一种神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病细菌MLPA检测探针及其应用

摘要

本发明公开了一种神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病细菌MLPA检测探针及其应用，该探针包括第一组探针至第十七组探针，依序为检测脑膜炎奈瑟氏菌、绿脓假单胞菌、沙门氏菌属、嗜麦芽寡养单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、克雷伯氏肺炎菌、粘质沙雷氏菌、鲁氏不动杆菌、白喉杆菌、缓症链球菌、鲍氏不动杆菌、肺炎链球菌、痤疮丙酸杆菌、李斯特氏菌、阴沟肠杆菌和流感嗜血杆菌的探针。本发明依据MLPA技术研发，能一次、快速诊断神经外科手术后颅内细菌性感染17种常见致病细菌，为此类病人致病菌的快速诊断提供了可能，有助于降低此类感染的致死率和致残率。

说明书

技术领域

本发明属于病原微生物检测技术领域，具体涉及一种神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病细菌MLPA检测探针及其应用。

背景技术

神经外科手术后颅内细菌性感染最常表现为脑膜炎、硬膜下积脓症或脑脓肿。国外报道颅内感染死亡率为27.4％～35％[42,43]。国内学者报道，重症神经外科手术后颅内细菌性感染死亡率可高达57％[44]。

神经外科手术后颅内细菌性感染有几十种致病细菌，常见的有近20种，来自近10个不同细菌属。大多数为革兰氏阳性菌，其中最常见的病菌是金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(分别可占31％和37％)，其次为链球菌属和疮疱丙酸杆菌(各占近10％)，多为皮肤性菌群；而革兰氏阴性菌中，肠杆菌属和不动杆菌属为主要病原菌(分别可占近10％)。此外，绿脓假单胞菌和克雷伯氏肺炎菌是较常见的革兰氏阴性致病菌，该类病菌主要来自呼吸道和肠道[45]。而国内外有关神经外科手术后颅内细菌性感染的流行病学和微生物学特征研究结果大致与之类[46]，见表1。

以PCR技术为代表的核酸检测技术多年来已经应用到感染的致病微生物诊断。与传统检测方法相比，核酸检测技术应用诊断神经外科手术后细菌性感染具有很多优势。首先，核酸检测技术无需细菌的培养分离，只需提取DNA，甚至可直接进行检测，可大大提高检测速度；其次，核酸检测技术具有非常高的特异性和灵敏度(理论上可检测一个细胞)，在保证检测准确性的前提下，大大提高了颅内细菌性感染的阳性检出率；再者，核酸检测技术不仅不受抗生素使用的影响，还可检测致病菌抗生素耐药基因，指导医生用药。常用的核酸检测技术主要包括荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH)、聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)、实时定量PCR(Real-time PCR)、广谱PCR(Broad range PCR)、多重Real time PCR、微阵列芯片(Microarray)和测序(Sequencing)。其中，从检测特异性、敏感性和检测速度等几个方面讲，实时定量PCR仍然目前是用于脑脊液样本中致病菌检测最为理想的技术。然而，此技术检测通量较低，最多只能同时检测8种致病菌，漏诊率高。理论上讲，尽管微阵列芯片和测序技术可以实现大多数致病菌的同时检测，但是这些技术都涉及大量数据的复杂分析，需要具有专业技 能的人员。总之，目前，临床上还没有一次性诊断的神经外科开颅手术后颅内细菌性感染8以上种致病菌的试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病细菌MLPA检测探针及其应用。

本发明的具体技术方案如下：

一种神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病细菌MLPA检测探针，包括第一组探针至第十七组探针，依序为检测脑膜炎奈瑟氏菌、绿脓假单胞菌、沙门氏菌属、嗜麦芽寡养单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、克雷伯氏肺炎菌、粘质沙雷氏菌、鲁氏不动杆菌、白喉杆菌、缓症链球菌、鲍氏不动杆菌、肺炎链球菌、痤疮丙酸杆菌、李斯特氏菌、阴沟肠杆菌和流感嗜血杆菌的探针，每组探针中分别含有左侧探针LPO和右侧探针RPO：

第一组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 1所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 2所示序列；

第二组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 3所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 4所示序列；

第三组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 5所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 6所示序列；

第四组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 7所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 8所示序列；

第五组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 9所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 10所示序列；

第六组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 11所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 12所示序列；

第七组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 13所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 14所示序列；

第八组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 15所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 16所示序列；

