿霉素联合用药对荷瘤小鼠心肌病理损伤的影响；肿瘤对照组、模型组、中药组合物提取液10ml/kg、25ml/kg、50ml/kg剂量组、右丙亚胺阳性药组小鼠给药结束后取心脏，多聚甲醛固定，进行组织切片及HE染色，显微镜下观察心肌病理变化。

图5中药组合物提取液和阿霉素联合用药对荷瘤小鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响；肿瘤对照组、模型组、中药组合物提取液10ml/kg、25ml/kg、50ml/kg剂量组、右丙亚胺阳性药组小鼠给药结束后取心脏，分别多聚甲醛固定和-80℃保存，进行TUNEL法检测心肌组织凋亡和Westernblot法检测caspase3/9，Bax及Bcl-2蛋白表达。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明，不构成对本发明的进一步限制。

表1：中药组合物提取液与阿霉素联合用药在第7、9、12天对荷瘤小鼠肿瘤长轴长度的影响；肿瘤对照组、模型组、中药组合物提取液10ml/kg、25ml/kg、50ml/kg剂量组、右丙亚胺阳性药组小鼠在第7、9、12天分别用游标卡尺测量肿瘤的长轴长度。

表2：中药组合物提取液与阿霉素联合用药在第7、9、12天对荷瘤小鼠肿瘤短轴长度的影响；肿瘤对照组、模型组、中药组合物提取液10ml/kg、25ml/kg、50ml/kg剂量组、右丙亚胺阳性药组小鼠在第7、9、12天分别用游标卡尺测量肿瘤的短轴长度。

表3：中药组合物提取液与阿霉素联合用药对荷瘤小鼠肿瘤重量的影响；肿瘤对照组、模型组、中药组合物提取液10ml/kg、25ml/kg、50ml/kg剂量组、右丙亚胺阳性药组小鼠在第12天处死，取肿瘤称重。

表4：中药组合物提取液与阿霉素联合用药对荷瘤小鼠体重的影响；肿瘤对照组、模型组、中药组合物提取液10ml/kg、25ml/kg、50ml/kg剂量组、右丙亚胺阳性药组小鼠在第12天称体重。

表5：中药组合物提取液与阿霉素联合用药对荷瘤小鼠心脏重量的影响；肿瘤对照组、模型组、中药组合物提取液10ml/kg、25ml/kg、50ml/kg剂量组、右丙亚胺阳性药组小鼠在第12天处死，取心脏称重。

表6：中药组合物提取液与阿霉素联合用药对荷瘤小鼠心脏功能的影响；肿瘤对照组、模型组、中药组合物提取液10ml/kg、25ml/kg、50ml/kg剂量组、右丙亚胺阳性药组小鼠给药结束后分别进行小动物心动超声。通过M-mode成像分别对各组小鼠左室短轴缩短率（FS%），心脏射血分数（EF%），舒张期左室容积（LVVd）及左室实际重量（LVMass），收缩末期左室容积（LVVs）进行比较。

实施例1中药组合物提取液的制备

称取黄芪36重量份、麦冬18重量份、人参9重量份、茯苓18重量份、地黄13重量份、龟板9重量份、紫石英26重量份、桂枝13重量份、淫羊藿18重量份、金银花18重量份、丹参13重量份、郁金9重量份和枳壳9重量份，粉碎，混合，采用常规的中成药水提醇沉制备成中药组合物提取液。

以下试验例中使用的中药组合物提取液都是实施例1所制备的。

试验例1荷瘤小鼠S180肉瘤接种、阿霉素心肌病模型的建立

将接种了S180肉瘤的小鼠随机分为肿瘤对照组(生理盐水组)、阿霉素治疗组（阿霉素1mg/kg）、中药组合物提取液（实施例1所制备）与阿霉素联用组(10、25、50ml/kg)、阳性对照组(右丙亚胺200mg/kg)。接种次日开始给药，中药组合物提取液组灌胃给予不同剂量的中药组合物提取液，阳性药组腹腔注射右丙亚胺（200mg/kg)，在给药1h后，模型组、中药组合物提取液组及阳性药组小鼠腹腔注射阿霉素（1mg/kg），对照组给予同体积的生理盐水，连续给药12d。在给药第7d、9d、12d分别用游标卡尺测量肿瘤的长轴、短轴长度及并称量体重。停药次日超声心动检测、心电监测；眼眶取血用于心肌三酶(LDH、CK、AST)检测；断椎处死，称体重，解剖剥离皮下瘤体，称瘤重。取心脏称重，左心室部分多聚甲醛固定，用于HE病理检测及TUNEL凋亡检测；另一部分保存于-80℃用于凋亡蛋白caspase3/9及Bcl-2家族蛋白Bcl-2、Bax的westernblot分析。

