基于银纳米粒子三聚体的表面增强拉曼散射效应超灵敏检测甲胎蛋白的方法

摘要

基于银纳米粒子三聚体的表面增强拉曼散射效应超灵敏检测甲胎蛋白的方法，属于分析化学技术领域。本发明具体包括15nm粒径银纳米粒子的合成、银纳米粒子修饰DNA、银纳米粒子三聚体的组装，并对其进行TEM表征和拉曼信号测试。本发明首次通过组装银纳米粒子三聚体，银纳米粒子三聚体具有强的拉曼信号，在外加甲胎蛋白后拉曼信号发生变化，用此拉曼信号的变化实现了甲胎蛋白的快速超灵敏检测。

说明书

技术领域

本发明涉及基于银纳米粒子三聚体的表面增强拉曼散射效应超灵敏检测甲胎蛋白的方法，属于分析化学技术领域。

背景技术

甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP），是一种致癌糖蛋白，作为一种成人生理状态的“分子标记”，并经常用作诊断肝细胞癌、卵黄囊肿瘤、生殖细胞肿瘤、胃癌的合适的生物标志物。目前检测AFP 的方法主要有放射免疫分析法和酶联免疫法（ELISA），但均存在一定的优缺点，适用范围上也各有不同，所以临床应用中需考虑这两种方法都存在着一些不足之处。ELISA法检测肿瘤标志物时，因蛋白质容易热变性，所以很难检测蛋白类肿瘤标志物，另ELISA法的灵敏度较低，而且耗力耗时；放射免疫分析法有时会出现交叉反应、假阳性反应，组织样品处理不够迅速，不能灭活降解酶，盐及pH有时会影响结果等缺点。如何建立灵敏和特异的检测肿瘤标志物的方法也是需要急需解决的一个难点问题，而纳米材料是当今社会的研究热点，可以把纳米材料作为一种新型探针，进行AFP的快速灵敏检测是一大亮点。

由于自身尺寸大小，纳米结构材料具有独特的理化性质，成为当前材料研究最活跃的领域之一。最近几十年，银纳米粒子由于其独特的物理化学性质（如小尺寸效应、表面效应、量子隧道效应、介电限域效应、宏观量子隧道效应等）， 尤其银纳米材料还具有良好的抗菌活性，已经成为许多基础研究与应用研究所关注的对象。纳米材料的自组装是纳米技术的一个研究热点，原因在于自组装纳米材料能够表现出不同于单分散的纳米粒子的独特的光学、电学、磁学和化学性质， 通过研究自组装材料的性质可以更好地理解宏观材料的物理和化学性质。表面增强拉曼散射（SERS）是一种已被广泛应用于化学和生物传感的分析方法，相比于荧光技术检测，由于表面增强拉曼光谱是一种通过非特异性的波长激光激发得到特定分子的指纹图谱和它通过金属粒子周围拉曼信标保持其光的稳定性并提供化学键信息，因此SERS能够收集较窄拉曼光谱的峰宽，具有更大的潜在生物标志物分析应用能力。

本发明首先通过在银纳米粒子的表面修饰甲胎蛋白的适配体及其互补序列，进行三聚体组装，并对其拉曼性质进行了研究和探讨。加入不同浓度的甲胎蛋白溶液，对三聚体的拉曼信号进行测试，以达到对甲胎蛋白的传感检测目的，检测线可达到0.097aM。

发明内容

本发明的目的是提供基于银纳米粒子三聚体的表面增强拉曼散射效应超灵敏检测甲胎蛋白的方法。

本发明的技术方案，基于银纳米粒子三聚体的表面增强拉曼散射效应超灵敏检测甲胎蛋白的方法，包括银纳米粒子的合成，银纳米粒子三聚体的组装及结构表征、拉曼信号测试，用银纳米粒子三聚体检测甲胎蛋白。具体步骤如下：

（1）银纳米粒子的合成：根据申请号201110274220.X公开的内容进行 15 nm银纳米粒子的合成；取20mL超纯水与5mL质量分数1%的聚乙烯吡咯烷酮混合，再加入0.6 mL 0.1mol/L的硼氢化钠水溶液，此反应在冰浴中进行。然后，将 5 mL 质量分数为1%的聚乙烯吡咯烷酮水溶液和5mL质量分数为0.15%的硝酸银水溶液同时以30mL/h的速度用注射泵加入到上述溶液中，注意边搅拌边加入，待加入结束后，立即放入80℃水浴中生长2h, 即得到15nm银纳米粒子。