第九组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 17所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 18所示序列；

第十组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 19所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 20所示序列；

第十一组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 21所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 22所示序列；

第十二组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 23所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 24所示序列；

第十三组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 25所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 26所示序列；

第十四组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 27所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 28所示序列；

第十五组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 29所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 30所示序列；

第十六组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 31所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 32所示序列；

第十七组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 33所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 34所示序列。

在本发明的一个优选实施方案中，所述第一组探针至第十七组探针的每一右侧探针的5’端连接有如SEQ ID NO 35所示的BsmI酶切位点序列，3’端连接有如SEQ ID NO 36所示的Ecor V酶切位点序列。

一种神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病细菌MLPA检测方法，采用上述探针以待检样品的DNA为模板进行杂交。

在本发明的一个优选实施方案中，还包括采用一对通用引物对杂交后连接起来的左侧探针LPO和右侧探针RPO进行PCR扩增，所述通用引物的上游引物和下游引物分别含有SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38所示的序列。

一种神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病细菌MLPA检测试剂盒，包括上述探针。

在本发明的一个优选实施方案中，还包括一对通用引物，所述通用引物的上游引物和下游引物分别含有SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38所示的序列。

进一步优选的，还包括Ligase-65、Ligase buffer、Probe Mix和PCR Primer Mix，其中，

Ligase-65的配方为：1U/μL，其储存液为20mM Tris,pH 7.5，50mM KCl，1mM DTT，0.1mM EDTA和50％(v/v)甘油；

Ligase buffer的配方为：10×Ligation Buffer：400mM Tris，pH 7.8，100mM MgCl₂，100mM DTT，5mM ATP；

Probe Mix的配方为：每个探针的浓度为4fM，工作液为10mM Tris-Cl,pH 8.0，1mM EDTA；

PCR Primer Mix的配方为：含有所述通用引物的上游引物和下游引物，每个引物的浓度为10pM，上游引物为Cy 5.0标记，dNTPs 2.5mM，工作液为10mM Tris-Cl,pH 8.0，1mM EDTA。

本发明的有益效果是：

本发明依据MLPA技术研发，能一次、快速诊断神经外科手术后颅内细菌性感染17种常见致病细菌，为此类病人致病菌的快速诊断提供了可能，有助于降低此类感染的致死率和致残率。

附图说明

图1为本发明实施例5中PrbX的克隆之前PCR扩增反应产物电泳图(以检测1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌的右侧探针RPO Prb1为例，PCR扩增长度为165bp)；

图2为本发明实施例5中噬菌体颗粒悬液PCR验证的电泳图(以检测1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌的右侧探针RPO Prb1为例，PCR扩增长度为278bp)；

图3为本发明实施例5中噬菌体颗粒悬液PCR产物测序验证结果(以检测1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌的右侧探针RPO Prb1为例)；

图4为本发明实施例6中右侧长探针RPO的制备过程；

图5为本发明实施例6中PrbX-M13 ssDNA电泳结果图(以检测1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌的右侧探针RPO Prb1为例)；

图6为本发明实施例6中PrbX-M13 ssDNA溶液酶切产物电泳分析图(以检测1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌的右侧探针RPO Prb1为例)；

图7为本发明实施例7中单靶点PrbX MLPA验证电泳图(以检测1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌的右侧探针RPO Prb1为例，MLPA检测到的长度为144bp)；

图8为本发明实施例7中GeneScan^TM–600LIZ Size Standard毛细管电泳图；

图9为本发明实施例7中PrbX的MLPA反应毛细管电泳结果(以检测1号微生物脑 膜炎奈瑟氏菌的右侧探针RPO Prb1为例，MLPA检测到的长度为144bp)；

图10为本发明实施例8中17个靶点的MLPA反应毛细管电泳结果图；

图11为本发明实施例9中利用PrbX(以17号微生物流感嗜血杆菌阳性标准品质粒为例)检测不同稀释浓度的含Prb17流感嗜血杆菌靶点DNA的质粒的MLPA检测电泳图(M，DL 1000DNA Marker；1-10，分别把检测模板稀释1，10¹，10²，10³，10⁴，10⁵，10⁶，10⁷，10⁸，10⁹，10¹⁰倍，MLPA检测到的长度为512bp)；