试验例2肿瘤大小的测量与称重

在给药第7d、9d、12d分别用游标卡尺测量肿瘤的长轴、短轴长度及在第12d取肿瘤称重。

如表1和表2，与肿瘤对照组相比，阿霉素治疗组在给药第7、9、12天能显著减少小鼠肿瘤的长轴和短轴长度，差异具有统计学意义；与阿霉素治疗组相比，中药组合物提取液与阿霉素联用可以剂量依赖性的减少肿瘤的长轴和短轴长度，其中在25和50ml/kg具有统计学意义；阳性药组与模型组相比肿瘤的大小没有显著变化。第12天，取肿瘤称重，如表3，阿霉素治疗组瘤重与肿瘤对照组相比显著降低，差异具有统计学意义；与阿霉素治疗组相比，中药组合物提取液与阿霉素联用则剂量依赖性的继续降低瘤重，其中在25和50ml/kg具有统计学意义。阳性药组与阿霉素组相比瘤重无显著差异。

试验例3荷瘤小鼠体重及心脏重量的测量

在给药第7d、9d、12d分别用称量体重。在第12d处死小鼠取心脏称重。

如表4和表5所示，与肿瘤对照组相比，在第7d、9d和12d，阿霉素显著降低小鼠的体重；与阿霉素组相比，在第7d，中药组合物提取液50ml/kg显著增加小鼠体重；在第9d和12d，中药组合物提取液25ml/kg和50ml/kg显著增加小鼠体重；在第12天，中药组合物提取液25ml/kg和50ml/kg显著增加小鼠心脏重量。与模型组相比，阳性药右雷佐生也显著增加小鼠体重与心脏重量，差异具有统计学意义。但在第12天，阳性药组小鼠体重与心脏重量低于中药组合物提取液50ml/kg剂量组。

试验例4荷瘤小鼠心肌收缩功能检测

小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉。然后用褪毛剂将小鼠的胸部毛剃光，卧位放置于操作台。用M型超声心动仪测量左心室（LV）收缩期内径（LVIDs）和舒张期内径（LVIDd），左心室后壁收缩期（LVPWs）和舒张期厚度（LVPWd）。计算机软件计算左心室舒张末期容积（lvvd），左心室收缩末期容积（lvvs），短轴缩短率（FS），射血分数（EF），和左心室质量（AW）。

结果如图1和表6：与对照组相比，阿霉素组小鼠的左室短轴缩短率（FS%），心脏射血分数（EF%），舒张期左室容积（LVVd）、左室实际重量（LVMass）及收缩末期左室容积（LVVs）显著降低。中药组合物提取液与阿霉素联用剂量依赖性的提高FS%，EF%，LVVd及LVMass（AW），其中50ml/kg作用显著，具有统计学意义，但对LVVs无影响。阳性药右丙亚胺和中药组合物提取液50ml/kg相比无显著差异。

试验例5小鼠心电图检测

小鼠1%戊巴比妥钠腹腔麻醉（75mg/kg）。先打开powerlab多导生理记录仪，然后打开配套的软件程序，设置好参数，准备记录心电图图形。待麻醉合适后将小鼠固定于动物台上，四肢接上针电极，电极连于多通道电生理记录仪上，显示肢体II导联心电图，开始记录。持续记录5分钟心电图。保存心电图图形，用于分析。

结果如图2：阿霉素组小鼠心电图S-T段显著升高。中药组合物提取液10ml/kg、25ml/kg、50ml/kg剂量依赖性的降低S-T段。阳性药右雷佐生也显著降低小鼠心电图S-T段。但本实验中小鼠心率没有显著变化。（1：对照组；2：阿霉素模型组；3：中药组合物提取液10ml/kg剂量组；4:中药组合物提取液25ml/kg剂量组；5:中药组合物提取液50ml/kg剂量组；6:右丙亚胺阳性药组）