（2）银纳米粒子三聚体的组装：取三管已浓缩好的15nm粒径银纳米粒子溶胶，保证每管中每个银纳米粒子表面分别可控修饰一个甲胎蛋白的适配体及和其互补序列，进行杂交得银纳米粒子三具体；

通过电镜TEM和拉曼光谱仪对银纳米粒子三聚体的结构及拉曼信号进行表征和测试；

适配体5’-SH-GGCAGGAAGA CAAACAGGAC CGGGTTGTGT

GGGGTTTTAA GAGCGTCGCC TGTGTGTGGT CTGTGGTGCT GT-3’；

互补序列1：5’-SH-CCGGTCCTGT TTGTCTTCCT-3’，

互补序列2：5’-SH-GGCGACGCTC TTAAAACCCCA-3’；

（3）甲胎蛋白的检测：将甲胎蛋白加入已组装好的银纳米粒子三聚体中，反应10min，进行拉曼测试；

所述银纳米粒子三聚体的组装：取三管50mL已浓缩好的银纳米粒子分别和50mL巯基修饰的甲胎蛋白的适配体及其互补序列进行偶联，在室温下过夜反应，分别在13000r/min 离心15 min，弃上清，后用50mL 的超纯水分散沉淀，待用；

将50mL银-适配体、50 mL银-互补序列1、50mL银-互补序列2于150mL的5 mM PB缓冲液中，杂交反应12h，组装产物离心15 min，弃上清，后用100mL的超纯水分散，进行TEM和拉曼表征。

所述甲胎蛋白的检测：取100mL的银纳米粒子三聚体，加入1mL不同浓度的甲胎蛋白，使其终浓度在0～20aM（具体为0、0.2、0.5、1、2、5、10、20 aM），反应10 min，进行拉曼测试。

本发明的有益效果：本发明基于拉曼信号作为检测信号，不仅稳定而且检测限低，而银纳米粒子在红外区具有最强的等离子共振峰。本发明组装了银纳米粒子三聚体并显示较强的拉曼信号，基于强的拉曼强度进行甲胎蛋白的检测，可以大大提高检测的灵敏度。

附图说明

图1银纳米粒子三聚体组装结构的TEM图。

图2不同浓度甲胎蛋白下银纳米粒子三聚体的拉曼信号。

图3基于银纳米粒子三聚体组装结构进行甲胎蛋白检测标准曲线。

具体实施方式

实施例1基于银纳米粒子三聚体的表面增强拉曼散射效应超灵敏检测甲胎蛋白的方法

（1）银纳米粒子三聚体的合成：根据申请号201110274220.X公开的内容进行15 nm银纳米粒子的合成；取20 mL超纯水与5 mL质量分数 1% 的聚乙烯吡咯烷酮混合，再加入0.6 mL 0.1mol/L的硼氢化钠水溶液，此反应在冰浴中进行。然后，将5 mL质量分数为1%的聚乙烯吡咯烷酮水溶液和5 mL质量分数为0.15%的硝酸银水溶液同时以30mL/h的速度用注射泵加入到上述溶液中，注意边搅拌边加入，待加入结束后，立即放入80℃水浴中生长2h，即得到15nm银纳米粒子。

将合成好的100mL 15 nm的银纳米粒子在13000r/min 离心15min，弃上清，后用200mL的超纯水分散沉淀，待用。

（2）银纳米粒子三聚体的组装：取三管50mL已浓缩好的银纳米粒子分别和50mL巯基修饰的甲胎蛋白的适配体及其互补序列进行偶联，在室温下过夜反应，分别在13000r/min离心15min，弃上清，后用50mL的超纯水分散沉淀，待用；

将 50mL银-适配体、50mL银-互补序列1、50mL银-互补序列2于150mL的5 mM PB缓冲液中，杂交反应12h，组装产物离心15 min，弃上清，后用100mL的超纯水分散，进行TEM和拉曼表征。

（3）甲胎蛋白的检测：取100mL的银纳米粒子三聚体组装体，加入1mL甲胎蛋白溶液，终浓度范围为 0，0.2，0.5，1，2，5，10，20aM，反应10 min，进行拉曼测试。最低检测限达0.097aM。