图12为本发明实施例9中(以17号微生物流感嗜血杆菌阳性标准品质粒为例)模板检测限度重复性实验结果(A，模板10⁸稀释MLPA电泳图；B 10⁷倍稀释MLPA反应电泳检测图；1-20，20个重复平行实验，MLPA检测到的长度为512bp)；

图13为本发明实施例9中PrbX探针(以17号微生物流感嗜血杆菌右侧探针Prb17为例)不同浓度梯度稀释后MLPA反应凝胶电泳图(M，DL1000DNA Marker；1-8，探针做1，10¹，10²，10³，10⁴，10⁵，10⁶，10⁷，10⁸浓度梯度稀释，检测到的长度为512bp)；

图14为本发明实施例9中PrbX(以17号微生物流感嗜血杆菌右侧探针Prb17为例)10³和10⁴浓度梯度稀释20平行重复反应结果(A，10⁴稀释重复；B，10³稀释重复；M，DL 1000DNA Marker；1-20，20个重复平行实验，MLPA检测到的长度为512bp)；

图15为本发明实施例10中以探针Prb1(1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌，检测到的长度分别为144bp)、Prb8(8号微生物粘质沙雷氏菌，检测到的长度分别为271)和Prb17(17号微生物流感嗜血杆菌右侧探针Prb17，检测到的长度分别为512bp)短、中、长三个长度的探针为例，重复性能检测凝胶电泳图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1 颅内感染致病菌的检测靶点设计

首先总结了神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病菌，见表1：

表1. 显示神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病菌汇总

原则上，颅内感染致病菌的检测靶点的确定流程：进入PubMed查找对每种致病菌特异性的保守序列，如看家基因16S rRNA、rpoB、gyrB或ITS的序列，如表2所示：

表2. 神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病菌的检测靶点

实施例2 MLPA探针杂交靶点的参考序列

通过Blast工具分析比对神经外科颅内感染17种致病菌的保守性序列之后，确定参考序列以设计杂交探针，如表3：

表3. 显示MLPA探针杂交靶点的参考序列

实施例3 左侧探针LPO

本发明所设计的神经外科手术后颅内感染17种致病菌进行MLPA分析的左侧探针LPO的序列，见表4：

表4. 左侧探针LPO序列设计结果(为上游通用引物+杂交序列)

实施例4 右侧探针RPO

本发明所设计的神经外科颅内感染17种致病菌进行MLPA分析的右侧探针RPO的序列，见表5：

表5. 右侧探针RPO序列设计结果(包括4个部分)

实施例5 MLPA右侧探针RPO克隆过程

首先设计合成RPO PrbX片段(以检测1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌的右侧探针RPO Prb1(上述表5中1号的Bsm I酶切位点序列+杂交序列+EcoR V酶切位点序列+下游通用引物序列)制备过程为例)，进行PCR(上游引物Primer F：5'–GCTATGACCATGATTACG-3'(如SEQ ID NO 57所示)；下游引物Primer R：5'-GGCCAGTGCCAAGCTT-3'(如SEQ ID NO 58所示))扩增、产物纯化、连接克隆至双链M13mp18 RF I DNA(NEB公司，N4018S)转化到JM109感受态细胞(Promega公司，L2005)，经过蓝白斑筛选挑取蓝斑进行PCR扩增和测序(上游引物Clo_veri_pimer_F：5'-TCCGGCTCGTATGTTGTG-3'(如SEQ ID NO 59所示)；下游引物Clo_veri_pimer_R：5'-CTGCAAGGCGATTAAGTT-3'(如SEQ ID NO 60所示))确认。具体步骤如下：

1. RPO PrbX的PCR扩增反应体系，见表6：

表6. MLPA右侧探针RPO克隆前PCR扩增反应体系 

2. RPO PrbX的PCR扩增反应条件，见表7：

表7. MLPA右侧探针RPO克隆前PCR扩增程序

3. PrbX的PCR产物电泳，见图1(以检测1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌的右侧探针RPO

Prb1制备过程为例，PCR产物为165bp)。

4. PCR产物纯化

使用PCR产物纯化试剂盒MiniElute PCR Purification KIT(Qiagen公司，28004)对定点突变片段的PCR产物进行纯化，最后取10μL水进行洗脱(具体步骤参考试剂盒说明书)。