试验例6血浆收集和心肌三酶活力检测

小鼠眼球取血，4000g离心10min，分离血清，用全自动生化仪检测血清中LDH、CK、AST活性。

结果如图3：与肿瘤对照组相比，阿霉素组小鼠血清中LDH、CK、AST活力显著升高，与阳性药右雷佐生一样，中药组合物提取液剂量依赖性的降低小鼠血清中LDH、CK、AST水平。中药组合物提取液50ml/kg组的LDH与CK活力低于阳性药组。（1：对照组；2：阿霉素模型组；3：中药组合物提取液10ml/kg剂量组；4:中药组合物提取液25ml/kg剂量组；5:中药组合物提取液50ml/kg剂量组；6:右丙亚胺阳性药组）

试验例7心肌组织病理观察

各处理组小鼠在取血后迅速处死取出心脏。小心切取左心室组织，用10%的福尔马林固定2～3天。经过脱水、透明、浸蜡、包埋后进行石蜡组织切片（4～5μm）。HE染色时，首先将带有组织的载玻片置于二甲苯中脱蜡，用苏木素染色6～10min；用流动的水冲洗几次，蒸馏水平衡后用含1%盐酸的乙醇进行分色，氨水反蓝10min后，用伊红染色10s。固定封片。用光学显微镜观察。

结果如图4：显微镜下观察，肿瘤对照组:心肌组织结构基本无异常，心肌细胞排列比较整齐。阿霉素治疗组:可见心肌纤维溶解、核溶解或固缩深染。10ml/kg组:心肌纤维间轻微淤血，可见心肌纤维溶解，核溶解或固缩深染。25ml/kg组:心肌纤维间轻微淤血及核深染。50ml/kg组：心肌纤维间轻微淤血，心肌组织结构基本无异常。阳性给药组:心肌纤维间轻微淤血，心肌组织结构基本无异常。（1：对照组；2：阿霉素模型组；3：中药组合物提取液10ml/kg剂量组；4:中药组合物提取液25ml/kg剂量组；5:中药组合物提取液50ml/kg剂量组；6:右丙亚胺阳性药组）

试验例8心肌组织TUNEL凋亡检测及凋亡相关蛋白Caspase3/9、Bax、Bcl-2检测

心肌组织在固定、切片后，二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分钟。PBS或HBSS洗涤3次。在样品上加50μlTUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。

新鲜的或-80℃保存的心脏组织按1：10加入生理盐水，匀浆，1000r/min离心5min。加入适量的哺乳动物组织蛋白抽提试剂（含1%蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟；PMSF），混匀后置于冰上裂解40min。裂解完全后，4℃离心10min（12000×g），轻轻的吸取取上清（注意不要洗到沉淀）。BCA测定蛋白浓度。蛋白定量、煮样、上样。盖上电泳槽盖，电压80V，电流300mA电泳，约2h。电泳结束后，100V，300mA转膜1h。转膜结束后，将膜放入含5%脱脂奶粉的TBST溶液中，摇床上室温封闭2h。一抗用含5%脱脂奶粉的TBST溶液稀释相应倍数，将封闭后的PVDF膜直接放入适量的一抗中，使封闭液全部覆盖膜表面，4℃孵育过夜。将PVDF膜取出，用1×TBST漂洗三次，每次15min。之后将膜放入用含5%脱脂奶粉的TBST稀释好的二抗（1：1000）中，室温孵育2h。将现配的ECL发光工作液滴加在膜上，室温避光孵育5min，显色后用凝胶成像系统进行扫描、拍片。

结果如图5所示:TUNEL检测表明阿霉素治疗组小鼠心肌凋亡明显，而中药组合物提取液剂量依赖性的减少心肌细胞的凋亡；Westernblot检测显示阿霉素组凋亡蛋白caspase3/9的表达显著增加，促凋亡蛋白Bax表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低。而中药组合物提取液可以剂量依赖型的降低凋亡相关蛋白的表达，增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达。（1：对照组；2：阿霉素模型组；3：中药组合物提取液10ml/kg剂量组；4:中药组合物提取液25ml/kg剂量组；5:中药组合物提取液50ml/kg剂量组；6:右丙亚胺阳性药组）

显然，本发明的上述试验例仅仅是为清楚地说明本发明中药组合物的新用途，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。