一种中缅树鼩组织DNA的提取方法

摘要

本发明提供了一种中缅树鼩组织DNA的提取方法，包括以下步骤：a)将中缅树鼩组织在匀浆液中离；b)将步骤a)获得的上清液离心；c)将步骤c)获得的沉淀在匀浆液中离心；d)将步骤c)获得的沉淀与第一溶液混合均匀，再与第二溶液混合后冰溶；e)将步骤d)获得的溶液以第三溶液混合，冰溶；f)将步骤e)获得的溶液离心；g)将步骤f)获得的上清液在混合溶液中抽提，重复一次；h)将步骤g)获得的上清液与无水乙醇混合，放置过夜；i)将步骤h)获得的溶液离心，用乙醇洗涤干燥。本发明通过限定提取过程中试剂种类、试剂用量以及提取条件，提取得到的DNA纯度较高，电泳条带无拖尾现象，且成本较低。

说明书

技术领域

本发明属于DNA提取技术领域，尤其涉及一种中缅树鼩组织DNA的提取方法。

背景技术

中缅树鼩是一类小型的攀援型哺乳动物，形似松鼠，在种系上较小鼠、大鼠等常 用啮齿类实验动物更接近人类，并且能够罹患许多与人相似的疾病，是目前除黑猩猩、 长臂猿外，唯一能够感染人类乙肝病毒的动物，受到了生物学与医学工作者的高度关 注。

对中缅树鼩进行研究时，提取其组织DNA是必不可少的步骤之一。现有技术公 开了诸多其他动物DNA的提取方法，但这些方法均不适用于中缅树鼩组织NDA的提 取，提取得到的DNA纯度较低，DNA的电泳条带拖尾现象严重。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中缅树鼩组织DNA的提取方法，本发明提供的提取 方法提取得到中缅树鼩的DNA纯度较高，电泳条带无拖尾现象。

本发明提供了一种中缅树鼩组织DNA的提取方法，包括以下步骤：

a)将中缅树鼩组织在匀浆液中在3～5℃、1200r/min～1800r/min条件下离心 8min～12min，所述中缅树鼩组织与匀浆液的质量体积比为0.15～0.25g：0.5～1.5mL；

b)将步骤a)获得的上清液在3～5℃、1200r/min～1800r/min条件下离心 18min～22min；

c)将步骤c)获得的沉淀在匀浆液中在3～5℃、1200r/min～1800r/min条件下离心 8min～12min，所述匀浆液与中缅树鼩组织的体积质量比为1.5～2.5mL：0.15～0.25g；

d)将步骤c)获得的沉淀与第一溶液混合均匀，再与第二溶液混合后冰溶 8min～12min；所述第一溶液包括Tris-HCl、Na₂EDTA和NaCl；所述第二溶液包括 NaOH和十二烷基硫酸钠；所述第一溶液、第二溶液和中缅树鼩组织的体积质量比为 40～60μL：90～110μL：0.15～0.25g；

e)将步骤d)获得的溶液以第三溶液混合，冰溶50min～70min；所述第三溶液包 括钾离子和醋酸离子；所述第三溶液与第二溶液的体积比为70～80:90～110；

f)将步骤e)获得的溶液在11000r/min～13000r/min条件下离心8min～12min；

g)将步骤f)获得的上清液在混合溶液中在11000r/min～13000r/min条件下抽提 2～3min，重复一次；所述混合溶液包括酚、氯仿和异戊醇；所述上清液与所述混合溶 液的体积比为0.8～1.2:0.8～1.2；

h)将步骤g)获得的上清液与3℃～5℃的无水乙醇混合，在-35℃～-45℃放置过 夜；

i)将步骤h)获得的溶液在3℃～5℃、11000r/min～13000r/min下离心15min～30min， 用3℃～5℃乙醇洗涤干燥。

本发明首先将中缅树鼩的组织在匀浆液中进行离心提取线粒体DNA，中缅树鼩 组织与匀浆液的质量体积比优选为0.2g：1mL，所述离心的条件优选为4℃、1500r/min， 离心时间优选为10min。所述匀浆液中包括蔗糖、Na₂EDTA、Tris-HCl、CaCl₂，优选 包括0.25mol/L蔗糖、10mmol/L Na₂EDTA、30mmol/L Tris-HCl和2.5mmol/L CaCl₂。 所述匀浆液的pH值优选为8.2。

经过第一次离心获得上清液后，继续在3～5℃、1200r/min～1800r/min条件下离心 18min～22min。第二次离心的条件优选为4℃、1500r/min离心20min。