5.连接反应体系，见表8：

表8. 右侧探针RPO的DNA连接反应体系

6.反应条件：16℃，>8h

7.转化实验

采用Single-Use JM109 Competent Cells(Promega公司，L2005)进行转化实验(具体步骤参考说明书)。

8. PrbX-M13噬菌体载体验证

1)挑取PrbX DNA的连接产物转化成功后得到的单个蓝色噬菌斑，制备噬菌体颗粒悬液，任取一份进行噬菌体颗粒悬液PCR反应验证。

2)噬菌体颗粒悬液PCR反应，见表9，10：

表9. 噬菌体颗粒悬液PCR反应体系

表10. 噬菌体颗粒悬液PCR反应条件

3)电泳验证，见图2。

4)测序验证：将噬菌体颗粒悬液PCR产物进行测序，测序结果与标准序列((以检测1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌的右侧探针RPO Prb1制备过程为例，，PCR扩增长度为278bp)进行比对验证，结果如图3。

根据噬菌体颗粒悬液PCR产物的电泳验证和测序验证结果，Prb1合成探针DNA已成功地插入到M13噬菌体载体中。换句话说，Prb1-M13噬菌体载体经验证已构建成功。该噬菌体载体可用于MLPA右侧探针Prb1的制备。利用相同的方法克隆其它17个探针的PrbX-M13噬菌体载体。

实施例6 右侧探针RPO PrbX的制备

流程包括：提取纯化PrbX-M13噬菌体载体、探针制备引物的设计以及Bsm I和EcoR V双酶切等内容，见图4(以检测1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌的右侧探针RPO Prb1制备过程为例)。

1.右侧探针RPO PrbX的制备

1)PrbX-M13单链DNA的提取纯化 

(1)PrbX-M13噬菌体液体1mL培养5h，培养体积为1mL。

(2)将PrbX-M13噬菌体液体培养物离心，得到的上清液用于制备PrbX-M13单链DNA，细菌沉淀物则用于PrbX-M13双链DNA的制备。

(3)使用QIAprep Spin M13Kit(Qiagen公司，27704)按照试剂盒说明书进行提取纯化PrbX-M13单链DNA，最后取100μL EB洗脱液洗脱，获得PrbX-M13单链DNA溶液；同时使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司，27104)试剂盒制备PrbX-M13双链DNA，以作为参照。

(4)将提取纯化得到的PrbX-M13单链DNA和双链DNA溶液进行电泳分析，电泳结果如图5(以检测1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌右侧探针RPO Prb1为例)：

2)探针制备引物的设计

探针制备引物包括两条，分别与PrbX-M13 ssDNA上EcoR V酶切位点处和Bsm I酶切位点处退火结合形成双链DNA，然后经过EcoR V和Bsm I限制性内切酶的消化作用便可得到目的长链探针。探针制备引物的设计主要考虑几个因素包括引物的长度、引物序列结合位置、引物的Tm值、GC含量等，具体设计结果如表11所示：

表11. 制备右侧单链探针RPO的引物

3)探针制备引物的退火实验

此步骤重点在于PrbX-M13 ssDNA的分子量和浓度的计算。探针制备引物的摩尔数应和含有其他右侧探针RPO PrbX的M13 ssDNA摩尔数大体相等。以检测1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌右侧探针RPO Prb1为例，通过计算可知，Prb1-M13 ssDNA的相对分子量大约为4.5×10⁶。因此，500ng Prb1-M13 ssDNA的摩尔数约为100pmol。以50μL为终体积，PrbX-M13 ssDNA的终浓度则为2μM。以下是具体实验过程：

(1)探针制备引物退火反应体系，见表12：

表12. 制备探针的引物退火反应体系

(2)探针制备引物退火反应条件，见表13：

表13. 制备探针的引物退火反应条件

4)EcoR V和Bsm I酶切实验

(1)经退火反应之后，向PrbX-M13 ssDNA溶液(43μL)中首先加入EcoR V限制性内切酶进行消化，EcoRV的酶切反应体系见表14：

表14. PrbX-M13 ssDNA溶液EcoR V酶切反应体系

(2)PrbX-M13 ssDNA溶液EcoR V酶切反应条件：37℃温浴2h。

(3)经EcoR V限制性内切酶进行消化后，直接向PrbX-M13 ssDNA溶液(49μL)中Bsm I限制性内切酶进行消化，Bsm I的酶切反应体系见表15：

表15. PrbX-M13 ssDNA溶液Bsm I酶切反应体系

(4)PrbX-M13 ssDNA溶液Bsm I酶切反应条件：65℃温浴2h。

(5)PrbX-M13 ssDNA溶液酶切产物电泳分析，见图6(以检测1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌右侧探针RPO Prb1为例)。