第二次离心完毕后，弃上清液后得到的沉淀在匀浆液中在3～5℃、 1200r/min～1800r/min条件下离心8min～12min。第三次离心的条件优选为4℃、 1500r/min离心10min。第三次离心使用的匀浆液与第一次离心上使用的匀浆液相同， 包括蔗糖、Na₂EDTA、Tris-HCl、CaCl₂，优选包括0.25mol/L蔗糖、10mmol/L Na₂EDTA、 30mmol/L Tris-HCl和2.5mmol/L CaCl₂。所述匀浆液的pH值优选为8.2。第三次离心 使用的匀浆液与中缅树鼩组织的体积质量比为1.5～2.5mL：0.15～0.25g，优选为2mL： 0.2g。

第三次离心完毕后，将得到的沉淀与第一溶液混合均匀，再与第二溶液混合后冰 溶8min～12min。其中，所述第一溶液包括Tris-HCl、Na₂EDTA和NaCl，优选包括 10mmol/L Tris-HCl、10mmol/L Na₂EDTA和0.15mmol/L NaCl；所述第一溶液的pH 值为8.0。将第三次离心完毕后得到的沉淀与第一溶液混合后轻轻吹打混合均匀，然 后与第二溶液混合后冰溶8min～12min，优选冰溶10min。所述第二溶液包括NaOH 和十二烷基硫酸钠，优选包括1wt％的十二烷基硫酸钠和0.2mmol/L NaOH。所述第 一溶液、第二溶液和中缅树鼩组织的体积质量比为40～60μL：90～110μL：0.15～0.25g， 更优选为50μL：100μL：0.2g。

然后再将得到的溶液与第三溶液混合，冰溶50min～70min，优选60min。所述第 三溶液包括钾离子和醋酸离子，其中，钾离子浓度优选为3mol/L，所述醋酸根离子 浓度优选为5mol/L。第三溶液和第二溶液的体积比为70～80:90～110，优选为75:100。

将获得的溶液在11000r/min～13000r/min条件下离心8min～12min，第四次离心的 条件优选为12000r/min，离心10min。

将第四次离心获得的上清液在混合溶液中在11000r/min～13000r/min条件下抽提 2～3min，重复一次，抽提条件优选为12000r/min。其中，所述混合溶液为酚氯仿，包 括酚、氯仿和异戊醇，酚、氯仿和异戊醇的体积比为24:24:1。所述上清液和混合溶 液的体积比为0.8～1.2:0.8～1.2，优选为1:1。

将抽提后获得的上清液与3℃～5℃的无水乙醇混合，在-35℃～-45℃下放置过夜。 其中，无水乙醇优选为4℃，放置过夜的温度优选为-40℃。

在冷冻过夜的溶液在3℃～5℃、11000r/min～13000r/min下离心15min～30min，用 4℃乙醇洗涤干燥，即可提取得到DNA。其中，第五次离心的条件优选为4℃、 12000r/min。所述乙醇优选为75％的乙醇。

本发明提供的提取方法的一个典型实施例如下：

a)将中缅树鼩组织在匀浆液中4℃、1500r/min条件下离心10min，所述中缅树 鼩组织与匀浆液的质量体积比为0.2g：1mL；

b)将步骤a)获得的上清液在4℃、1500r/min条件下离心20min；

c)将步骤c)获得的沉淀在匀浆液中在4℃、1500r/min条件下离心10min，所述 匀浆液与中缅树鼩组织的体积质量比为2mL：0.2g；

d)将步骤c)获得的沉淀与第一溶液混合均匀，再与第二溶液混合后冰溶10min； 所述第一溶液包括Tris-HCl、Na₂EDTA和NaCl；所述第二溶液包括NaOH和十二烷 基硫酸钠；所述第一溶液、第二溶液和中缅树鼩组织的体积质量比为50μL：100μL： 0.2g；

e)将步骤d)获得的溶液与第三溶液混合，冰溶60min；所述第三溶液包括钾离 子和醋酸根离子；所述第三溶液与第二溶液的体积比为75:100；

f)将步骤e)获得的溶液在12000r/min条件下离心10min；

g)将步骤f)获得的上清液在混合溶液中在12000r/min条件下抽提2～3min，重 复一次；所述混合溶液包括酚、氯仿和异戊醇；所述上清液与混合溶液的体积比为 1:1；