根据电泳结果，Prb1-M13 ssDNA溶液分别经EcoR V和Bsm I限制性内切酶消化后的产物经电泳分离后得到两个电泳条带，由此可初步判断，Prb1-M13 ssDNA溶液酶切成功，理论上讲，100bp的位置的条带便是长探针产物，其浓度应为2μM。该长探针溶液(PrbX-M13 ssDNA酶切剩余部分不必去除)将作为本课题第一个MLPA右侧探针Prb1用于下游针对单靶点的MLPA检测验证实验。另外，按照上述既定的实验流程，其他16个探针的噬菌体载体也同样构建完成，一起用于下游针对多靶点的MLPA检测验证实验。

实施例7 单靶点MLPA分析

MLPA右边探针RPO制备完成后，最重要的是要验证其能否和MLPA左侧探针LPO一起完成对检测靶点的MLPA检测。步骤如下：

1.检测单靶点阳性标准品的设计与制备

1)针对每一个检测靶点，分别选取包含MLPA探针(LPO+RPO)杂交序列的DNA序列(长度尽量控制在200-300bp之间)，见表16：

表16. 17种致病细菌的阳性标准品检测靶点的DNA序列

2)通过基因合成方法合成上述每一个DNA序列，并将合成好的序列克隆入PUC57质粒载体中(由金斯瑞公司完成)。

3)质粒转化大肠杆菌宿主菌中进行扩增培养。

4)质粒DNA提取纯化，该质粒DNA即为检测靶点阳性标准品。

2.MLPA探针反应液的配制

1)MLPA LPO和RPO标准溶液制备：

分别用TE(10mM Tris-HCl,pH 8.0，1mM EDTA)分别将MLPA LPO(100μM)和RPO原液(2μM，50μL)的终浓度稀释到1μM。

2)MLPA探针反应液制备：

每一份LPO和RPO标准溶液各取1μL混匀，然后加TE缓冲液到600μL，混匀，此溶液即为MLPA探针反应液(每次取1.5μL进行MLPA反应)。

3.单靶点MLPA验证实验

1)单检测靶点PrbX阳性标准品溶液准备：

用TE悬浮检测靶点阳性标准品(10μg)，并稀释至终浓度为100ng/μL，作为储存液。然后取10μL储存液稀释10倍得到单检测靶点阳性标准品溶液(浓度为10ng/μL)。

2)杂交反应预混液配制(使用前1h)，见表17：

表17. MLPA杂交反应预混液配制方法

3)连接反应预混液配制(使用前1h)，见表18：

表18. MLPA连接反应预混液配制方法

4)PCR反应预混液配制(使用前1h)，见表19：

表19. PCR反应预混液配制方法

5)PCR反应程序设置，见表20：

表20. MLPA杂交PCR反应程序

6)DNA变性反应：向200μL PCR反应管中加入5μL检测靶点阳性标准品溶液，置于PCR仪，运行PCR反应Step1和Step2。反应结束后可从PCR仪取下反应管，开始下一步。

7)杂交反应：向每个反应管加入3μL杂交反应预混液。吹打混匀，运行PCR反应Step3和Step4。杂交时间>8h。

8)连接反应：运行PCR反应Step5。待样本温度为54℃时，每个样本加入32μL连接反应预混液，吹打混匀。继续运行PCR反应Step6-8。

9)PCR扩增反应：在室温下，向每个反应管中加入10μL PCR反应预混液，轻轻吹打混匀。然后运行PCR反应Step9-11。

10)电泳分析，见图7(以检测1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌右侧探针RPO Prb1为例，检测到的长度为144bp)。

11)运行MLPA反应产物检测与特异性分析

(1)实验准备：检测样本：MLPA反应产物；ABI3500测序仪器相关的试剂与耗材；Liz standard和fornamide保护液至于冰上溶解：Genmapper分析软件。

(2)上样Injection mixture：取200μL的PCR反应管加入1)中的MLPA反应产物1μL和99μL的TE缓冲液，然后再取一只200μL的PCR反应管，然后依次加入如下表格试剂充分混匀后做短暂离心。

Injection mixture体系：

(3)变性：将反应管中的Injection mixture至于PCR仪80℃恒温变性2min，结束后立即取出反应管至于冰上数分钟。

(4)取一个干净的ABI3500上样板，然后将变性好的Injection mixture加入到上样板的孔槽中，注意加样的时候尽量不要使样品留在管壁，加样结束后做旋转离心使得样本沉于槽底并保证没有气泡产生。

(5)使用配套的硅胶垫封闭上样板，然后将上样板放入上样槽中封闭。

(6)开启ABI3500配套计算机，然后等待机器自检结束后开启ABI3500主机，等待主机自检结束后(显示灯变成绿色)打开仪器软件。

(7)开启ABI3500配套软件，检查各种配套的试剂耗材是否已经用完和过期，确保机器处于可以检测性能时，创建一个模板，做好检测参数(本发明使用Pop7电泳胶进行MLPA反应产物分析)、命名和保存位置等设置后然点击运行的样本槽，选择要运行的样本位置和上样孔的位置。

(8)打开ABI3500舱门，然后将上样槽放入机器的自动上样手臂，关闭舱门后点击开启仪器的预热功能，使得仪器个部位的温度达到运行要求，然后点击运行仪器。

(9)仪器自动运行，结束后产生的数据会自动保存到特定的位置，产生的数据使用Genmapper分析软件进行分析。

毛细管电泳技术是一种分辨率非常高的DNA检测技术，可以明确分辨出差别为4bp的片段，非常广泛地应用于MLPA反应产物检测。本研究使用ABI3500测序仪对MLPA反应结果进行毛细管电泳，其中1根毛细电泳管对GeneScan^TM-600 LIZ Size Standard Marker进行管电泳，发现能够非常精确地定位到每一个每个片段(20bp到600bp大小，橙色吸收峰，如图8)，并同时逐个对17个诊断探针的单靶点MLPA反应产物进行毛细管电泳，如图9。证实运用这17对探针对17个阳性质粒标准品的MLPA产物片段长度完全符合设计的检测长度，单一峰，也证实了每对探针的较好的特异性。

实施例8 致病细菌阳性标准品17个检测靶点多重MLPA分析

1. 17个检测靶点的阳性标准品溶液：17个检测靶点阳性标准品溶液混在一起共5μL。

2.多重MLPA探针反应液：取标准单靶点MLPA探针反应液各1μL加入到200μL的PCR反应管中，吹打混匀制备成多重反应混合液Mix。

3.其他操作步骤与反应体系与条件与实施例7中的3相同。

结果如图10。蓝色吸收峰代表多重MLPA反应结果。从该峰值吸收结果判断Prb1-17均能够反应产生符合设计长度的吸收峰值，说明这17对探针设计是成功的。

实施例9 MLPA探针灵敏度验证

以检测17号微生物流感嗜血杆菌右侧探针Prb17的灵敏度检测为例，步骤如下：

1.用TE缓冲液把含阳性靶点DNA的质粒做如下梯度稀释：10¹，10²，10³，10⁴，10⁵， 10⁶，10⁷，10⁸，10⁹，10¹⁰(图11，泳道1-10)。探针做如下稀释：10¹，10²，10³，10⁴，10⁵，10⁶，10⁷，10⁸。

2.设计模板检测灵敏度要运行的实验：以稀释不同浓度的模板作为反应靶位点，以1μmol的探针作为反应物MLPA反应，通过1％凝胶电泳分析。

3.设计探针灵敏度运行试验：以最长的Prb17探针为例，做不用浓度的稀释来检测标准靶序列运行MLPA反应，反应产物用1％凝胶电泳检测。

4.凝胶电泳检测结果后做重复性实验验证最小灵敏度的重复性反应性能。MLPA产物使用1％凝胶检测。

1)检测标准品DNA浓度分析

图11凝胶电泳结果显Prb17探针标准靶点稀释10⁷倍(泳道7)能清晰的看到反应条带，10⁸倍(泳道8)浓度稀释时条带已经接近模糊。然后分别做了两个稀释度的重复性实验，如图12(A1-20泳道为稀释10⁸倍，无产物检测到)，标准模板做10⁷倍(B1-20泳道为稀释10⁷倍，产物被稳定地检测到)稀释后重现性仍然达到100％，说明MLPA探针的检测灵敏度非常高，可以达到皮克级别的检测限度，和PCR检测灵敏度属于同一级别。