h)将步骤g)获得的上清液与4℃的无水乙醇混合，在-40℃放置过夜；

i)将步骤h)获得的溶液在4℃、12000r/min下离心15min～30min，用4℃乙醇 洗涤干燥。

本发明通过限定提取过程中试剂种类、试剂用量以及提取条件，提取得到的DNA 纯度较高，电泳条带无拖尾现象，且成本较低。

附图说明

图1为本发明实施例提取得到的DNA的电泳图，其中，1和2分别为实施例1和实 施例2得到的DNA的电泳条带，3为比较例1得到的DNA的电泳条带。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附表，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的 所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

a)将0.2g中缅树鼩组织在1mL匀浆液中4℃、1500r/min条件下离心10min；所 述匀浆液包括0.25mol/L蔗糖、10mmol/L Na₂EDTA、30mmol/L Tris-HCl和2.5mmol/L  CaCl₂；

b)将步骤a)获得的上清液在4℃、1500r/min条件下离心20min；

c)将步骤c)获得的沉淀在2mL匀浆液中在4℃、1500r/min条件下离心10min， 所述匀浆液包括0.25mol/L蔗糖、10mmol/L Na₂EDTA、30mmol/L Tris-HCl和 2.5mmol/L CaCl₂；

d)将步骤c)获得的沉淀与50μL第一溶液混合均匀，再与100μL第二溶液混 合后冰溶10min；所述第一溶液包括10mmol/L Tris-HCl、10mmol/L Na₂EDTA和 0.15mmol/L NaCl，pH值为8.0；所述第二溶液包括1wt％的十二烷基硫酸钠(SDS) 和0.2mmol/L NaOH；

e)将步骤d)获得的溶液与75μL第三溶液混合，冰溶60min；所述第三溶液包 括钾离子和醋酸根离子，其中，钾离子浓度优选为3mol/L，所述醋酸根离子浓度优 选为5mol/L；

f)将步骤e)获得的溶液在12000r/min条件下离心10min；

g)将步骤f)获得的上清液在等体积混合溶液中在12000r/min条件下抽提2min， 重复一次；所述混合溶液包括体积比为24:24:1的酚、氯仿和异戊醇；

h)将步骤g)获得的上清液与4℃的无水乙醇混合，在-40℃放置过夜；

i)将步骤h)获得的溶液在4℃、12000r/min下离心30min，用4℃75％的乙醇洗涤 干燥。

实施例2

a)将0.2g中缅树鼩组织在1mL匀浆液中4℃、1500r/min条件下离心10min；所 述匀浆液包括0.25mol/L蔗糖、10mmol/L Na₂EDTA、30mmol/L Tris-HCl和2.5mmol/L  CaCl₂；

b)将步骤a)获得的上清液在4℃、1500r/min条件下离心20min；

c)将步骤c)获得的沉淀在2mL匀浆液中在4℃、1500r/min条件下离心10min， 所述匀浆液包括0.25mol/L蔗糖、10mmol/L Na₂EDTA、30mmol/L Tris-HCl和 2.5mmol/L CaCl₂；

d)将步骤c)获得的沉淀与50μL第一溶液混合均匀，再与100μL第二溶液混 合后冰溶10min；所述第一溶液包括10mmol/L Tris-HCl、10mmol/L Na₂EDTA和 0.15mmol/L NaCl，pH值为8.0；所述第二溶液包括1wt％的十二烷基硫酸钠(SDS) 和0.2mmol/L NaOH；

e)将步骤d)获得的溶液与75μL第三溶液混合，冰溶60min；所述第三溶液包 括钾离子和醋酸根离子，其中，钾离子浓度优选为3mol/L，所述醋酸根离子浓度优 选为5mol/L；

f)将步骤e)获得的溶液在12000r/min条件下离心10min；

g)将步骤f)获得的上清液在等体积混合溶液中在12000r/min条件下抽提3min， 重复一次；所述混合溶液包括体积比为24:24:1的酚、氯仿和异戊醇；

h)将步骤g)获得的上清液与4℃的无水乙醇混合，在-40℃放置过夜；

i)将步骤h)获得的溶液在4℃、12000r/min下离心15min，用4℃75％的乙醇洗涤 干燥。

比较例1

将实施例1、实施例2和比较例1获得的DNA进行电泳，结果参见图1，图1为本发 明实施例提取得到的DNA的电泳图，其中，1和2分别为实施例1和实施例2得到的DNA 的电泳条带，3为比较例1得到的DNA的电泳条带。由图1可知，本发明提供的方法获 得的电泳条带无拖尾，纯度高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润 饰也应视为本发明的保护范围。