2)MLPA探针浓度检测灵敏度分析

探针浓度是影响MLPA反应检测限度的重要因素，如图13所示，制备的Prb17标准做不同浓度的稀释后进行MLPA反应凝胶电泳图，随着探针的浓度梯度稀释检测结果会有明显变化，当稀释浓度梯度达到10⁴(泳道5)稀释后电泳条带完全消失。同时做10⁴和10³倍浓度梯度稀释的20平行重复实验，稀释10⁴倍不能检测到产物(见图14，A 1-20泳道)，而稀释10³倍能够稳定地检测到产物(见图14，B 1-20泳道)。说明探针浓度的检测极限在纳克级别，因此探针的浓度影响着MLPA反应检测，同时也可以控制不同的探针浓度来控制多重MLPA反应中的探针峰值吸收得到比较好的检测效果。

实施例10 MLPA探针重复性验证

取标准品作为反应物，以探针Prb1(1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌，检测到的长度分别为144bp)、Prb8(8号微生物粘质沙雷氏菌，检测到的长度分别为271)和Prb17(17号微生物流感嗜血杆菌右侧探针Prb17，检测到的长度分别为512bp)短、中、长三个长度的探针为例，每个探针进行20次MLPA重复实验，再进行1％凝胶电泳检测。如图15所示，短、中、长三个长度的探针MLPA反应均有明亮单一的条带，初步说明探针重复性能非常 好。

以上证实此MLPA诊断试剂盒具有较高的探针特异性、敏感性、重复性。另外，经计算，1mL PrbX-M13噬菌体液体培养液制备的长探针理论上可足够进行16万次的MLPA反应，使得探针的制备成本大大降低。由此可见，将MLPA技术应用于神经外科颅内细菌性感染的一次性多致病细菌诊断具有良好的市场开发潜力。

实施例11

下述序列均为送公司进行化学合成而得

一种神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病细菌MLPA检测试剂盒，包括第一组探针至第十七组探针，依序为检测脑膜炎奈瑟氏菌、绿脓假单胞菌、沙门氏菌属、嗜麦芽寡养单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、克雷伯氏肺炎菌、粘质沙雷氏菌、鲁氏不动杆菌、白喉杆菌、缓症链球菌、鲍氏不动杆菌、肺炎链球菌、痤疮丙酸杆菌、李斯特氏菌、阴沟肠杆菌和流感嗜血杆菌的探针，每组探针中分别含有左侧探针LPO和右侧探针RPO：

第一组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 1所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 2所示序列；

第二组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 3所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 4所示序列；

第三组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 5所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 6所示序列；

第四组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 7所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 8所示序列；

第五组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 9所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 10所示序列；

第六组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 11所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 12所示序列；

第七组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 13所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 14所示序列；

第八组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 15所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 16所示序列；

第九组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 17所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 18所示序列；

第十组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 19所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 20所示序列；

第十一组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 21所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 22所示序列；

第十二组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 23所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 24所示序列；

第十三组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 25所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 26所示序列；

第十四组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 27所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 28所示序列；

第十五组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 29所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 30所示序列；

第十六组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 31所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 32所示序列；

第十七组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 33所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 34所示序列。

采用上述探针以待检样品的DNA为模板进行杂交。

所述第一组探针至第十七组探针的每一右侧探针的5’端连接有如SEQ ID NO 35所示的BsmI酶切位点序列，3’端连接有如SEQ ID NO 36所示的EcoR V酶切位点序列。

该试剂盒还包括采用一对通用引物对杂交后连接起来的左侧探针LPO和右侧探针RPO进行PCR扩增，所述通用引物的上游引物和下游引物分别含有SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38所示的序列。

进一步的，该试剂盒还包括Ligase-65、Ligase buffer、Probe Mix和PCR Primer Mix，其中，

Ligase-65的配方为：1U/μL，其储存液为20mM Tris,pH 7.5，50mM KCl，1mM DTT，0.1mM EDTA和50％(v/v)甘油；

Ligase buffer的配方为：10×Ligation Buffer：400mM Tris，pH 7.8，100mM MgCl₂，100mM DTT，5mM ATP；

Probe Mix的配方为：每个探针的浓度为4fM，工作液为10mM Tris-Cl,pH 8.0，1mM EDTA；

PCR Primer Mix的配方为：含有所述通用引物的上游引物和下游引物，每个引物的浓度为10pM，上游引物为Cy 5.0标记，dNTPs 2.5mM，工作液为10mM Tris-Cl,pH 8.0，1mM EDTA。

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以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。